Biología Celular 7: Organización del Genoma (PDF)

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.  Coordinación: Silvia Márquez 7 Diseño y compaginación: Julio Mendez Autores: © Editorial CCC Educando Silvia Márquez Av. Warnes 2361/5 (1417) Capital Federal Viviana Sabbatino Con una tirada 500 ejemplares Andrea Lassalle Impreso en Argentina Queda hecho el deposito que previene la ley 11.723 Colaboradores: Ingrid Römer ISBN: 978-950-807-034-0. Gladys Gálvez Bernice Libedinsky Lionel Valenzuela Perez Hernán Sala Biología celular 7 : organización de genoma / Márquez, Silvia... [et al.]. - 1a ed. - Ciudad Autónoma de Buenos Aires : C.C.C Editorial Educando, 2017. 88 p. ; 22 x 17 cm. ISBN 978-950-807-034-0 1. Biología Celular. I. Márquez, Silvia, CDD 571.6 No se permite la reproduccion total o parcial de este libro, ni su almacenamiento en un sistema informatico, ni su transmision en cualquier forma Índice o por cualquier medio, electronico, mecanico, fotocopia, u otros metodos, sin el permiso previo del editor..  Presentación La presente colección de “Introducción a la Biología celular y molecular” ha sido elaborada por cada uno de los profesores coordinadores del Departamento de Ciencias Biológicas, con sus respectivos equipos docentes. Sobre la base de un grupo de trabajo interdisciplinario, con amplia experiencia en la enseñanza, en la investigación científica y educativa y, en la particular intersección entre la Escuela Secundaria y la Universidad, se genera la necesidad de brindar un material de lectura adaptado al perfil de los estudiantes que ingresan al CBC, con una mirada puesta en los conocimientos y habilidades inte- lectuales, necesarios para afrontar la demanda de las futuras carreras, en cada una de las facultades. La Biología celular y molecular contemporánea se caracteriza por atravesar un período de enor- me crecimiento tanto en los métodos, como en las técnicas y resultados que requieren de una ac-. tualización adecuada, que permita ese tránsito entre la formación recibida en la escuela secundaria y los primeros tramos del ciclo profesional. Por ello, presentamos esta segunda edición que recoge la experiencia obtenida con la edición anterior, las sugerencias de alumnos y colegas, y que ofrece la posibilidad de despertar en el alumno el interés por saber y de impulsarlo a esforzarse para lograr un aprendizaje profundo. En esta oportunidad, contamos con la invalorable colaboración de la Lic. Adriana Schnek que con mucha habilidad y profesionalismo asumió el rol de revisora y editora. También nuestro agra- decimiento a Adriana García que coordinó las ilustraciones efectuadas por Eduardo de Navarrete y David Gonzalez Márquez, que tanto ayudan a la comprensión de los distintos temas.  Parte I - NÚCLEO CELULAR Índice INTRODUCCIÓN 6 1. ORIGEN DEL NÚCLEO 7 2. ESTRUCTURA DEL NÚCLEO 8 2.1 Envoltura nuclear 8 2.2 Lámina nuclear 9 2.3 Complejo del poro nuclear (CPN) 10 2.4 Transporte a través del complejo del poro nuclear 11 3. ORGANIZACIÓN INTERNA DEL NÚCLEO 15 3.1 Matriz nuclear 15 3.2 Cromosomas y cromatina 15 3.3 Niveles de condensación de la cromatina 18 3.4 El nucléolo 21 4. EL CROMOSOMA EUCARIOTA 22. 4.1 Cariotipo humano 26 4.2 Conceptos de diploidia y haploidia 26 4.3 Determinación cromosómica del sexo 29 4.3.1 Mecanismo de la inactivación del cromosoma X 29 4.4 Euploidias y aneuploidias 32 BIBLIOGRAFÍA 34 Parte II - NATURALEZA MOLECULAR DEL GEN Y DEL GENOMA 1. GENOMA 35 2. EL PROCESO DE TRANSCRIPCIÓN 38 2.1 Transcripción en procariotas 40 2.2 Transcripción en eucariotas 41 3. EL CÓDIGO GENÉTICO 42 3.1 Excepciones a la universalidad del código y mensajes solapados 45 4. LA “MAQUINARIA” TRADUCCIONAL 46 4.1 ARNm (mensajero) 46  4.1.1 ARNm eucariota 46 4.1.2 ARNm procariota 48 4.2 ARNt (tranferencia) 49 4.3 ARNr (ribosómico) 50 4.4 Los ARN pequeños 52 5. EL PROCESO DE LA TRADUCCIÓN O SÍNTESIS PROTEICA 53 5.1 Activación de los aminoácidos o aminoacilación 53 5.2 Traducción del ARNm 55 5.2.1 Iniciación de la traducción 55 5.2.2 Elongación de la cadena polipeptídica 56 5.2.3 Terminación de la síntesis proteica 57 5.2.4 El costo energético de la síntesis proteica 58 5.3 Polirribosomas 58 5.4 Diferencias en la traducción en procariotas y eucariotas 60 6. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA 61 6.1 Regulación en procariotas. 61 6.1.1 El operón lac 61 6.1.2 El operón triptófano 64 6.2 Regulación en eucariotas 65 7. ESTABILIDAD DEL GENOMA 75 7.1 Mecanismos que introducen variaciones en el genoma: mutaciones 76 BIBLIOGRAFÍA 80 Parte I Núcleo celular Parte I - NÚCLEO CELULAR Introducción El núcleo es la estructura más destacada de la célula eucariota. De hecho, el término eucariota significa “núcleo verdadero.” En él se almacena casi todo el ADN de la célula, que constituye el genoma, base de da- tos de toda la información genética de un organismo. El núcleo es por lo tanto el depósito de la información genética de la célula y el centro de control de la expresión del material genético. Esto significa que la esencia misma de la célula eucariota es su núcleo rodeado por una envoltura de membrana, que recluye las dos activi- dades principales del genoma, replicación y transcripción del resto del metabolismo celular. El núcleo, una estructura de 6 a 8 µm, es visible al microscopio óptico, al igual que muchas de sus estruc- turas internas (Fig. 1). Está limitado por una cubierta doble, la envoltura nuclear, formada por cisternas pro- venientes del sistema de endomembranas. Esta envoltura está perforada por poros nucleares, cuyo número es mayor en las células con mayor actividad metabólica. A través de ellos, se movilizan proteínas y ARN entre el núcleo y el citosol. La membrana interna de la envoltura nuclear está recubierta por una red proteica llamada lámina nuclear, que aporta estabilidad al núcleo. La aparición de la envoltura nuclear en organismos euca- riotas posibilitó la separación espacial de los procesos genéticos principales, como la replicación del ADN y la síntesis de ARN; además el ARNm se modifica dentro del núcleo antes de ser traducido en los ribosomas. Estas modificaciones no ocurren en los procariontes, ya que al no tener envoltura, a medida que la ARN polimerasa sintetiza el ARN, simultáneamente el extremo.5’ se une al ribosoma y comienza la traducción. Dentro del núcleo, es posible reconocer zonas ocupadas por la cromatina, un complejo de ADN y proteí- nas de unión al ADN, llamadas histonas. En la mayoría de las células se distinguen dos tipos de cromatina, la eucromatina, que se tiñe débilmente, y la heterocromatina, más densa e intensamente teñida. En el núcleo se sintetiza el ARN, cuyos tipos se encuentran dispersos en diferentes localizaciones, es- pecialmente concentrados en una región más densa, el nucléolo, donde se ensamblan los ribosomas. En el nucléolo convergen regiones especializadas de la cromatina llamadas regiones organizadoras nucleolares (NOR). Cromatina Nucléolo Poros nucleares Nucleoplasma Membrana nuclear externa Espacio perinuclear Membrana nuclear Ribosomas interna Lámina nuclear Fig. 1. Esquema del núcleo interfásico. 6  Biología Celular La imagen del núcleo representada en la Fig. 1 corresponde a una célula en interfase, el período entre dos divisiones celulares, caracterizado por una intensa actividad metabólica. Durante la interfase, la célula transcribe la información genética y de esta manera se expresa (síntesis de ARNs). También en esta etapa, duplica su ADN, preparándose para la división celular. Cuando la célula se divide, la organización del núcleo cambia de manera evidente. La cromatina se compacta y se visualiza como un número de hebras separadas, llamadas cromosomas (46 en las células humanas). Al mismo tiempo, se dispersa el nucléolo y la envoltura nuclear se fragmenta. Al término de la división, estos reordenamientos estructurales se invierten y el núcleo recobra su morfología. En este Fascículo describiremos: el núcleo interfásico, las hipótesis sobre su origen, nos adentraremos en el conocimiento de cada uno de sus componentes, describiremos la comunicación e intercambio con el citosol y cómo una estructura como el núcleo puede desensamblarse y rearmarse. También desarrollaremos cómo se mantienen ordenados todos los cromosomas durante la interfase, y cuál es el papel que juegan en este proceso unas pequeñas proteínas básicas llamadas histonas. Por último, describiremos los cromosomas y en qué consiste el estudio de cariotipo y su valor diagnóstico. 1. Origen del núcleo. El origen del núcleo es un tema controversial, que dio pie a más de una explicación. La más aceptada, indica que éste se formó por la invaginación de la membrana plasmática al igual que los orgánulos membra- nosos del sistema de endomembranas (Fig. 2), mientras que mitocondrias y cloroplastos se originaron por un mecanismo conocido como endosimbiosis seriada, propuesta por la microbióloga estadounidense Lynn Margulis (1938-2011). Margulis explica también el origen del núcleo a través de su teoría de la endosimbiosis seriada, según la cual el núcleo es la primera adquisición en una serie de eventos sucesivos. La fusión de dos bacterias (posible- mente una arqueofermentadora y una espiroqueta) dio origen al primer eucarionte unicelular y ancestro único de todos los pluricelulares. En esta primera célula nucleada el ADN quedó confinado en un espacio separado por una membrana del resto de la célula. Núcleo Poro nuclear Ribosomas ADN unidos a la Polirribosomas Retículo membrana endoplasmático Procariota ancestral Eucariota unicelular ancestral Fig. 2. Esquema hipotético del origen del núcleo y del sistema de endomembranas por invaginación de la membrana celular. 7 Parte I Núcleo celular 2. Estructura del núcleo 2.1 Envoltura nuclear La envoltura nuclear (EN) es una doble membrana que encierra el genoma nuclear en las células eu- cariotas. Es un derivado del sistema de endomembranas, que contiene un gran número de proteínas propias. Estas proteínas participan en la organización de la cromatina y la regulación de la expresión genética. Aunque la membrana nuclear hace posible la expresión de los genes, al confinarlos y protegerlos de las enzimas, se convierte en un obstáculo para la división celular. Sin embargo, la membrana nuclear se desensambla al inicio de la división y se reorganiza al final de dicho proceso, lo cual posibilita la interacción entre el huso mitótico y la cromatina. La microscopía electrónica eviden- ció que la EN es doble, continuándose con el retículo endoplasmático (Fig. 3). Esta envoltura está formada por dos membranas concéntricas interrumpidas por estructuras proteicas denominadas complejos de poro nuclear (CPN) y por la lámina nuclear, estructura proteica densa, unida a la membrana interna de. la EN. Las membranas delimitan un espa- cio de 20 a 40 nm, el espacio o cisterna perinuclear. La membrana externa, en contacto con el citoplasma, tiene ribo- Fig. 3. Microfotografía electrónica de la envoltura nuclear. somas adheridos, que sintetizan las pro- teínas que se vuelcan al espacio perinu- clear. El espacio perinuclear se continúa con el lumen del RE. Varias proteínas integrales de esta membrana se unen a la actina y a filamentos intermedios de citoesqueleto, anclando el núcleo dentro de la célula y al mismo tiempo proporcionando un mecanismo para los movimientos nucleares. Tanto la membrana externa como la interna presentan proteínas específicas que no se encuentran en los otros componentes del sistema de endomembranas (Fig. 4 y Fig. 5). Estas pueden ser agrupadas de acuerdo a su localización en: 1) proteínas del poro nuclear o nucleoporinas, 2) proteínas integrales de la membrana externa, 3) proteínas integrales de la membrana interna, 4) proteínas de la lámina nuclear. 8  Biología Celular Citoplasma Proteína de anclaje a 1 la membrana nuclear Poro nuclear Espacio perinuclear 3 Lámina 4 Cromatina Núcleo 50 nm Fig. 4. Esquema de proteínas de la envoltura nuclear: están representados el grupo 1 de las nucleoporinas, el grupo 3 de las proteínas de la membrana interna de la envoltu- ra nuclear y el grupo 4, de la lámina nuclear.. El primer grupo está representado por las nucleoporinas, que forman el 70% de los poros nucleares. El segundo grupo está conformado por las proteínas integrales de la membrana externa de la EN, como la nes- prina, que permite la interacción del núcleo con los filamentos de actina, manteniendo la posición del núcleo dentro de la célula. Un tercer grupo está constituido por las proteínas integrales de la membrana interna de la EN, que anclan la lámina nuclear a la membrana interna. Las proteínas integrales de la membrana externa e interna establecen puentes cruzados en el espacio perinuclear. El último grupo de proteínas de la EN es el que constituye la lámina nuclear. 2.2 Lámina nuclear La lámina nuclear soporta las estructuras del núcleo. Es una malla densa y delgada de fibras que recubre la superficie interna de la EN proporcionando resistencia mecánica al núcleo, lo cual resulta crucial para su estabilidad, el espaciamiento de los CPN y la organización de la cromatina. La lámina nuclear es de aproximadamente 10-40 nm de espesor y se construye a partir de filamentos intermedios llamados laminas1 de tipo A (lamina A y lamina C) y de tipo B (lamina B). Ambos tipos son codificados por diferentes genes. Las laminas A y C contactan con la cromatina; la lamina B, en cambio, interacciona con la membrana nuclear interna. La fosforilación de las laminas provoca el desensamble de la lámina nuclear y la desintegración de la EN al inicio de la división celular, cambio que permite el encuentro de los cromosomas con los microtúbulos. Las mutaciones del gen de la lamina tipo A es responsable de un grupo de enfermedades llamadas lami- nopatías que afectan principalmente a los tejidos de origen mesodérmico. 1 Se denominan laminas (sin acentuación) a los filamentos intermedios que forman la lámina nuclear. 9 Parte I Núcleo celular Laminopatías Las alteraciones hereditarias de las laminas nucleares están vinculadas a más de una docena de enfermedades en humanos, conocidas como laminopatías. Las laminopatías incluyen varias patolo- gías relacionados con la atrofia muscular severa o el envejecimiento prematuro. Por ejemplo, una mutación de una sola base nitrogenada en la secuencia del gen de la pre-lamina A o progerina, es responsable de la Progeria o síndrome de Hutchinson-Gilford, enfermedad sistémica en la que los síntomas de la vejez, tales como la pérdida de cabello, la degeneración de la piel, músculo y huesos, se suman a los problemas cardiovasculares que causan la muerte en el 75% de los casos antes de los 15 años. Las células de los individuos que la padecen presentan alteraciones graves en la forma del núcleo, aunque no está claro cómo estos cambios nucleares se relacionan con los síntomas de la en- fermedad. Otras laminopatías son localizadas, como la distrofia muscular de Emery, la lipodistrofia y leucodistrofia autosómica dominante. 2.3 Complejo del poro nuclear (CPN) Una de las características más distintivas de la envoltura nuclear es la presencia de canales especializados llamados complejos del poro nuclear. Cada poro es un pequeño canal cilíndrico que se extiende a través de ambas membranas de la envoltura nuclear, proporcionando así continuidad entre el citosol y el nucleoplasma o jugo nuclear, nombre con el que se conoce el contenido amorfo del núcleo. El número de CPN depende del tipo de célula y de su actividad. Un núcleo típico tiene unos 3.000 a 4.000 poros, o alrededor de 10-20 poros/ µm2. En cada poro, las membranas interior y exterior de la envoltura nuclear se fusionan, formando un canal recubierto con una intrincada estructura de un conjunto.de proteínas llamadas nucleoporinas (Fig. 5). En micrografías electrónicas, la característica más llamativa del complejo del poro es su simetría octogonal. El CPN en su conjunto tiene una forma de rueda acostada, dentro de la envoltura nuclear. Dos anillos paralelos formados por ocho subunidades describen el borde de la rueda. Ocho radios se extienden desde los anillos al centro de la rueda, demarcando un canal central. Este canal central delimitado se denomina transportador, por participar en el movimiento de macromoléculas a través del CPN. A partir de los anillos, se extienden fibras hacia el citosol, las fibras citoplasmáticas, como hacia el nucleoplasma. Estas últimas convergen formando una canasta o cesta nuclear. Filamento Anillo externo Columna Proteína Proteína de anclaje radial Anillo interno Nucleoporina Filamento Canasta nuclear Fig. 5. Esquema del complejo del poro nuclear. 10  Biología Celular 2.4 Transporte a través del complejo del poro nuclear Las moléculas entran al núcleo y salen exclusivamente a través de los complejos del poro nuclear. Pro- bablemente, la presencia de una barrera que impide salir a los cromosomas y evita la entrada de organelas como las mitocondrias, ribosomas, lisosomas, y los microtúbulos es favorable para toda la actividad celular. Por ejemplo, la envoltura nuclear protege los ARN recién sintetizados evitando la degradación enzimática antes de que hayan completado su procesamiento. La presencia de la envoltura nuclear implica que todas las enzimas y otras proteínas que participan en la replicación y transcripción del ADN en el núcleo son importadas desde el citoplasma, y todas las moléculas de ARN y subunidades ribosómicas necesarias para la síntesis de proteínas en el citoplasma, se exportan desde el núcleo (Fig. 6). Para conocer cuánto tráfico tiene lugar a través de los poros nucleares, consideremos el flujo de subu- nidades ribosómicas del núcleo al citoplasma. Los ribosomas están parcialmente ensamblados en el núcleo, como dos subunidades independientes, cada una de las cuales es un complejo de ARN y proteínas. Estas subunidades se transportan al citoplasma y, cuando es necesaria la síntesis de ciertas proteínas, se combinan formando ribosomas funcionales. Una célula activa de mamífero fácilmente puede sintetizar 20.000 subuni- dades ribosómicas por minuto. Dicha célula tiene alrededor de 3.000 a 4.000 poros nucleares; así las subuni- dades ribosómicas deben ser transportadas al citosol a una velocidad de alrededor de 5 a 6 subunidades por minuto por poro. El tráfico en la dirección opuesta es aún más intenso. Cuando los cromosomas se replican, se requieren histonas en el núcleo. La tasa de importación de histonas es aproximadamente de 100 moléculas por minuto por poro. Además del intenso tráfico macromolecular, por los poros difunden iones y moléculas pequeñas. La tasa de entrada en el núcleo es inversamente proporcional al diámetro de la molécula a transportar. Las moléculas mayores de 10 nm de diámetro no ingresan pasivamente. Las moléculas menores se mueven libremente por los canales acuosos que rodean externamente al canal central. Una proteína globular con un peso molecular de 20.000 Da se equilibra en sólo unos pocos minutos. entre el citoplasma y núcleo, pero la mayoría de las proteínas, de 60.000 Da o más son apenas capaces de penetrar en el núcleo libremente. Los canales acuosos son permeables a los iones y moléculas pequeñas como los ribo y desoxirribonucleótidos requeridos para la síntesis de ARN y ADN, pero impiden el tránsito de moléculas de peso molecular mayor a 20.000 Da. Muchas proteínas nucleares son grandes, como las enzimas implicadas en la síntesis de ADN y ARN. Es- tas últimas tienen subunidades con pesos moleculares de más de 100.000 Da, demasiado grandes para circular a través de los canales acuosos de 9 nm que rodean al transportador. Las moléculas de ARN mensajero dejan el núcleo unidas a proteínas, en forma de complejos de “ribonucleoproteína”. Las subunidades ribosómicas también deben ser exportadas al citoplasma luego de ser ensambladas en el núcleo. Un importante cuerpo de evidencia sugiere que las macromoléculas y las subunidades ribosómicas son transportadas activamente (con gasto de energía) a través del canal central del CPN, como parte de un proceso selectivo. El transporte activo a través de los poros nucleares es entonces, un proceso selectivo que requiere de la participación de tres tipos de proteínas: las carioferinas, la GTPasa Ran y las proteínas regulatorias. Mientras que las carioferinas y Ran se movilizan a través del poro nuclear, las proteínas regulatorias Ran-GEF y Ran– GAP tienen una distribución asimétrica entre el núcleo y el citoplasma. Las carioferinas son los receptores para las moléculas a transportar. De acuerdo a la dirección en la que transportan la carga, se llaman importinas o exportinas. La GTPasa Ran es una pequeña proteína G. Al igual que otras proteínas G, puede tomar dos confor- maciones alternativas, unida a GTP o unida a GDP. Estas conformaciones determinarán la dirección del transporte. 11 Parte I Núcleo celular Transcripción y Procesamiento de ARNs Replicación Núcleo ADN Subunidades ribosomales ARNr ARNm ARNt. Proteínas para la transcripción y procesamiento ARNt Polipéptido de ARNs Proteínas Proteínas de ribosomales duplicación de ADN e histonas ARNm Ribosoma Citoplasma Proteína Síntesis de proteínas Fig. 6. Tráfico núcleo-citoplasma en relación a las funciones del núcleo. 12  Biología Celular Un mecanismo de transporte singular El mecanismo molecular subyacente en el transporte entre el núcleo/citoplasma y viceversa se comprende mejor en el caso de proteínas que ingresan activamente al núcleo. Estas proteínas poseen una o más señales de localización nuclear (NLS, acrónimo de nuclear localization signal). La NLS está formada por una secuencia de 8-30 aminoácidos de longitud y contiene a menudo prolina, así como los aminoácidos básicos lisina y arginina. Este es otro de los muchos ejemplos en los que una corta secuencia de aminoácidos orienta una molécula o una partícula a un sitio celular específico. Las proteínas con NSL forman un complejo con la importina. El complejo importina/carga con NSL atraviesa el canal central del CPN. El complejo, al tomar contacto con las repeticiones FG2 de las nucleoporinas, dilata el canal central facilitando el ingreso al núcleo. Al llegar al núcleo, la molé- cula de importina se asocia con Ran-GTP y se libera la proteína importada. El Ran-GTP unido a la importina es transportado de regreso al citoplasma, donde la importina se libera previa hidrólisis del Ran-GTP a Ran-GDP. La exportación de macromoléculas fuera del núcleo opera por mecanismos similares. La princi- pal diferencia es que el transporte fuera del núcleo se realiza en el caso de las moléculas de ARNt y otros ARN, que se sintetizan en el núcleo. Para exportar el ARN del núcleo al citoplasma éste debe unirse a proteínas con señales de exportación (NES), formando ribonucleoproteínas. Las RNP son reconocidas por exportinas, formando un complejo con Ran-GTP. Este complejo atraviesa el poro. En la cara citoplasmática del poro, se hidroliza el GTP a GDP y se libera la RNP, mientras Ran-GDP regresa al núcleo ¿Qué mueve a importinas y exportinas en direcciones diferentes a través del CPN?. La diferencia en la dirección entre im- Importación portina y exportina a través del canal cen- Ran GDP tral depende de la interacción de éstas con Ran. Ran se une a GTP en el núcleo y este Ran Importina GAP sólo puede ser hidrolizado en el citosol. β Ran GTP La unión de Ran a GTP dentro del núcleo α Carga se debe a la actividad de una proteína re- NLS guladora unida a la cromatina, el factor Citoplasma intercambiador de nucleótidos de guanina (GEF), que promueve el intercambio de Núcleo GDP por GTP. En contraste, la proteína que β α Ran GTP promueve la hidrólisis del GTP, la proteína Ran GTP NES Carga reguladora Ran-GAP está unida a las repe- Exportina ticiones FG de las nucleoporinas en la cara α β citosólica del CPN. La acción de estas dos Ran GTP proteínas (Ran-GEF y Ran-GAP) mantiene Exportación el gradiente de las dos formas alternativas de Ran entre el núcleo y el citoplasma. Es Mecanismo de transporte nuclear controlado por decir, Ran GTP está en alta concentración dentro del núcleo y por lo tanto tiende a sa- la proteína Ran-GTP. lir y Ran-GDP, está en alta concentración 2 Repeticiones FG: secuencia rica en fenilalanina y glicina que anclan las carioferinas a las nucleoporinas dirigiéndolas hacia el poro. 13 Parte I Núcleo celular en el citoplasma y tiende a ingresar. Por otra parte, las exportinas tienen afinidad por Ran-GTP y las importinas por Ran-GDP. De esta forma Ran GTP viaja con las exportinas y su carga hacia el citosol siguiendo su gradiente y Ran-GDP se desplaza libremente hacia el núcleo en función de su propio gradiente. Exportación de ARNm La síntesis y procesamiento de Pi ARNm tiene lugar de manera orde- Ran GDP nada en el núcleo. De los pre-ARNm Ran-GAP que se sintetizan en el núcleo, sólo Citoplasma una pequeña fracción es el ARN ma- Filamento duro, pues los intrones eliminados son mucho más largos que los exones, siendo rápidamente degradados en el núcleo. La diferenciación entre el Núcleo GDP ARN maduro y las secuencias intróni- Ran-GEF cas a eliminar, se da por un recambio Ran GTP ordenado de proteínas asociadas. A GTP medida que el ARNm madura, pierde Cromatina proteínas asociadas a los pre-ARN y adquiere otras. La ausencia de RN- Distribución asimétrica de las proteínas regula- Ppn y la presencia del complejo de doras de Ran: Ran-GEF, unida a la cromatina y unión al CAP (denominado CBC), los Ran-GAP, localizada en la cara citoplasmática. complejos de unión a exones (EJC), del CPN. La compartimentalización de estas pro- y las proteínas de unión a cola poli teínas reguladoras determina el gradiente de Ran A, señalan el fin de la maduración. El que dirige el transporte a través del CPN. ARNm maduro es reconocido por un complejo proteico, el receptor de ex- Proteínas nucleares Núcleo Factores de iniciación CBC RNP EJC CBC 5' cap 5' AA 5' 5' AA A AAA Traducción AA AA AA AAA A A Proteínas AAAAA Receptor de de unión exportación a poli A Proteínas nuclear nucleares Citoplasma Mecanismo de exportación de ARNm. portación, que media el pasaje activo a través del poro nuclear. Cuando el ARNm ingresa al citosol, el receptor se disocia y es importado al núcleo. Los factores de iniciación de la síntesis proteica reco- nocen el complejo de unión al CAP, el cual se disocia. Si no existen errores en la codificación u otras alteraciones, los EJC, conforme se va traduciendo el ARNm, se disocian de éste por interacciones con el ribosoma hasta que finalmente se ha traducido todo el mensajero. 14  Biología Celular Resumiendo, la envoltura nuclear cumple un papel fundamental en la protección de los componentes del genoma frente a los componentes del citoplasma, mediando el tráfico y la circulación de proteínas y ARN entre el núcleo y el citosol, y además es una membrana especializada que proporciona sitios de anclaje para la cromatina y para el citoesqueleto. A continuación, en el Cuadro 1 se resumen las moléculas que entran y salen a través del CPN por trans- porte selectivo. Carga a transportar Entra Sale Histonas x Factores de transcripción x x Kinasas/Proteínas regulatorias x x ARNm x ARNt x Proteínas ribosómicas x Subunidades ribosómicas x Cuadro 1. Tráfico selectivo a través del CPN. 3. Organización interna del núcleo La envoltura nuclear encierra la matriz nuclear, la cromatina y el nucléolo.. 3.1 Matriz nuclear Aproximadamente el 80-90% de los componentes del núcleo son fibras de cromatina, por lo que se podría esperar que al eliminar experimentalmente la cromatina, el núcleo colapse, si su forma dependiera exclusiva- mente de ella. Sin embargo, a principios de 1970, se encontró que una red fibrosa insoluble retiene la forma general del núcleo y permanece estable después de eliminar experimentalmente casi por completo la cromati- na. Esta red, denominada matriz nuclear, ayuda a mantener la forma del núcleo, proporcionando un esqueleto sobre el que se organizan las fibras de cromatina 3.2 Cromosomas y cromatina. Organización de la cromatina dentro del núcleo En las células eucariotas el material genético, constituido por ADN, se encuentra confinado dentro del nú- cleo celular. Este ADN no está aislado, sino asociado a distintos tipos de proteínas. En una célula en interfase, este conjunto de ADN y proteínas se denomina cromatina. La mayor parte de las proteínas asociadas al ADN, y que junto al mismo constituyen la cromatina, se denominan histonas. También se encuentran otro tipo de proteínas, las proteínas no histónicas, cuya unión al ADN suele ser pasajera y cuya función principal consiste en regular la transcripción, la replicación y la reparación del ADN. Dentro de este grupo podemos nombrar los factores de transcripción que regulan la tasa de síntesis del ARN y proteínas; esto significa que regulan la expresión del ADN. Las histonas participan de la condensación de la cromatina y por lo tanto también influyen, como veremos más adelante, en la expresión del ADN. Cada molécula de ADN, juntamente con sus proteínas asociadas, conforma un cromosoma. El conjunto de todos los cromosomas interfásicos constituye la cromatina. La interfase consta de tres períodos: G1, S y 15 Parte I Núcleo celular G2. La cantidad de ADN presente en el núcleo se duplica en el período S de la interfase. En un núcleo in- terfásico de una célula humana podemos contar 46 cromosomas. Cada uno de ellos contiene en el período G1 (antes de la replicación), una única molécula de ADN y dos moléculas de ADN idénticas (las cromátides hermanas) después del período S, de síntesis de ADN. ¿Todos los seres vivos poseen el mismo número de cromosomas? Cada especie tiene un número cromosómico característico: Homo sapiens 46 Chimpancé 48 Perro 78 Mosca 12 Maíz 20 Trigo 46 Escherichia coli 1. Fig. 7. Microfotografía electrónica Fig. 8. Microfotografía electrónica de electrónica de un hepatocito. un neutrófilo. (a) eucromatina; (b) heterocromatina. (a) eucromatina; (b) heterocromatina Durante la interfase, las fibras de cromatina de una célula tienden a estar extendidas y dispersas por todo el núcleo. Por lo tanto, podríamos suponer que las asas de cromatina correspondientes a cada cromosoma individual están distribuidas al azar y mezcladas dentro del núcleo. Sin embargo, la cromatina de cada cro- mosoma tiene una ubicación propia y discreta en territorios cromosómicos. Las regiones no ocupadas por cromosomas se denominan canales o dominios intercromosómicos. En los canales se ubican factores de transcripción, de maduración del ARN, de replicación y reparación del ADN, e incluso la cola poli A. Las posiciones de los territorios y canales varían de una célula a otra de un mismo individuo, cambiando a lo largo del ciclo celular, lo que refleja los cambios en la actividad de los diferentes cromosomas. La membrana interna de la EN ayuda a organizar la cromatina en los sitios que están estrechamente asociados con los poros nucleares. Si observamos un núcleo celular en interfase al microscopio óptico (MO) 16  Biología Celular o electrónico (ME) podemos distinguir zonas más claras y zonas más oscuras correspondientes a dos tipos fácilmente distinguibles de cromatina: la heterocromatina o cromatina condensada, ubicada en la periferia del núcleo y la eucromatina o cromatina laxa, de localización central (Fig. 7; Fig. 8). Si el núcleo celular se incuba con nucleasas, enzimas que digieren el ADN, las secuencias que primero se digieren son las que portan los genes que se expresan en la célula, lo que corrobora que la expresión de los genes depende del estado de condensación de la cromatina: a menor condensación, mayor expresión. La eucromatina por estar menos condensada, presenta los genes activos. La heterocromatina varía de una célula a otra, pero en promedio representa el 10% del total y corresponde a la cromatina con mayor condensación. La mayor parte de este 10% se denomina heterocromatina cons- titutiva, una forma altamente condensada en prácticamente todas las células. El ADN de la heterocromatina constitutiva consta de secuencias de ADN repetidas que no presentan genes (es decir, son secuencias cortas que se repiten en tándem y no se transcriben). Dos grandes regiones cromosómicas compuestas por heterocro- matina constitutiva son los centrómeros y los telómeros. En muchos casos, el ADN telomérico localizado en los extremos de los cromosomas se fija a la envoltura nuclea. Otro tipo de heterocromatina es la heterocromatina facultativa. En contraste con la heterocromatina constitutiva, la heterocromatina facultativa depende de las actividades llevadas a cabo por cada célula. Este tipo de cromatina difiere de un tejido a otro e incluso puede variar dentro de una célula. La heterocromatina facultativa representa a las regiones cromosómicas que se han inactivado o silenciado en un tipo específico de célula. La formación de heterocromatina facultativa sería un medio importante de inactivación de bloques enteros de información genética durante el desarrollo embrionario, relacionada con la expresión diferencial de genes en las distintas células. Un caso especial de heterocromatina facultativa es el corpúsculo de Barr. Éste se encuentra solo en las hembras y corresponde a uno de los cromosomas X (cromosoma sexual) que se condensa totalmente. Las regiones del ADN que se encuentran como heterocromatina tienden a estar metiladas en zonas del ADN ricas en CG. En contraposición, la eucromatina. presenta un menor porcentaje de ADN metilado y tiene sus histonas acetiladas. Esto se debe a que los acetilos bloquean las cargas positivas de las histonas debili- tando las uniones iónicas entre el ADN y las histonas. En consecuencia, el ADN se separa de estas proteínas lo cual permite un mejor acceso a los genes para su transcripción. Por eso se suele decir que la eucromatina acetilada es transcripcionalmente activa. Tipo de cromatina Estado físico Cambio químico Genes Replicación Eucromatina Laxa Acetilada Activos Fase S temprana Silentes o Heterocromatina Condensada Metilada Fase S tardía inactivos Cuadro 2. Características de la cromatina. En la actualidad, se considera que la metilación de genes es un importante mecanismo de represión de los mismos con el cual muchos procesos patológicos están relacionados. Durante la embriogénesis, el proceso de metilación es sumamente activo. No debemos olvidar que todas las células del cuerpo contienen el mismo tipo de ADN, los mismos cromosomas y por lo tanto los mismos genes. Por ende, cada célula, cada tejido y cada órgano será distinto del resto, ya que expresará distintos ge- nes. ¿Cómo ocurre este proceso? Por medio de la metilación diferencial de genes durante la embriogénesis, o sea durante la diferenciación celular. 17 Parte I Núcleo celular Para pensar: Podemos diferenciar actualmente distintos individuos entre sí por medio del análisis de su ADN. Para eso este ADN se corta en segmentos cortos y se estudian las secuencias de nucleótidos que presenten grandes variaciones de un individuo a otro. Esto se denomina estudio de huellas genéticas. En este estudio se extrae ADN de células nucleadas de las personas a examinar y se comparan estas secuencias variables entre sí. ¿Daría lo mismo extraer y estudiar el ADN de cualquier célula nuclea- da de un mismo individuo? ¿O habría que hacerlo de alguna célula en especial? Y si en lugar de estudiar el ADN, se estudiara el ARN y/o las proteínas, ¿se obtendrían los mismos ARN y las mismas proteínas independientemente de la célula estudiada? 3.3 Niveles de condensación de la cromatina La condensación de la cromatina permite confinar al ADN dentro de núcleo. La cromatina humana no constituye, como vimos antes, una única pieza sino que está subdividida en 46 segmentos lineales de ADN que corresponden a los distintos cromosomas. Durante la mayor parte de la vida de la célula, los cromosomas son demasiado largos para ser observados al microscopio como unidades independientes, por lo tanto podrán visualizarse en el período de división celular, cuando alcancen su máximo grado de condensación. La longitud total de las 46 moléculas de ADN contenidas en cada uno de los núcleos celulares puede alcanzar los 2 metros (el cromosoma de mayor longitud puede medir hasta 8,5 cm y rondar los 250 x 106 pares de nucleótidos). Pero el diámetro de cada núcleo no supera los 10 x 10-6 m. Las moléculas de ADN y, en consecuencia la cromatina, están en forma compacta dentro. de cada núcleo. Las histonas participan en la compactación de la cromatina. H2A Las histonas son proteínas básicas, carga- das positivamente, y por esta razón se unen es- trechamente a través de uniones iónicas a las H4 H2B cargas negativas de los fosfatos presentes en el ADN. H3 Cuando el cromosoma en interfase se es- H2A parce artificialme te sobre agua, tiene la apa- H2B H2B riencia de un collar de perlas. Las perlas son los nucleosomas, las unidades de enrollamiento de H3 H3 H2A la cromatina. Los nucleosomas están formados por un H4 centro o “core” de histonas. Dicho centro H4 posee dos copias de cada una de las siguientes Fig. 9. Núcleo o “core” de 8 histonas, que conforman el histonas: H2A; H2B; H3 y H4 (Fig. 9). nucleosoma y alrededor del cual se enrolla el ADN. Alrededor del centro de histonas, 146 pa- res de bases nitrogenadas del ADN se enro- llan en dos vueltas (Fig. 10). La unión de las histonas al ADN no depende de una secuencia particular de nucleótidos, sino de la secuencia de aminoácidos de la histona. Las histonas son unas de las moléculas más conservadas durante el transcurso de la evolución. La histona H4 en el ternero difiere de la H4 de la planta de poroto en sólo 2 residuos de aminoácidos de una cadena de 102. Alrededor de 60 pares de bases de ADN unen un nucleosoma con el próximo. Cada región de unión es el ADN espaciador o linker. Esta estructura se conoce como fibra de 10 nm, siendo el primer grado de com- pactación de la cromatina (Fig. 11). 18  Biología Celular Una quinta histona, la H1, también Core de Nucleosoma llamada histona ligadora, permite com- histonas pactar este sistema de nucleosomas y llegar al siguiente nivel de organización ADN espaciador de la cromatina, la fibra de 30 nm. La o linker estructura de esta fibra aún no se ha po- dido determinar con certeza. Existen dos Histona H1 modelos teóricos: el del solenoide y el modelo del zig-zag (Fig. 11 y Fig. 12). Fig. 10. La histona H1 promueve la condensación de la cromatina. (a) (b). Fig. 11. (a) fibra de 10 nm o collar de perlas; (b) fibra de 30nm. La mayor parte de la eucromatina de los núcleos interfásicos parece presentarse en forma de estas fibras de 30 nm, organizadas en grandes lazos, bucles o asas (ver Fig. 13). (a) 30 nm (b) 30 nm Fig. 12. Distintos modelos para la fibra de 30 nm: (a) modelo del solenoide; (b) modelo del zig-zag. El nivel de organización en lazos o bucles se estabiliza debido a la unión con proteínas no histónicas que conforman la matriz nuclear. Cada bucle de cromatina representa un dominio funcional o unidad de repli- cación. Estos dominios contienen alrededor de 100.000 pares de bases, suficientes para albergar varios genes de tamaño promedio. Sin embargo algunos genes aparentemente podrían abarcar más de un dominio. Cada cromosoma puede estar conformado por 100 o más dominios. Durante la división celular (mitosis o meiosis), los cromosomas se condensan y de ese modo son distri- buidos en las células hijas. Los lazos de fibras de cromatina de 30 nm comienzan a plegarse sobre sí mis- 19 Parte I Núcleo celular Bucle o asa mos ( Fig. 14) y llegan a su mayor de cromatina grado de condensación en la me- tafase de la división celular. El ADN se ha condensado cerca de 10.000 veces. Este proceso se re- laciona con la fosforilación de las histonas H1 y de otras proteínas Secuencias SAR/MAR relacionadas. En este momento, la Andamiaje (scaffold) matriz nuclear se pliega sobre sí misma a modo de acordeón. La morfología de los cromo- Proteínas de la matriz nuclear Bucle superenrollado somas se describe a partir de la (Topoisomerasa II) observación de los cromosomas Fig. 13. Condensación de la cromatina: formación de bucles o asas metafásicos al microscopio óp- (300nm). tico. Las distintas técnicas para teñir los cromosomas evidencian patrones de bandas característicos de cada cromosoma, relacionados con zonas más ricas en CG o en AT. También se puede observar, por medio de la microscopía, que la matriz nuclear se encuentra más plegada en las zonas heterocromáticas. 2 nm (a) ADN. 10 nm (b) Cuentas de collar 30 nm (c) Solenoide 300 nm (d) Asa 700 nm (e) Espiral 1400 nm (f) Cromosoma Fig. 14. Niveles de condensación de la cromatina. 20  Biología Celular 3.4 El nucléolo En el nucléolo tienen lugar la síntesis y procesamiento de ARNr (ARN ribosómico) y el ensamblado de las subunidades ribosómicas. Además, se considera que el nucléolo desempeña un importante papel en la regulación del ciclo celular. El nucléolo es generalmente esférico, mide varios micrómetros de diámetro, y es fácilmente visible al MO. El núcleo humano típico tiene un solo gran nucléolo, formado por bucles de cromatina derivada de diez cromosomas separados: los pares 13, 14, 15, 21 y 22. Todos estos cromosomas son acrocéntricos y presentan constricciones secundarias denominadas organizadores nucleolares (NOR), formadas por secuencias que codifican ARNr. El nucléolo aparece como una estructura simple carente de componente membranoso, en la que se dife- rencia, un centro fibrilar formado por el ADN de los organizadores nucleolares, rodeado por un componente fibrilar denso, de ADN más el ARNr naciente que se está transcribiendo por la ARN pol I y un componente granular periférico (Fig. 15). Los gránulos son moléculas de ARNr que se unen con las proteínas, impor- tadas desde el citoplasma, y forman subunidades ribosómicas. Las mismas son posteriormente exportadas al citoplasma a través de los complejos de poro nuclear. Componente Centro Componente Cromatina "NOR" fibrilar fibrilar Transcripción fibrilar denso denso Centro fibrilar Procesamiento Componente fibrilar denso Maduración Componente granular Componente granular Nucléolo Liberación. Núcleo Envoltura Transporte Citosol nuclear Núcleo Ribosomas Célula Fig. 15. A la izquierda se representan las regiones del nucléolo, y a continuación su correlato funcional A la derecha se observa una microfotografía electrónica: en (a) la cromatina “NOR”, en (b) el componente fibrilar denso y en (c) el componente granular. El tamaño del nucléolo se correlaciona con su nivel de actividad. En las células que tienen una alta tasa de síntesis de proteínas y por lo tanto un requerimiento de muchos ribosomas, los nucléolos tienden a ser grandes y pueden representar el 20-25% del volumen total del núcleo. En células menos activas, los nucléolos son pequeños. A medida que la célula se aproxima a la división, se produce la condensación de la cromatina en cromo- somas compactos, junto con la desaparición de la EN y los nucléolos. Cuando finaliza la división celular, la cromatina se desenrolla, los bucles de NORs se observan nueva- mente, y se reanuda la síntesis de ARNr. En células humanas, este es el único momento en que los diez NORs del núcleo diploide son evidentes al microscopio. Cuando se reinicia la síntesis de ARNr, diez nucléolos pequeños se hacen visibles, cada uno cerca de la punta de cada uno de diez cromosomas. A medida que estos nucléolos se agrandan, rápidamente se funden en un único nucléolo grande. El ADN de los NOR lleva múltiples copias de genes ARNr. Estos genes múltiples de ARNr son un ejem- plo de ADN repetitivo presente en todos los genomas. El número de copias de los genes de ARNr varía en gran medida de una especie a otra, pero las células de los animales en general, contienen cientos de copias y las células de las plantas a menudo miles de copias. Las copias múltiples se agrupan en una o más NORs, que pueden residir en más de un cromosoma. En cada NOR, las copias de genes múltiples están dispuestas en tándem. Un nucléolo único puede contener ARNr 21 Parte I Núcleo celular de genes derivados de más de una NOR. En el genoma humano existen alrededor de 200 copias del gen que codifica ARNr de origen nucleolar. Estos genes que promedian los 10.000 nucleótidos se localizan en tándem, separados por ADN espaciador y asociados a la ARN polimerasa I, de donde parten perpendicularmente los ARNr nacientes, lo que da a todo el complejo la apariencia característica de un árbol de navidad (Fig. 16). Cada gen produce un transcripto llamado ARNr 45S que será luego procesado en distintos ARNr, a los que se suma un tipo de ARNr extranucleolar. Inicio ARNr Gen nucleolar Fin ADN espaciador Inicio Fig. 16. Microfotografía electrónica de los genes nucleolares durante la transcripción. Observe como la longitud de los transcriptos primarios (ARNr) aumenta a medida que nos alejamos del punto de inicio.. 4. El cromosoma eucariota A diferencia de los cromosomas procarion- Centrómero tes, que son circulares, los cromosomas euca- riotas consisten en moléculas lineales de ADN. Antes de comenzar la división celular (en la etapa G1 de la interfase) cada cromosoma euca- riota está constituido por una molécula de ADN de alrededor de 150 millones de nucleótidos (Fig. 17 a). La célula duplica su ADN durante la etapa S, en consecuencia, al final de esta eta- pa, el cromosoma estará formado por dos molé- (a) (b) (c) culas de ADN o dos cromátides hermanas (Fig. 17 b y c). Estas cromátides permanecen unidas Fig. 17. (a) cromosoma eucariota antes de la duplica- hasta la anafase, momento en el que migran a ción; (b) cromosoma duplicado formado por 2 cromá- cada uno de los polos. Los cromosomas meta- tides; (c) Microfotografía electrónica del cromosoma fásicos están siempre duplicados. metafásico duplicado. Al inicio de la división celular, los cromo- somas duplicados se condensan en estructuras que pueden teñirse fácilmente (de ahí el nombre de cromosomas: chroma = color y soma = cuerpo) y ob- servarse al microscopio óptico. La condensación es tal que estos cromosomas miden 10.000 veces menos que la molécula de ADN que contiene. Al microscopio óptico, los cromosomas duplicados aparentan estar unidos por medio de sus centrómeros. Mientras permanecen unidos, cada molécula de ADN que conforma 22  Biología Celular este cromosoma duplicado (junto a sus proteínas accesorias), se denomina cromátide hermana. Al finalizar la división celular las cromátidas hermanas se separarán y pasarán a constituir un cromosoma independiente en las células hijas. Por lo tanto, luego de la duplicación del ADN y antes de la separación de las cromátidas hermanas, una célula humana presentará transitoriamente 46 cromosomas duplicados, lo que equivale a 92 moléculas de ADN o 92 cromátides. Luego de finalizar la división celular, cada célula hija, en etapa G1, presentará 46 cromosomas simples, lo que equivale a 46 moléculas de ADN o 46 cromátides. Los cromosomas presentan regiones codificantes, denominadas genes, cuyo ADN lleva una secuencia ca- racterística de nucleótidos con información para la síntesis de proteínas y ARN. Sin embargo, la mayor parte del ADN del cromosoma corresponde a zonas denominadas no codificantes, cuya función en muchos casos todavía se desconoce. Una parte de este ADN no codificante corresponde a secuencias de nucleótidos que se repiten hasta miles de veces llamadas ADN repetitivo. Durante la mitosis las moléculas de ADN se condensan y se separan, una en cada célula hija. Cada célula hija inicia su ciclo. 4 Cromosoma Cromosoma duplicado simple Al finalizar la replicación, M los cromosomas están Durante G1, las moléculas formados por dos moléculas 3 de ADN existen como G2 G1 de ADN unidas a nivel del cromosomas largos y centrómero, denominadas 1 delgados que no pueden cromátides hermanas. S verse claramente bajo inter se el microscopio. fa. 2 Durante la fase S la replicación tiene lugar en múltiples sitios a lo largo del cromosoma. Fig. 18. Modificaciones de un cromosoma a lo largo del ciclo celular. Cada cromosoma eucariota en etapa G1 consiste en una molécula de ADN de alrededor de 150 millones de pares de nucleótidos. En un cromosoma eucariota típico se identifican: Dos telómeros: secuencias repetitivas de ADN ubicadas en los dos extremos del cromosoma. Confor- man la heterocromatina constitutiva. Un centrómero: también llamado constricción primaria. Presenta a su vez secuencias de ADN alta- mente repetitivas, sin genes ni información genética. Forma parte también de la heterocromatina constitutiva. Múltiples ORI (Orígenes de replicación): secuencias de ADN que corresponden a las regiones donde se iniciará la replicación del ADN durante la etapa S de la interfase. Un conjunto lineal de genes que codifican ARN y proteínas, interrumpidos por, Muchas secuencias intergénicas de ADN no codificante La función de los telómeros está relacionada con la integridad estructural del cromosoma, formando el denominado tapón telomérico, estructura que sella los extremos de los cromosomas, protegiéndolos. Ellos son necesarios para la duplicación completa del cromosoma, protegen al mismo de nucleasas, evitan que los extremos de los cromosomas se fusionen entre sí y facilitan la interacción del cromosoma con la envoltura nuclear. Los telómeros de las células humanas contienen la secuencia de nucleótidos 5-TTAGGG-3 repetida aproximadamente 2.000 veces. Esta secuencia no presenta información genética. 23 Parte I Núcleo celular El mecanismo de duplicación del ADN lleva consigo un acortamiento de los telómeros. Para compensar el acortamiento, los telómeros son sintetizados por una enzima, la telomerasa. Si la telomerasa está inactiva, cada vez que la célula se divide, los telómeros se acortan. Con el tiempo, los telómeros se vuelven tan cortos que la célula ya no puede dividirse. A este fenómeno se lo denomina senescencia celular (“envejecimiento”). Es decir, las células sólo pueden dividirse un número determinado de veces antes de morir. Se ha observado que los individuos que sufren de síndromes de envejecimiento prematuro, tienen telómeros más cortos en comparación con los individuos sanos. Las células madre y las células tumorales al mantener la enzima telomerasa activa pueden dividirse un número ilimitado de veces. El centrómero o constricción primaria es la región estrecha de un cromosoma que lo separa en un brazo corto (p, petit) y un brazo largo (q, queue). El centrómero corresponde a secuencias de ADN con función estructural. Durante la división celular se puede visualizar la zona centromérica del cromosoma que une las moléculas de ADN duplicadas (cromátides hermanas). Estrechamente unida al centrómero se ubica una placa pro- teica llamada cinetocoro. Esta placa, al unirse a las fibras del huso mitótico, permite la separación y tracción de las cromáti- des hermanas hacia las células hijas. (Fig. 19). La ubicación del centrómero en los distintos cromosomas determinar el largo de los brazos de los cromosomas y por ende el modo en el que se clasifican (Fig. 20) Fig. 19. Cromosoma metafásico.. Satélite Brazos Constricción secundaria Brazos Metacéntrico Submetacéntrico Acrocéntrico Fig. 20. Tipos de cromosomas. Metacéntricos: el centrómero se ubica en posición central y los brazos del cromosoma (de las cromá- tides) tendrán igual longitud. Submetacéntricos: un par de brazos es más corto que el otro Acrocéntricos: el centrómero se encuentra desplazado hacia uno de los extremos, por lo tanto, uno de los brazos es sumamente corto. Los cromosomas acrocéntricos poseen una masa de cromatina llamada satélite, en el extremo del brazo corto. El satélite se halla aislado del resto del cromosoma por la constricción secundaria. La zona aledaña al satélite de los cromosomas acrocéntricos contribuye a formar el nucléolo. 24  Biología Celular Cromosoma procarionte El cromosoma procarionte está compuesto por una molécula de ADN circular y “desnuda” (cro- mosoma no asociado a proteínas como las histonas). A pesar de no tener la complejidad del cromosoma eucariótico, el cromosoma procariótico tam- bién puede tener diferentes niveles de enrollamiento (superenrollamiento). El superenrollamiento en bacterias está regulado por la ADN girasa y la topoisomerasa I. En general se denomina nucleoide (falso núcleo) al cromosoma circular compactado. Cromosoma relajado Cromosoma superenrollado El ADN bacteriano se encuentra asociado a las proteínas HU, que son pequeñas proteínas bá- sicas similares a las histonas. Las proteínas HU inducen la condensación del cromosoma y los pro- cesos de replicación. De esta forma, las proteínas HU pueden regular la expresión genética en pro- cariontes. Una de las demostraciones más espectaculares de la importancia del superenrollamiento, se demuestra en las mutaciones de la proteína HU. La proteína normal forma dímeros y superenrolla el ADN en forma negativa (superhélice a derecha) mientras que la proteína mutante forma octámeros y enrolla el ADN en forma positiva (superhélice.a izquierda) lo que produce una mayor compactación en el ADN. Este cambio en el superenrollamiento es suficiente para transformar completamente el compor- tamiento, fisiología y fenotipo de la bacteria Escherichia coli de la cepa K12, que normalmente no produce infecciones. En cambio, la bacteria con la proteína HU mutada, es invasiva, escapa de los mecanismos de destrucción celulares y cambia su morfología, ya que E. coli normalmente es un bacilo pero la mutante es un coco. Esto demuestra que la bacteria no invasiva posee los genes de virulencia, pero estos se encuentran crípticos, es decir en un estado apagado. (a) (b) (a) Estructura tridimensional de un dímero de Cromosoma de Escherichia coli. El nucleoi- la proteína HU unida al ADN visto de frente y de de E. coli está constituido por un núcleo perfil. (b) Superenrollamiento del ADN (espiral central proteico del que irradian 40-50 lazos gris) alrededor de las moléculas de HU. de ADN superenrollado. 25 Parte I Núcleo celular 4.1 Cariotipo humano El cariotipo es el conjunto de cromosomas de una célula. El cariotipo de un individuo se representa me- diante un gráfico en el cual los cromosomas se colocan ordenados por forma y tamaño. Para representar un cariotipo se fotografían los cromosomas en el momento en que son visibles al microscopio, es decir, durante la mitosis. Generalmente los cromosomas son fotografiados en la metafase mitótica, pues es en esta etapa cuando alcanzan el mayor grado de condensación y pueden observarse mejor. Por este motivo los cromo- somas se ven duplicados, ya que en metafase cada uno aún conserva las dos cromátides hermanas. Una vez tomada la fotografía, las imágenes de los cromosomas se recortan y ordenan. 4.2 Conceptos de diploidia y haploidia El cariotipo humano consta de 23 pares de cromosomas homólogos. Cada par de homólogos posee un representante proveniente de la mujer o del varón. Aunque los cromosomas que forman un par de homólogos tienen la misma forma y tamaño, no son idénticos. Los cromosomas homólogos llevan genes que codifican los mismos caracteres, pero es posible que porten versiones distintas de estos genes. Cada versión posible de un gen se denomina alelo. Por ejemplo, el gen que codifica el color de ojos presenta varios alelos: marrón, verde, azul, gris. Un individuo puede heredar simultáneamente un cromosoma con el alelo para color de ojos que codifica “gris” y el homólogo con el alelo que codifica ”marrón”, ya que los dos cromosomas homólogos provienen de individuos distintos (el padre y la madre). Las células que presentan cromosomas homólogos se denominan diploides de diplo, doble y se simboli- zan “2n”. Tal es el caso de las células humanas a excepción de las gametas, que solo poseen un cromosoma de cada par y se denominan haploides, de haplo, simple, y se simbolizan “n”.. Par de cromosomas Par de cromosomas homólogos homólogos 1 2 3 4 1 2 3 4 2n = 4 n=4 (a) (b) Fig. 21. (a) Célula diploide hipotética 2n=4 (dos pares de homólogos). (b) Célula haploide hipotética n=4, (cuatro cromosomas diferentes). El siguiente esquema es una representación gráfica del cariotipo humano, tomado de una célula somática (cor- poral) diploide durante la metafase mitótica. En él se observan los 23 pares de homólogos que lo conforman. 26  Biología Celular Cromosoma Cariotipo Humano metafásico Homólogo Homólogo materno paterno 1 2 3 4 5 Centrómero 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 5 Cromátides 19 20 21 22 Par de cromosomas X 23Y hermanas homólogos Fig. 22. Cariotipo humano normal. La célula se detuvo en metafase, por ello los cromosomas están duplicados. Los 23 pares de cromosomas homólogos presentes en cualquiera de las células somáticas humanas se clasifican en dos tipos Cromosomas somáticos o autosomas: son los cromosomas de los pares 1 al 22. Los genes portados por estos cromosomas codifican rasgos somáticos, comunes a ambos sexos Cromosomas sexuales, gonosomas o alosomas: son los cromosomas del par 23. En estos cromosomas se ubican los genes que determinan las diferencias entre los sexos. El par de cromosomas sexuales puede estar constituido por dos cromosomas “X” (XX) o bien por un cromosoma “X” y otro “Y” (XY). Las células de las mujeres llevan el par XX y las de los varones, el par XY. Por lo tanto, la dotación cromosómica de una célula somática nucleada de cualquier tejido, perteneciente a una mujer, será la siguiente:. Célula somática = 2n = 46 = 22 pares de autosomas + XX En tanto, la dotación cromosómica de una célula somática nucleada de cualquier tejido, perteneciente a un varón, será: Célula somática = 2n = 46 = 22 pares de autosomas + XY Las gametas llevan solamente 23 cromosomas. La meiosis (división celular que da origen a las gametas a partir de células germinales del ovario y del testículo) posibilita la separación de los cromosomas homólogos, de manera que cada gameta reciba un cromosoma de cada par. Esta separación afecta tanto a los cromosomas somáticos como a los sexuales. La dotación cromosómica de las gametas es: Gameta = n = 23 = 22 autosomas + 1 cromosoma sexual El cromosoma sexual presente en las gametas femeninas u óvulos es siempre un cromosoma X. Pero en las gametas masculinas o espermatozoides, el cromosoma sexual puede ser el X o el Y. La mitad de los esper- matozoides que produce un varón lleva el cromosoma X y la otra mitad, el Y. Óvulo = n = 23 = 22 autosomas + X Espermatozoide = n = 23 = 22 autosomas + X Espermatozoide = n = 23 = 22 autosomas + Y 27 Parte I Núcleo celular Patrones de bandeo de cromosomas El ordenamiento de los cromosomas para armar un cariotipo requiere de la tinción de los cromo- somas. Las técnicas de tinción de los cromosomas metafásicos se conocen como técnicas de bandeo. Las técnicas más utilizadas son: G, R, Q y C. El par de homólogos presenta un mismo patrón de bandas. Bandeo G. La tinción con Giemsa marca las regiones de los cromosomas que son ricos en pares de nucleótidos A-T produciendo una banda oscura, la banda G o banda G positiva. A la banda que no se colorea y permanece clara se la denomina banda G negativa. Sin embargo, si a los cromosomas se los trata en una solución alcalina caliente previamente a la coloración con Giemsa, se obtiene un patrón de coloración reverso al anterior. Concretamente la banda G queda sin colorear y lo que antes era la banda clara queda oscura. Por esta razón la banda G negativa, es denominada banda R (reversa). En el bandeo G, las bandas oscuras representan sobre todo ADN heterocromático. Un error común es suponer que cada banda representa un gen. En realidad las bandas más pe- queñas contienen más de un millón de pares de nucleótidos y potencialmente cientos de genes, por lo tanto, las bandas se correlacionan con la densidad génica (genes/106 pb). Por ejemplo, el tamaño de una banda pequeña es igual a toda la información genética de una bacteria. Bandas Q. Son regiones que se tiñen con quinacrina, colorante que se une preferentemente a regiones ricas en AT (Adenina y Timina), son visualizadas con microscopía de fluorescencia. Bandas C. Permite reconocer la ubicación de la heterocromatina del centrómero, la región or- ganizadora nucleolar (NOR) y la porción distal del cromosoma Y. La técnica implica un tratamiento con hidróxido de sodio y posterior tinción con Giemsa. Ubicación de un gen en un cromosoma. En general. los cromosomas se esquematizan con el brazo p hacia arriba, separado por el centrómero del brazo q. A bajas resoluciones solo se observan las bandas mayores, denominadas q1, q2, q3 o p, p2, p3 partiendo siempre desde el centrómero. A mayo- res aumentos se revelan sub-bandas marcadas como q11, q12, q13, etc. Aun a mayores aumentos se revelan sub-sub-bandas denominadas, q11.1, q11.2, q11.3, etc. Este sistema de numeración es necesario para realizar el mapeo de los genes en los cromosomas, denominándose Sistema Internacional para la Nomenclatura Citogenética (ISCN). (a) (b) (c) q21.1 q21.1 q21.21 q21 q21.2 q21.22 q21.3 q21.23 q21.3 En el gráfico se observa el mismo cromosoma cada vez con mayor resolución, donde se aprecia nuevas bandas a mayores aumentos. 28  Biología Celular 4.3 Determinación cromosómica del sexo En los mamíferos, el sexo cromosómico queda determinado en el momento de la fecundación, de acuerdo con los cromosomas que hereda la cigota (Fig. 23). Si un ovocito es fecundado por un espermatozoide porta- dor del cromosoma X, la cigota resulta hembra. Si, en cambio, el ovocito es fecundado por un espermatozoide portador del cromosoma Y, la cigota resultante es macho. Ovocito X X XX Hembra Espermatozoide Y X XY Macho Fig. 23. Determinación cromosómica del sexo. En general, uno de los sexos es homogamético y el otro, heterogamético. Sexo Homogamético Sexo heterogamético Ejemplos. El cromosoma Y determina que Hembra XX Macho XY el individuo sea macho (mamífe- ros y peces). El cromosoma W determina el Macho ZZ Hembra ZW sexo (aves, anfibios, reptiles, mariposas). Hembra XX Macho X0 Abejas, saltamontes. Cuadro 3. Determinación del sexo cromosómico. 4.3.1 Mecanismo de la inactivación del cromosoma X y corpúsculo de Barr En los organismos en los que las hembras y los machos difieren en los cromosomas sexuales, los pro- ductos de estos genes se expresan en cantidades equivalentes en hembras y machos. Este proceso recibe el nombre de compensación de dosis génica. La compensación de dosis génica se lleva a cabo por diferentes mecanismos. En los mamíferos, el macho es heterogamético (XY) y las hembras son homogaméticas (XX). Es decir las hembras poseen dos cromo- somas X, uno aportado por la hembra y el otro por el macho. Por compensación de la dosis, uno de los dos cromosomas X es inactivado al azar, es decir la cromatina se compacta y el cromosoma es inactivo, es decir, sus genes no se transcriben; se trata de un ejemplo de heterocromatina facultativa (Fig. 24). El cromosoma X heterocromático aparece entonces como un cuerpo coloreado oscuro unido a la envol- tura nuclear y se denomina corpúsculo de Barr. El testeo de los corpúsculos de Barr fue introducido en 1966 en los juegos olímpicos, con el objetivo de detectar atletas varones que quisieran competir como mujeres. 29 Parte I Núcleo celular Corpúsculo de Barr o Fig. 24. Esquema de inactivación al azar del corpúsculo de Barr (izquierda). En la microfotografía de la derecha, el corpúsculo de Barr está señalado con la flecha. Se observan asociados a la envoltura nuclear. Los otros cuerpos oscuros no asociados a la envoltura nuclear son nucléolos. La inactivación del cromosoma X es un evento que ocurre tempranamente en el desarrollo embrionario. En una célula determinada puede inactivarse el cromosoma X proveniente de la mujer o el varón. General- mente la inactivación de uno u otro ocurre al azar, aunque existen algunas excepciones. Por ejemplo, en los marsupiales siempre se inactiva el X proveniente del macho al igual que en las membranas extraembrionarias de los mamíferos (placenta, amnios, cordón umbilical). Luego de que ha ocurrido la inactivación de un cro- mosoma X, todas las células hijas de esa célula en particular, continúan con el mismo cromosoma X inactiva- do. Por lo tanto, la inactivación del cromosoma X genera líneas. celulares o clones que poseen diferentes genes activos. Los organismos con estas características se denominan mosaicos genéticos. Es decir, las mujeres son mosaicos genéticos. Mecanismo: en la inactivación del cromosoma X actúa un gen XIST (acrónimo de X-inactive specific transcript) que se encuentra en el mismo cromosoma X. El gen XIST codifica una gran molécula de ARN. EL ARN que se copia a partir del gen XIST se acumula a lo largo del cromosoma X que contiene el gen XIST activo. Este ARN inactiva casi todos los restantes genes del cromosoma. Este ARN no se une al otro cromo- soma X. Los corpúsculos de Barr son cromosomas X recubiertos por el ARN de XIST. La transcripción del gen XIST cesa en el otro cromosoma X, permitiendo la expresión de los genes que éste posee. La inactivación del gen XIST del cromosoma X activo se produce por la metilación de sus secuencias regulatorias. Por lo tanto, el bloqueo de la expresión del gen XIST permite que este cromosoma continúe activo. 30  Biología Celular Epigenética, inactivación del cromosoma X y los gatos calicó Mientras la genética trata sobre los genes en sí, la epigenética se ocupa de la interacción y regu- lación entre estos genes y sus productos, lo que da lugar a su fenotipo. En el núcleo celular de pocos micrómetros se compactan dos metros de ADN y la información almacenada no está libremente disponible, sino que algunos genes están siempre activos, como los genes constitutivos (housekeeping genes) y otros en cambio, inactivos. Estos patrones de activación y desactivación génicos se dan por las interacciones entre los genes y sus productos. El primer gato clonado, Carbon Copy (Cc) (copia de papel carbón) fue creado en Texas (EEUU) a partir de un gato tricolor (o calicó). Pero, a pesar de tener el ADN idéntico al de su “madre” ge- nética, Rainbow, el gatito Cc no resultó una “copia de papel carbón”.. Rainbow (izquierda) y Carbon Copy Cc (derecha). Cc posee la misma información genética que Rainbow, sin embargo, poseen diferentes colores y patrón de pelaje. Esto se debe a que el patrón de pelaje y el color dependen no sólo de la información genética, sino tam- bién de factores reguladores que determinan la activación y los productos génicos. ¿Cómo se explica que a pesar de tener los mismos genes, los dos gatos no sean idénticos? Esto se puede explicar en parte por la inactivación de X. Los gatos calicó son siempre hembras, lo que significa que tienen dos cromosomas X en todas las células. El gen que codifica el pelaje naranja está localizado en el cromosoma X, pero existe otro alelo de este gen, que resulta en pelo negro. En las gatas (XX), uno de los cromosomas X queda inactivado, de manera que si una hembra hereda los dos alelos (naranja y negro), su pelaje exhibirá parches de ambos colores. El proceso de inactivación se produce al azar, por lo que la clonación de un gato calicó nunca resultará en el mismo patrón. Cc fue creada a partir de un óvulo donante al que se le retiró su núcleo, intercambiándose por el núcleo de la gata calicó Rainbow. Aunque la célula a partir de la que fue clonada Cc tenía un cromosoma X inactivo, el programa de desarrollo embrionario reactivó ambos cromosomas X y el proceso de inactivación se produjo de forma aleatoria en cada célula de Cc. Esto resulta en un pa- trón de pelaje completamente diferente, incluso cuando dos individuos son genéticamente idénticos. ¿Considerás que la inactivación de X es un proceso epigenético? 31 Parte I Núcleo celular 4.4 Euploidias y aneuploidias Los individuos euploides (eu: verdadero), son aquellos que poseen uno o más juegos completos de cro- mosomas. Pueden ser monoploides, diploides o poliploides. Los individuos aneuploides son los que presentan alterado el número de cromosomas (de más o de menos) con respecto al número correcto de cromosomas para la especie. Las aneuploidias cromosómicas son uno de los más frecuentes trastornos genéticos en humanos y pro- vocan tanto abortos espontáneos como el nacimiento de niños con anomalías muy diversas, pero en general con discapacidad intelectual como denominador común. La probabilidad de presentarse se incrementa expo- nencialmente a medida que es mayor la edad de la madre al quedar embarazada, principalmente en mujeres mayores de 35 años. Recientemente se ha visto que la edad del padre también influye Las aneuploidias más frecuentes corresponden a las trisomías de los cromosomas 21 (Síndrome de Down (Fig. 25), cromosoma 18, Síndrome de Edward y cromosoma 13 Síndrome de Patau. También se presentan anormalidades en el número y tipo de los cromosomas sexuales, el X o el Y. Síndrome de Turner, o monosomía X. Se caracteriza por la falta de un cromosoma X. Genotípicamente son mujeres pues carecen del cromosoma Y. Es la única monosomía viable en seres humanos, pues la carencia de cualquier otro cromosoma es letal. Las mujeres con Síndrome de Turner son de talla pequeña y presentan disgenesia ovárica (no se desarrolla el ovario), por lo tanto no desarrollan caracteres sexuales secundarios (Fig. 26). El síndrome de Klinefelter afecta solamente a hombres, pues este síndrome se caracteriza por poseer cromosomas X de más. En el 75% de los casos, los individuos poseen un cromosoma X de más, siendo su cariotipo 47, XXY. Los hombres con Klinefelter sufren infertilidad e hipogonadismo. En conjunto estas aneuploidías se presentan en 7 de cada 3.000 embarazos (Fig. 27).. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 XX Fig. 25. Trisomía del par 21. Cariotipo de mujer, con tres cromosomas número 21 (47, XX, +21). 32  Biología Celular 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y Fig. 26. Síndrome de Turner. Cariotipo (45, X0).. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y Fig. 27. Síndrome de Klinefelter. Cariotipo (47, XXY). 33 Parte I Núcleo celular BIBLIOGRAFÍA Alberts, B et al (2010). Biología Molecular de la Célula. 5ta Edición. Ediciones Omega S.A. Barcelona. Becker W, Kleinsmith L y Hardin J (2007). El mundo de la célula. 6ta Edición. Pearson Educ