Réplication de l'ADN chez les bactéries (Cours 7) 2024 PDF

La replication de l’ADN chez les bactéries. MCB2992, 8 novembre 2024  La réplication du chromosome bactérien. -La réplication du chromosome bactérien est la première étape du cycle cellulaire. -Elle précède la ségrégation des chromosomes répliqués et la formation du septum pour la...

La replication de l’ADN chez les bactéries. MCB2992, 8 novembre 2024  La réplication du chromosome bactérien. -La réplication du chromosome bactérien est la première étape du cycle cellulaire. -Elle précède la ségrégation des chromosomes répliqués et la formation du septum pour la division cellulaire. -La réplication du chromosome se divise en trois étapes: 1-initiation 2-élongation 3-terminaison  La réplication du chromosome bactérien. Le cycle cellulaire. Cycle cellulaire bactérien: 1-croissance 2-masse d’initiation 3-réplication (initiation) 4-réplication (élongation) 5-réplication (terminaison) 6-décaténation 7-ségrégation/septum 8-division  La réplication du chromosome bactérien. -La double-hélice d’ADN Watson-Crick. -En 1930, des études biochimiques de Erwin Chargaff sur la composition en bases de l’ADN, montrent que la quantité de guanine est toujours égale à celle de la cytosine et la quantité d’adénine est toujours égale à celle de la thymine, peu importe le nombre total de bases de l’ADN. -Au début des années 1950, les études de diffraction au rayon-x de Franklin et Wilkins montrent que l’ADN est une double-hélice. -Watson et Crick utilisent les données de Chargaff et de Franklin et Wilkins pour présenter leur modèle de la structure de l’ADN. -Quelques propriétés de la double-hélice: environ 10 paires de bases par tour d’hélice, les bases complémentaires relient les deux brins d’ADN antiparallèles via des liens hydrogène, elle tourne du côté droit, elle est constituée de sillons mineurs et sillons majeurs. La double-hélice d’ADN Watson-Crick.  La double-hélice d’ADN Watson-Crick: tourne vers la droite Gauche Droite Le ruban (brin) au premier plan détermine de quel côté la double-hélice tourne. Droite Gauche  La réplication du chromosome bactérien. Composition de l’ADN: 1-Bases: Les purines: adénine et guanine Les pyrimidines: cytosine et thymine (5-méthyl-uracil) 2-Sucre: Désoxyribose (permet le reconnaissance par l’ADN polymérase). Le carbones du sucre sont appelés « primes » pour les distinguer des carbones des bases. 3-Nucléotides: Désoxynucléotides mono-, di- ou tri-phosphate (dNMP, dNDP, dNTP). La base est attachée au carbone 1’ du désoxyribose et le ou les phosphates sont attachés au carbone 5’ ou 3’ du désoxyribose (3’ dNMP ou 5’ dNMP.) La réplication du chromosome bactérien. Composition de l’ADN: La réplication du chromosome bactérien. Composition de l’ADN:  La réplication du chromosome bactérien. La chaîne d’ADN: -Des liens phosphodiesters lient chacun des désoxynucléotides dans la chaîne d’ADN. -Le phosphate attaché au dernier (5’) carbone du sucre d’un nucléotide est attaché au troisième (3’) carbone du sucre du nucléotide à côté (cela forme une chaîne 5’ vers 3’). -Les deux brins d’ADN sont antiparallèles. La réplication du chromosome bactérien. La chaîne d’ADN: La réplication du chromosome bactérien. La chaîne d’ADN: La réplication du chromosome bactérien. Liens hydrogènes entre les bases. Trouver l’énoncé qui est faux à propos de la double- hélice d’ADN: A. Les brins qui la composent sont antiparallèles: un brin 5’ vers 3’ et l’autre brin 3’ vers 5’. B. La double-hélice tourne du côté droit. C. Le direction du ruban au second plan indique la direction de l’hélice d’ADN (droit ou gauche). D. Les liens phosphodiesters entre les positions 3’ et 5’ des sucres relient les nucléotides entre eux dans un brin d’ADN. E. Aucune de ces réponses.  La réplication du chromosome bactérien. Biosynthèse des désoxynucléotides triphosphates (dNTPs): 1- La ribonucléotide réductase réduit (enlève l’O) en position 2’ du ribose dans un NDP pour donner le dNDP. 2- La kinase ajoute un phosphate pour faire un dNTP 3- pour la désoxythymidine triphosphates (dTTP) la biosynthèse est différente: a- dUDP phosphatase donne le dUMP b- le 5-méthyl est ajouté au dUMP par la thymidylate synthétase via le tétrahydrofolate (il provient du dihydrofolate via la dihydrofolate réductase)  La réplication du chromosome bactérien. Biosynthèse des désoxynucléotides triphosphates (dNTPs):  La réplication du chromosome bactérien. Uracil vs thymine: Trouver l’énoncé qui est faux à propos de la biosynthèse des désoxynucléotides triphosphates: A. Sans la ribonucléotide réductase, il ne pourrait y avoir de synthèse d’ADN. B. La ribonucléotide réductase enlève l’O en position 2’ des NDP pour donner des dNDP. C. Les kinases et les phosphatases sont des enzymes qui respectivement enlèvent et ajoutent un phosphate. D. La thymidylate synthétase utilise le THF pour ajouter un groupement méthyle au dUMP pour générer le dTMP. E. Aucune de ces réponses.  La réplication du chromosome bactérien. -Une fois les précurseurs de la réplication de l’ADN synthétisés, ils doivent être polymérisés sous forme de longues molécules d’ADN double-brin (4 600 000 paires de bases pour le chromosome d’E. coli). -Un complexe très large de plusieurs enzymes va s’assembler sur l’ADN et se déplacer le long de l’ADN, en séparant les deux brins et en synthétisant une copie complémentaire de chacun des brins. Il y a donc deux brins qui entrent dans le complexe de réplication alors que quatre brins vont émerger de l’autre côté pour former une structure ramifiée (branches). -Chacune des « branches » émergentes contient un vieux brin « conservé » et un nouveau brin: la réplication semi-conservative. -Cette structure où la réplication survient est appelée la fourche de réplication.  La réplication du chromosome bactérien. La polymérisation de l’ADN: -Le processus de biosynthèse de l’ADN est accompli par la polymérase ADN qui effectue la polymérisation de l’ADN. -La polymérase attache le premier phosphate () du dNTP au carbone 3’ du sucre du nucléotide suivant, ce qui mène également au relâchement des deux derniers phosphate ( et ) du premier nucléotide pour fournir l’énergie nécessaire à la polymérisation. La réplication du chromosome bactérien. La polymérisation de l’ADN:  La réplication du chromosome bactérien. La polymérisation de l’ADN: -Un brin matrice est nécessaire pour la synthèse de l’ADN par la polymérase ADN. -La polymérase peut seulement se déplacer dans la direction 3’ vers 5’ sur le brin matrice, ce qui permet de lier les désoxynucléotides du nouveau brin dans la direction 5’ vers 3’ (polarité obligatoire). -Quand la réplication est complétée, le produit est un nouvel ADN double-brin avec des brins antiparallèles, un étant le vieux brin ayant servi de matrice et le deuxième étant le nouveau brin. La réplication du chromosome bactérien. Les brins antiparallèles:  La réplication du chromosome bactérien. Les polymérases ADN qui participent à la synthèse normale de l’ADN: -La polymérase I et la polymérase III -La polymérase III est un gros complexe de protéines dans lequel l’enzyme qui polymérise le nucléotides travaille avec plusieurs protéines. La polymérase III est responsable de la réplication du chromosome. Elle est processive. C’est la polymérase réplicative qui fait partie du réplisome. -La polymérase I a des propriétés particulières (distributive, exo 5’ vers 3’) qui lui permettent de jouer des rôles accessoires dans la réplication du chromosome et sa réparation.  La réplication du chromosome bactérien. La processivité de la polymérase III: -La polymérase III (DnaE: polymérisation) est processive car elle est fortement ancrée à l’ADN via la sous-unité DnaN appelée « -clamp ou sliding clamp » (la pince  ou la pince mobile: ressemble à un « beigne ») qui lui permet de synthétiser l’ADN très efficacement (1000 nucléotides par seconde) avec de très rares interruptions.  La réplication du chromosome bactérien. Les primases: -Contrairement aux polymérases ARN, les polymérases ADN ne peuvent initier la synthèse de l’ADN simplement à partir d’un brin matrice. Elles peuvent seulement attacher des désoxynucléotides à un groupe 3’OH déjà présent. Elles ont donc besoin d’une amorce (« primer »). -L’amorce est un petit ARN synthétisé par la primase (DnaG). -L’amorce ARN est éventuellement remplacé par de l’ADN par la polymérase I. La réplication du chromosome bactérien. Les protéines de la réplication: Trouver l’énoncé qui est vrai concernant la réplication de l’ADN: A. Durant la réplication, la polymérase se déplace sur le brin matrice dans la direction 5’ vers 3’. B. L’ADN est synthétisé dans la direction 5’ vers 3’. C. La pol I, qui est processive, est la polymérase qui réplique le chromosome. D. L ’amorce ARN pour la réplication est synthétisée par l’ARN polymérase. E. Aucune de ces réponses.  La réplication du chromosome bactérien. La réplication bidirectionnelle initiée à oriC: -La réplication du chromosome circulaire initiée à oriC est bidirectionnelle, et comporte donc deux fourches de réplication qui se déplacent en sens contraire (sens horaire et sens antihoraire) et se rencontrent au site de terminaison de la réplication (région Ter). -Deux fourches de réplication avec chacune deux polymérases III, une pour un brin continu (ou meneur: « leading ») et l’autre pour un brin discontinu (ou retardé: « lagging ») (polarité obligatoire 5’ vers 3’). La synthèse des fragments d’Okazaki (brin discontinu) avec chacun environ 2 kb d’ADN est initiée par une amorce ARN (environ 12 nucléotides) fait par la primase (DnaG). La réplication du chromosome bactérien. La réplication bidirectionnelle initiée à oriC:  La réplication du chromosome bactérien. La réplication discontinue d’un des deux brins de l’ADN durant la réplication du chromosome: A  La réplication du chromosome bactérien. La réplication discontinue d’un des deux brins de l’ADN durant la réplication du chromosome: B  La réplication du chromosome bactérien. Les activités de la polymérase I: -La polymérase I a une activité exonucléase 5’ vers 3’ unique (absente chez pol III) qui lui permet d’enlever les ribonucléotides ayant été incorporés pour faire l’amorce (déplacement de la cassure (« nick-translation»)). -Au fur et à mesure qu’elle enlève les ribonucléotides via son activité exonucléase 5’vers 3’, elle les remplace par des désoxynucléotides grâce à son activité de polymérase 5’ vers 3’. -Donc, la polymérase I entre au nick (cassure) à l’intersection de la fin d’un fragment d’Okazaki et le début d’une amorce et elle remplace au fur et à mesure un ribonucléotide par un désoxynucléotide grâce à ses activités exonucléase 5’-3’ et polymérase, ce qui a pour effet de déplacer la cassure (nick translation).  La réplication du chromosome bactérien. Les activités de la polymérase I:  La réplication du chromosome bactérien. Le modèle du trombone pour expliquer le couplage de la synthèse des brins continus et discontinus: A -Les deux polymérase III sont reliées entre elles via le « clamp loader » (complexe de plusieurs protéines A- La pol III synthétise de l’ADN du brin discontinu à partir du primer 2 jusqu’à 1 B- Le brin discontinu forme une boucle au fur et à mesure que la pol III synthétise le brin continu et la pol III du brin discontinu se rend vers le dernier fragment d’Okazaki.  La réplication du chromosome bactérien. Le modèle du trombone pour expliquer le couplage de la synthèse des brins continus et discontinus: B C- La pol III a quitté le brin discontinu au primer 1 laissant alors la -clamp. Elle « saute » vers l’autre -clamp au primer 3 (polymerase « hopping » ) D- Les pol III continus et discontinus demeurent toujours reliées via le « clamp loader » Le brin « lagging » (retardé) est toujours synthétisé 1 à 2 secondes plus tard (« lag ») (-clamp = slidding clamp)  La réplication du chromosome bactérien. Les protéines autres que les polymérases et ses accessoires: -DnaB: ADN hélicase (hexamère) qui sépare les brins d’ADN en avant de la polymérase III. Pour se faire, elle s’attache fortement au brin discontinu. Contrairement aux polymérases ARN, les polymérases ADN ne peuvent séparer les brins d’ADN. -SSB: protéine qui interagit avec l’ADN simple brin pour empêcher la re- fermeture des brins d’ADN séparés par DnaB. SSB maintient également l’intégrité de l’ADN simple-brin (protection). -ADN gyrase: ADN topoisomérase qui enlève le surenroulement positif généré en avant de la fourche de réplication. S’il n’est pas enlevé, la progression de la fourche sera empêchée. Trouver l’énoncé qui est faux au sujet de la réplication de l’ADN: A. L’activité exonucléase 5’ vers 3’ de la pol I lui permet d’enlever les amorces ARN des fragments d’Okasaki. B. L’hélicase DnaB est essentielle pour séparer les brins d’ADN avant leur réplication. C. La protéine SSB est essentielle pour protéger l’ADN simple brin des dommages, et pour empêcher son ré-appariement avec le brin complémentaire. D. Le brin continu est synthétisé une à deux secondes plus tard que le brin discontinu. E. Aucune de ces réponses.  La réplication du chromosome bactérien. La correction des erreurs de réplication: -Lafonction « editing » (correction) de la polymerase est une activité exonucléase 3’ vers 5’ lui permettant d’enlever les nucléotides incorporés par erreur, donc de corriger les erreurs de réplication. Les polymérases I et III (DnaQ pour pol III: initialement isolé en tant que protéine Mut) ont cette activité de correction. -L’importance de corriger les erreurs de réplication pourrait expliquer pourquoi l’amorce est fait d’ARN et non pas d’ADN. Si c’était de l’ADN, étant au début de la double-hélice, des erreurs dans l’amorce ne causeraient pas assez de distorsion dans l’ADN pour qu’elles soient reconnues par la polymérase. Le fait que l’ARN est ensuite remplacé par de l’ADN par la pol I, qui utilise pour ce faire une longue amorce ADN (fragment d’Okasaki précédent) de 2 kb, contourne ce problème. -Les « error-prone » polymerases (e.g. pol IV et pol V) n’ont pas cette activité. La réplication du chromosome bactérien. La correction des erreurs de réplication:  La réplication du chromosome bactérien. Les obstacles à la réplication de l’ADN: -Des obstacles de toutes sortes, tels que des protéines attachées à l’ADN, du surenroulement positif en excès, des dommages « encombrants » à l’ADN ou même des cassures peuvent entraver le déplacement d’une fourche de réplication. -La pol III peut sauter par-dessus certains obstacles sur les brins discontinus (hopping) mais une nouvelle pol III est utilisée si l’obstacle est sur le brin continu; quelques fois une « translesion pol » (error-prone e.g. pol V dans SOS) est utilisée.  La réplication du chromosome bactérien. Les obstacles à la réplication de l’ADN: Brin discontinu  La réplication du chromosome bactérien. Les obstacles à la réplication de l’ADN: Brin continu  La réplication du chromosome bactérien. Les obstacles à la réplication de l’ADN: Polymérases Translesion  La réplication du chromosome bactérien. Les obstacles à la réplication de l’ADN: Polymérase ARN dans la même direction que la fourche de réplication. -La réplication voyage 20 fois plus rapidement que la transcription (1000 ntds vs 50 ntds) -Les collisions co-directionnelles sont beaucoup moins dommageables que les collisions face à face. Trouver l’énoncé qui est faux concernant les erreurs de réplications et les obstacles sur l’ADN: A. L’activité exonucléase 5’ vers 3’ permet de corriger les erreurs de réplication. B. Les polymérases translésion n’ont pas d’activité exonucléase 3’ vers 5’. C. La polymérase III peut passer par- dessus un dommage sur le brin discontinu. D. Lors d’une collision co- directionnelle avec l’ARN polymérase, la polymérase III peut redémarrer en utilisant l’ARN naissant (de l’ARN pol) comme amorce. E. Aucune de ces réponses.  La réplication du chromosome bactérien. La topologie de l’ADN: -L’ADN des cellules est surenroulé négativement: énergie dans le molécule d’ADN qui tend à dérouler la double-hélice: la double-hélice tourne alors du côté gauche. À cause d’une certaine rigidité dans le double-hélice cette tension peut aussi se traduire par un surenroulement de la molécule d’ADN sur elle-même du côté droit: surenroulement négatif. -La topologie de l’ADN: L=T + W L étant le linking number, soit le nombre de fois que les brins d’ADN se croisent. T: croisement des deux brins à l’intérieur de la molécule d’ADN W: croisement de la molécule d’ADN avec elle-même: supertours. L= T + W L négatif: surenroulement négatif, énergie emmagasinée dans l’ADN qui tend à dérouler la double-hélice et énergie pour compacter l’ADN. Facilite l’ouverture de brins pour initier la réplication et la transcription. L positif: surenroulement positif: tension dans l’ADN qui tend à enrouler d’avantage la double-hélice: brins d’ADN plus difficiles à séparer. Surenroulement positif généré par la réplication.  La réplication du chromosome bactérien. La topologie de l’ADN: La topologie de l’ADN Gyrase + ATP Writhe Twists Surenroulement négatif ouverture de brins  La réplication du chromosome bactérien. La topologie de l’ADN: les topoisomérases -Les topoisomérases sont des enzymes présents chez tous les organismes vivants: activité de cassure de brins, passage de brins et re-fermeture (ligation) -Elles peuvent modifier le L -Essentielles pour régler les problèmes topologiques de l’ADN qui sont inhérents à sa structure en double-hélice. -participent à toutes les étapes de la réplication.  La réplication du chromosome bactérien. La topologie de l’ADN: régulation du surenroulement du chromosome chez les bactéries. Le surenroulement de l’ADN du chromosome circulaire bactérien est régulé par les activités opposées de la gyrase (introduit du surenroulement négatif en présence d’ATP) et de la topoisomerase I (enlève les supertours négatifs en excès)  La réplication du chromosome bactérien. La topologie de l’ADN et la réplication: initiation -Le surenroulement négatif de l’ADN par la gyrase est nécessaire, avec DnaA, pour séparer les brins d’ADN à oriC, afin d’initier la réplication.  La réplication du chromosome bactérien. La topologie de l’ADN et la réplication: elongation. - Le mouvement de la fourche de réplication génère du surenroulement positif qui, en avant, est relaxé par la gyrase. Des supertours positifs peuvent passer en arrière pour générer des précaténanes qui sont enlevés par la topo IV. Tous les liens doivent être enlevés pour que la séparation des chromosomes soit possible (L=0).  La réplication du chromosome bactérien. La topologie de l’ADN et la réplication: elongation.  La réplication du chromosome bactérien. La topologie de l’ADN et la réplication: terminaison. - Les deux fourches convergentes à ter entraînent une très forte accumulation de supertours positifs qui ne peuvent être enlevés par la gyrase car l’espace est trop restreint.  La réplication du chromosome bactérien. La topologie de l’ADN et la réplication: terminaison.  La réplication du chromosome bactérien. La topologie de l’ADN et la réplication: terminaison. -La replication est terminée avant la séparation topologique des chromosomes: les supertours diffusent en arrière. Ils seront enlevés par la topo IV (A). -La replication est terminée après la separation topologique des chromosomes: Les brins de l’hélice Watson-Crick peuvent être séparés avant la fin de la réplication par la topoisomérase I ou III (B).  La réplication du chromosome bactérien. La topologie de l’ADN et la réplication: terminaison. III  La réplication du chromosome bactérien. La topologie de l’ADN et la réplication: terminaison. Le surenroulement négatif favorise l’éloignement des molécules répliquées au moment de leur décaténation. Donc la décaténation est favorisée par rapport à la caténation, grâce au surenroulement négatif La réplication du chromosome bactérien. Le surenroulement négatif favorise la séparation finale des chromosomes (décaténation) par la topoisomérase IV. ADN relaxé ADN surenroulé Trouver l’énoncé qui est faux concernant la topologie de l’ADN et la réplication: A. L’introduction de surenroulement négatif par la gyrase est essentielle pour initier la réplication. B. La gyrase enlève les supertours positifs générés en avant la fourche de réplication. C. La topoisomérase IV enlève les précaténanes en arrière de la fourche de réplication. D. Le surenroulement négatif empêche la décaténation. E. Aucune de ces réponses.  La réplication du chromosome bactérien. -La terminaison de la réplication: -La réplication du chromosome se termine lorsque les deux fourches initiées à oriC, se rencontrent dans le région ter. -La terminaison se fait par la rencontre des deux fourches en collision mais est restreinte à la région ter grâce au système Tus/ter qui bloque les fourches d’une manière unidirectionnelle. La terminaison à cet endroit facilite le couplage avec la ségrégation des chromosomes. La réplication du chromosome bactérien. -La terminaison de la réplication: Initiation de la réplication MCB2992, 15 novembre 2024  Initiation de la réplication. 1-Des initiateurs agissant en trans, reconnaissent des origines de réplication (cis). -Trans: ORC (origin recognition complex) chez les eucaryotes. Orc1/Cdc6 chez les Archaea. DnaA chez les bactéries. -Cis: Séquences plus ou moins spécifiques chez les eucaryotes. oriC chez les Archaea et les bactéries. 2-Les hélicases réplicatives sont recrutées à l’origine et chargées sur l’ADN simple brin. -MCM pour eucaryotes et Archaea -DnaB pour procaryotes. Initiation de la réplication. oriC oriC  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. L’élément agissant en cis: oriC. -Séquence hautement conservée chez les bactéries. -Chez E. coli, la séquence d’ADN la plus courte portant un oriC actif est de 245 nucléotides. oriC a été cloné en coupant d’abord le chromosome bactérien avec l’enzyme de restriction Sau3A puis en effectuant une ligation (ligase) avec un fragment d’ADN portant la résistance à la kanamycine. La formation de colonies sur un milieu contenant la kanamycine indique le clonage d’un fragment d’ADN permettant la réplication du gène de résistance à la kanamycine.  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Clonage d’un fragment d’ADN portant la région oriC d’E. coli: oriC Kmr transformation sélection Souche sauvage LB Kanamycine  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. L’élément agissant en cis: oriC. -La région oriC contient plusieurs sites d’interaction avec des protéines qui contrôlent l’initiation de la réplication, dont DnaA. -La séquence consensus pour DnaA est de neuf nucléotides et est appelée boîte DnaA -il y a des boîtes DnaA de haute affinité (R1 à R5) et d’autres de plus faible affinité -il y a également des sites d’interaction avec Fis et IHF. -il y une séquence AT-riche appelée DUE (« DNA unwinding element »). C’est la séquence où la séparation des brins est initiée à oriC.  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. L’élément agissant en trans: DnaA. -DnaA est un membre de la famille des protéines AAA+ (ATPases Associated with various cellular Activities), dont l’activité est régulée par l’interaction avec le nucléotide adénine. La forme DnaA-ATP est la forme active qui permet l’ouverture à oriC. -L’ATP sur DnaA est convertie en ADP par l’activité intrinsèque de DnaA. -En fait, DnaA-ADP est presque toujours présent aux boîtes DnaA de haute-affinité à oriC. Il fait donc partie du complexe de pré-réplication à oriC (pré-RC). -Environ 20 monomères de DnaA sont nécessaires pour former un pré-RC. Trouver l’énoncé qui est faux à propos des origines de réplication: A. La région oriC est présente chez les Archaea et les bactéries mais pas chez les eucaryotes. B. L’hélicase réplicative chez les bactéries est semblable à DnaB d’E. coli, alors que chez les Archaea et les eucaryotes c’est plutôt MCM. C. La séparation des brins à oriC est initiée dans l’élément DUE, une séquence AT-riche. D. L’affirmation que la région oriC a une longueur de 245 pb, est basée sur des expériences de clonage avec un fragment d’ADN portant la résistance à la kanamycine. E. Aucune de ces réponses.  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. L’élément agissant en trans: DnaA. -Il y a environ 1000 à 2000 monomères de DnaA par cellule. -Malgré son abondance, c’est DnaA qui détermine la masse d’initiation de la cellule (masse de la cellule qui déclenche l’initiation de la réplication à oriC). -Il y a en fait un pool très limitant de DnaA-ATP dans la cellule, qui fait en sorte que la réplication est initiée à un moment précis (masse d’initiation): -Plusieurs sites d’interaction de DnaA (boîtes DnaA) en dehors de oriC (plus de 300). -Régulation de la synthèse de DnaA -Richesse du milieu de culture (ATP) -Mécanismes d’activation de l’hydrolyse de l’ATP sur DnaA.  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Sensibilité de l’initiation de la réplication aux inhibiteurs de synthèse protéique: Ceci s’explique par la nécessité de synthétiser DnaA de novo avant chaque initiation à oriC. EXPLICATION: -DnaA se retrouve sous deux formes dans la cellule: DnaA-ADP et DnaA-ATP -DnaA-ADP interagit avec les sites R de haute affinité dans oriC. Le complexe ainsi formé sert de plateforme pour la formation du complexe de pré-réplication (coopérativité). -Cependant, seul DnaA-ATP qui interagit avec des sites de faible affinité permet la séparation des brins d’ADN à oriC. -Après l’initiation, DnaA-ATP est hydrolysé en DnaA-ADP (RIDA) -L’affinité de DnaA pour ADP vs ATP est très semblable. -Dans la cellule il y a toujours plus d’ATP que d’ADP. Cela est particulièrement vrai lorsque les cellules sont dans un milieu riche. Donc lorsque DnaA est nouvellement synthétisé, il sera préférentiellement lié à de l’ATP -MÉCANISME DE RÉGULATION EN FONCTION DE LA RICHESSE DU MILIEU (qté ATP: MASSE D’INITIATION ATTEINTE PLUS RAPIDEMENT)  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Séquence minimale oriC: Région minimale oriC avec des séquences d’interaction avec DnaA et l’élément DUE (AT riche: ouverture initiale de oriC). La saturation des sites de plus faible affinité par des molécules DnaA-ATP permet la formation d’une super structure qui permet l’ouverture à DUE.  Sites de Haute affinité (DnaA-ADP) Plateforme pour assemblage du mégacomplexe Préférence Pour DnaA-ATP Les boîtes DnaA chez des bactéries et des Archaea. Région oriC chez différentes bactéries. Trouver l’énoncé qui faux à propos de l’initiation de la réplication à oriC: A. La masse d’initiation est déterminée par la quantité de DnaA-ATP dans la cellule. B. DnaA-ADP interagit avec les sites R de haute affinité dans oriC. Le complexe ainsi formé sert de plateforme pour la formation du complexe de pré-réplication. C. Le binding de DnaA-ATP aux sites de faible affinité permet l’initiation de la réplication à oriC. D. Dans la cellule il y a toujours moins d’ATP que d’ADP. Cela est particulièrement vrai lorsque les cellules sont dans un milieu pauvre. E. Aucune de ces réponses.  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Les éléments participants: -En plus de DnaA, plusieurs autres protéines sont requises pour l’initiation de la réplication, incluant DnaC et DnaB. -DnaA est requis pour initier la séparation des brins à oriC (super structure qui « twist » l’ADN). -Elle permet ensuite à DnaC de charger l’hélicase réplicative DnaB pour l’établissement de fourches de réplication. -DnaG synthétise la amorces ARN. -Les protéines abondantes de type histone, IHF et FIS participent également à la formation du méga-complexe avec DnaA à oriC, en facilitant la formation d’une courbure dans l’ADN. -La gyrase: introduit le surenroulement négatif dans l’ADN à oriC, pour faciliter son ouverture par DnaA. -La transcription divergente: aussi surenroulement négatif à oriC. Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Initiation de la réplication du chromosome bactérien.  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. La transcription génère du surenroulement dans l’ADN: - + topo I gyrase twin-domain model  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. La transcription divergente facilite l’ouverture des brins d’ADN à oriC en générant du surenroulement négatif: oriC -----  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Identification du gène dnaA: -Mutants conditionnels thermosensibles dans des gènes codant pour des protéines impliquées dans la réplication du chromosome: Deux types de mutants ont été isolés: 1- Les mutants « fast stop » ou arrêt immédiat. 2- Les mutants « slow stop » ou arrêt retardé.  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Identification du gène dnaA: Ces phénotypes sont révélés dans des expériences d’incorporation de thymine radioactive à la température non-permissive. -Exemples: Un mutant dnaA(Ts) donne un phénotype d’arrêt retardé à la température non-permissive car bien que l’initiation soit inhibée à 42oC, la réplication déjà entamée se poursuit jusqu’à sa complétion (40 min). Un mutant dnaB(Ts) donne un phénotype d’arrêt immédiat à la température non- permissive car l’inactivation de l’hélicase réplicative cause l’arrêt instantané de la réplication.  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Identification du gène dnaA: Incorporation thymine radioactive arrêt retardé: dnaA(Ts) arrêt rapide: dnaB(Ts) temps 40 min. Trouver l’énoncé qui est vrai à propos des facteurs contribuant à l’initiation de la réplication à oriC: A. La gyrase et la transcription convergente permet de générer le surenroulement négatif nécessaire à l’ouverture des brins à oriC. B. Dans un mutant dnaBTs, la réplication est arrêtée immédiatement après un transfert à 42oC, car DnaB est impliquée dans l’initiation de la réplication. C. Dans un mutant dnaBTs, la réplication est arrêtée immédiatement après un transfert à 42oC, car DnaB est impliquée dans l’élongation de la réplication. D. Dans un mutant dnaATs, la réplication est arrêtée immédiatement après un transfert à 42oC, car DnaA est impliquée dans l’initiation de la réplication. E. Aucune de ces réponses. Initiation de la réplication du chromosome bactérien.  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Immédiatement après l’initiation de la réplication: séquestration d’oriC dans la membrane cytoplasmique: -La protéine SeqA s’attache aux séquences GATC méthylées (A) à un seul brin d’ADN (ADN hémi-méthylé). Elle interagit également avec la membrane cytoplasmique. -Il y a 11 séquences GATC dans la région oriC (250 pb). -Suite à l’initiation de la réplication à oriC, les 11 séquences GATC sont hémi-méthylées. La protéine SeqA peut donc interagir avec ces séquences et séquestrer la région oriC à l’intérieur de la membrane cytoplasmique.  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Immédiatement après l’initiation de la réplication: séquestration d’oriC dans la membrane cytoplasmique: -Ceci empêche une nouvelle initiation de la réplication à oriC, puisque cette région n’est plus disponible pour la protéine DnaA. -La surproduction de la méthylase Dam (lorsque le gène dam est porté par un plasmide multicopie) permet une méthylation rapide à oriC, créant ainsi une compétition avec l’attachement de SeqA. Ceci entraîne une sur-initiation de la réplication à oriC, causant ainsi une dérégulation du cycle cellulaire et une augmentation de la quantité d’ADN par cellule. -Dans ce système de régulation, le promoteur du gène dnaA (situé dans la région oriC) peut aussi être hémi-méthylé, ce qui entraîne une inhibition de la synthèse de DnaA suivant l’initiation de la réplication.  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Immédiatement après l’initiation de la réplication: séquestration d’oriC dans la membrane cytoplasmique: -Il n’y a pas de GATCs dans les boîtes DnaA de haute-affinité. -Les GATCs sont retrouvés dans les boîtes DnaA de faible-affinité et dans la région DUE. -Donc, immédiatement après l’initiation de la réplication, l’attachement de SeqA aux GATCs hémi-méthylés dans les boîtes DnaA de faible-affinité bloquent l’assemblage du complexe pré-RC mais permet le ré-attachement de DnaA aux sites de haute-affinité (R1, R2 et R4) -La période de séquestration dure environ 1/3 du cycle cellulaire. Initiation de la réplication du chromosome bactérien.  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Régulation de l’activité et de la disponibilité de DnaA: -Afin d’initier la réplication au moment approprié dans le cycle cellulaire, la quantité de DnaA, plus particulièrement celle de DnaA-ATP, disponible pour interagir avec oriC, doit être étroitement régulée. -Cette régulation se fait par différents mécanismes coordonnés qui sont liés au mouvement des fourches de réplication et à différentes séquences d’ADN qui interagissent avec DnaA.  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Régulation de l’activité et de la disponibilité de DnaA: -Le mouvement des fourches joue un rôle important dans la régulation de DnaA de trois façon différentes: 1- DnaA-ATP attaché au chromosome est inactivé par un mécanisme appelé RIDA (Regulatory Inactivation of DnaA-ATP). 2-La duplication de séquences génomiques interagissant avec DnaA, incluant le site de haute capacité, datA, va titrer les protéines DnaA libres pour ainsi réduire sa disponibilité. 3-La duplication (réplication) de régions chromosomiques spécialisées appelées DARS (DnaA Recharging Sites) stimulent la transformation de DnaA-ADP en DnaA-ATP  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. RIDA: -L’hydrolyse de l’ATP de DnaA est accélérée par l’interaction avec la protéine Hda (structure très semblable à DnaA), lorsque cette dernière interagit avec la β-clamp (gène dnaN) du réplisome sur l’ADN (donc à la fourche de réplication) Pour RIDA, seulement la forme β-clamp chargé sur l’ADN est active. -La forme β-clamp en solution ne peut donc favoriser l’hydrolyse de l’ATP de DnaA-ATP. -Il s’agit donc d’un mécanisme de régulation par rétro-inhibition : DnaA-ATP est inactivée suite à son action pour initier la réplication. -Les mutant déficients pour ce mécanisme de régulation souffrent de sur-initiation de la réplication qui est létale dans un milieu riche. -Mécanisme le plus important de régulation de DnaA et le plus répandu chez les bactéries.  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. DARS (DnaA Reactivation Sequences): -Il s’agit d’un mécanisme pour promouvoir l’accumulation de DnaA-ATP. -Il y a deux séquences DARS sur le chromosome qui sont assez éloignées de oriC et assez éloignées l’une par rapport à l’autre. -Trois boîtes DnaA rapprochées dont deux en orientations opposées. -Cette configuration stimule l’enlèvement du nucléotide de DnaA-ADP pour ainsi libérer DnaA. -DnaA libre interagit avec l’ATP pour former DnaA-ATP (à cause de la concentration nettement plus élevée d’ATP que d’ADP dans la cellule, surtout dans un milieu riche). -La perte de DARS cause un délai dans l’initiation de la réplication durant le cycle cellulaire.  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. La titration de DnaA: -Il y a plus de 300 boîtes DnaA sur le chromosome de E.coli. -Le locus datA a une très haute capacité pour DnaA (60 à 300 molécules). -datA est assez proche de oriC, soit à environ 450 kb plus loin et est dupliqué proche de la fin de la période de séquestration. -La haute efficacité de datA semble du haut fait que, tout comme à oriC, c’est surtout DnaA-ATP qui est titré. -E. coli ne tolère pas un ajout de plusieurs copies de datA (e.g. sur un plasmide). -Une souche sans le locus datA pousse normalement mais a un phénotype d’initiation asynchrone, et on note également une augmentation de la fréquence d’initiation. Initiation de la réplication du chromosome bactérien.  Regulatory DNA elements involved in replication initiation on the E. coli genome. (A) Schematic representation of the genomic loci of oriC, datA, DARS1, and DARS2 (and terC) in the 4.6 Mb circular E. coli genome, with positions also indicated on the scale of 0–100 min. (B) Structures of datA, DARS1, and DARS2. Open or gray bars indicate minimal regions. Triangles represent 9 bp DnaA-binding sites (DnaA boxes). Filled squares represent IHF- binding sites (IBS; shown in orange) and a Fis- binding site (FBS; shown in purple). Minimal datA consists of DnaA boxes 2, 3, and 7 and a single IBS. DnaA box 4 stimulates DDAH in vitro. DARS1 and DARS2 both have core regions containing DnaA boxes I–III. DARS2 also contains additional DnaA boxes and regulatory IBS and FBS. IBS et FBS: respectively, IHF- and FIS-binding sites. Katayama T, Kasho K, Kawakami H. The DnaA Cycle in Escherichia coli: Activation, Function and Inactivation of the Initiator Protein. Front Microbiol. 2017 Dec 21;8:2496. doi: 10.3389/fmicb.2017.02496. PMID: 29312202; PMCID: PMC5742627. Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Régulation de l’activité et de la disponibilité de DnaA: The regulatory cycle of DnaA. (A) Schematic presentation of the regulatory cycle of DnaA. ATP-DnaA forms oligomers on oriC with the aid of integration host factor (IHF) and DnaA interacting protein DiaA, and initiates replication (period in light yellow). After initiation, ATP- DnaA is converted to replication-inactive ADP-DnaA (RIDA) and datA- dependent DnaA-ATP hydrolysis (DDAH) systems (period in light blue). RIDA involves Hda protein and the clamp subunit of DNA polymerase III holoenzyme, and DDAH involves the datA locus and IHF. DnaA-reactivating sequence (DARS1 and DARS2) loci stimulate nucleotide exchange of ADP-DnaA and regenerate ATP-DnaA (period in light red). IHF binds to specific sites in oriC, datA, and DARS2 in a cell- cycle-coordinated manner. Fis binds to DARS2 in log-phase cells. (B) Growth-phase coordination of regulation of Fis expression. The cellular level of Fis varies through the growth phases, and is much higher in exponential-phase cells (enabling Fis binding to DARS2) than in stationary-phase cells. By contrast, the cellular level of IHF is highest in stationary-phase cells. Katayama T, Kasho K, Kawakami H. The DnaA Cycle in Escherichia coli: Activation, Function and Inactivation of the Initiator Protein. Front Microbiol. 2017 Dec 21;8:2496. doi: 10.3389/fmicb.2017.02496. PMID: 29312202; PMCID: PMC5742627.  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Régulation de l’activité et de la disponibilité de DnaA: Nouveaux éléments: 1- Protéine DiaA (DnaA-initiator-associating protein) active DnaA-ATP pour son interaction à oriC. 2-IHF a un effet positif à oriC, datA et DARS2. 3-FIS a un effet positif à DARS2. Trouver l’énoncé qui est faux à propos de la régulation de l’initiation de la réplication à oriC: A. Immédiatement après l’initiation de la réplication, les séquences GATC sont hémi- méthylées dans la région oriC. B. La protéine Hda est un analogue de DnaA et permet le chargement d’ATP sur cette dernière. C. Le locus dat contribue à la répression de l’initiation à oriC. D. Les séquences DARS permettent d’augmenter la quantité de DnaA-ATP dans la cellule. E. Aucune de ces réponses.  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Système alternatif de chargement de l’hélicase réplicative pour initier la réplication en dehors de oriC: Initiation de la réplication 1-Ouverture des brins d’ADN 2-Chargement de l’helicase replicative 3-Chargement du réplisome  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Système alternatif de chargement de l’hélicase réplicative pour initier la réplication en dehors de oriC: le système PriA-dépendant: -PriA est une protéine qui a d’abord été identifiée comme étant essentielle pour initier la réplication de l’ADN simple brin du phage X174 in vitro. -Il est toutefois peu probable que ce soit le rôle de cette protéine. -Des études génétiques ont démontré que l’inactivation du gène priA est presque létale sur milieu riche et donne des cellules filamenteuses avec un ADN mal distribué dans la cellule: phénotypes typiques de cellules ayant de la difficulté à compléter la réplication de leur chromosome. -L’introduction d’une mutation dnaB(Ts) rend le mutant priA non-viable même à la température permissive. Même chose pour gyrB(Ts). -En fait le système PriA permet le ré-assemblage de fourches de réplication lorsqu’une fourche de réplication arrêtée ne peut redémarrer (obstacles, cassures ADN).  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Système alternatif de chargement de l’hélicase réplicative pour initier la réplication en dehors de oriC: le système PriA-dépendant: -PriA permet le ré-assemblage de fourches en dehors de oriC via une interaction avec une jonction 3’ sur différents substrats qui sont soient des intermédiaires de recombinaison (boucle D ou D-loop) ou des intermédiaires de réplication (fourches). Substrats pour la réplication PriA-dépendante. Schematic representation of the DNA molecules recognized and acted upon by preprimosomal proteins in vitro and presumably in vivo. From top to bottom, ϕX174 PAS, D loop resulting from the RecA- mediated invasion of a parental molecule (dark blue and red lines) by a homologous DNA RecA filament (light blue line), Y structure mimicking a replication fork with a fully synthesized leading-strand end and a gap in the lagging strand, Y structure mimicking a replication fork with a fully synthesized lagging-strand end and a gap in the leading strand, Y structure mimicking a replication fork with fully synthesized leading- and lagging-strand ends (in Y structures, parental strands are shown as full lines and newly synthesized strands are shown as dashed lines), and R loop (the RNA molecule is drawn as a green line). The preprimosomal proteins shown to assemble a primosome in these structures are indicated on the right. PriC action on PAS was deduced from the increased activity of the PriA-PriB-DnaT proteins in its presence. The 3′-5′ helicase function of PriA is required for its action on Y molecules with a dsDNA lagging strand. Replication restart after replication fork reversal. Bénédicte Michel, and Steven J. Sandler J. Bacteriol. 2017; doi:10.1128/JB.00102-17  Initiation de la réplication du chromosome bactérien. Réplication à partir d’un R-loop: -Survient en phase stationnaire pour permettre la survie des cellules et faciliter l’accumulation de mutations adaptatives. -Mode de réplication découvert dans des mutants rnhA qui ne produisent pas la RNase H, enzyme qui dégrade l’ARN dans les R-loops. Mode de réplication nommé cSDR (constitutive stable DNA replication), car il est insensible à l’inhibition de la synthèse protéique contrairement à DnaA/oriC. - + R-loop  DnaA/oriC PriA/R-loop Topo --- I oriC RecA (ii) RNase HI DUE (i) DnaA binding to DnaA boxes DNA pol I (iii) DUE PriA-dependent (iv) primosome (v) Helicase loader (DnaC) (vi) PriA interagit avec une jonction Helicase (DnaB) (vii) 3’ ADN mais pas ARN. C’est pour Primase (DnaG) cela que l’ARN du R-loop doit (viii) d’abord être utilisé Par PolI pour faire de l’ADN. Replisome (Pol III) Identification des origines de réplication par séquençage quantitatif de nouvelle génération. Réplication à partir de: oriC R-loops fimD oriC DnaA Enrichment R-loop TerA TerB MFA: marker frequency analysis NGS (Illumina) Dimude JU et al., MBio. 2015 Nov 3;6(6):e01294-15. Trouver l’énoncé qui est faux au sujet de la réplication à partir de R- loops: A. La réplication à partir de R-loops requiert les protéines RecA et PriA. B. PriA interagit avec l’extrémité 3’ de l’ARN du R- loop. C. Un R-loop se forme lorsque l’ARN naissant durant la transcription, se ré-apparie avec le brin ADN matrice en arrière de l’ARN polymérase. D. DnaB et pol III sont nécessaires pour la réplication à partir des R-loops. E. Aucune de ces réponses. Cycle cellulaire et division Marc Drolet, 22 novembre 2024  Le cycle cellulaire bactérien. Le cycle cellulaire. Cycle cellulaire bactérien: 1-croissance 2-masse d’initiation 3-réplication (initiation) 4-réplication (élongation) 5-réplication (terminaison) 6-décaténation 7-ségrégation/septum 8-division  Le cycle cellulaire bactérien. -Une régulation dans le temps et dans l’espace des différentes étapes du cycle cellulaire est essentielle au bon déroulement de ce dernier. -Ainsi, pour une bactérie qui se divise par scission binaire, il est important de coordonner correctement la réplication de l’ADN, la décaténation et la segregation des chromosomes, avec la division cellulaire, afin que chacune des cellules filles reçoive une copie du chromosome. -Il est également important de coordonner la réplication de l’ADN et la division cellulaire avec l’augmentation de la masse cellulaire. -De plus, il est primordial que les deux chromosomes nouvellement synthétisés soient distribués aux deux pôles cellulaires et que la division soit initiée au centre de la cellule. Trouver l’énoncé qui est faux concernant le cycle cellulaire: A. La ségrégation des chromosomes précède la décaténation. B. Le septum ne se forme pas s’il n’y a pas eu de ségrégation des chromosomes. C. Une régulation dans l’espace fait référence au positionnement du septum et des chromosomes répliqués dans la cellule. D. L’initiation de la réplication est coordonnée avec la masse cellulaire. E. Aucune de ces réponses.  Le cycle cellulaire bactérien. Quand la réplication survient durant le cycle cellulaire? Problème majeur pour l’étude du cycle cellulaire chez la majorité des bactéries: -La population bactérienne est hétérogène: les cellules sont à des stades différents de leur cycle cellulaire. -Très difficile de synchroniser les cellules: Si on recueille des cellules de même taille: la synchronisation du début est rapidement perdue:  Le cycle cellulaire bactérien. Méthodes pour étudier le cycle cellulaire: 1-« Baby machine » ou technique de l’élution de la membrane: -Cette approche consiste d’abord à ajouter de la thymine radioactive (pour marquer l’ADN) à une culture bactérienne en croissance puis à fixer les bactéries sur une membrane. -Quand les cellules se sont divisées sur le filtre, une des deux cellules filles ne sera plus attachée à ce filtre et sera relâchée dans le milieu. -Toutes les cellules filles relâchées à un temps donné seront des cellules nouveau-nées et seront donc du même âge. -Cela signifie que les cellules qui se sont divisées pour relâcher les nouvelles cellules à un temps donné sont aussi du même âge et ont leur ADN au même stade de réplication. -La quantité de radioactivité dans les cellules relâchées est donc une mesure de la quantité d’ADN chromosomique répliquée dans les cellules de cet âge. Le cycle cellulaire bactérien. Le cycle cellulaire bactérien.  Le cycle cellulaire bactérien. Méthodes pour étudier le cycle cellulaire: 1-« Baby machine » ou technique de l’élution de la membrane (suite): -Cette expérience fut effectuée dans différentes conditions de croissance pour montrer comment la réplication et la division cellulaire sont coordonnées en fonction de la richesse du milieu de culture. -De cette façon les paramètres I, C et D furent établis de même que la relation entre l’initiation de la réplication et la masse cellulaire (masse d’initiation).  Le cycle cellulaire bactérien. Le cycle cellulaire bactérien peut être séparé en trois périodes : I : le temps entre deux évènements d’initiation de réplication (ou deux évènements de division cellulaire). La réplication du chromosome est normalement initiée à une masse cellulaire particulière par oriC (origine de réplication chez E. coli) : masse d’initiation : devient de plus en plus court au fur et à mesure que la vitesse de croissance augmente : cette valeur est proche du temps de génération.  Le cycle cellulaire bactérien. Le cycle cellulaire bactérien peut être séparé en trois périodes : C : le temps nécessaire pour répliquer le chromosome en entier. C demeure presque toujours constant (environ 40 minutes) et est donc indépendant de la vitesse de croissance (ou richesse du milieu de culture).  Le cycle cellulaire bactérien. Le cycle cellulaire bactérien peut être séparé en trois périodes : D : le temps entre la fin de la réplication du chromosome et le moment de la division cellulaire. D demeure presque toujours constant (environ 20 minutes) et est donc indépendant de la vitesse de croissance (ou richesse du milieu de culture). Le cycle cellulaire bactérien.  Le cycle cellulaire bactérien. Le cycle cellulaire bactérien peut être séparé en trois périodes : Dans un milieu riche, lorsque I est plus court que C, il y aura plus qu’une origine de réplication par chromosome. Il s’en suivra un effet de dosage génique pour les gènes à proximité de oriC. Le cycle cellulaire bactérien. Trouver l’énoncé qui est vrai concernant les trois périodes du cyle cellulaire: A. La période C, le temps pour répliquer le chromosome, sera plus courte dans un milieu riche afin que chaque cellule fille reçoive un chromosome complet. B. Il y a un effet de dosage génique des gènes à proximité d’oriC dans un milieu riche. C. Le temps de division de 40 minutes, est toujours constant. D. Le temps requis pour la division doit obligatoirement être plus long que le temps requis pour répliquer le chromosome, afin que chaque cellule fille reçoive un chromosome. E. Aucune de ces réponses.  Le cycle cellulaire bactérien. Méthodes pour étudier le cycle cellulaire: 2-La cytométrie en flux: -La cytométrie en flux permet de déterminer la masse d’une cellule prise individuellement ainsi que sa quantité d’ADN. -Cette technique fut utilisée entre autres pour montrer que dans un milieu riche (cellules ayant donc plus d’une région oriC) la réplication était initiée en même temps à toutes les oriC, confirmant ainsi le lien entre la masse cellulaire et l’initiation de la réplication.  Le cycle cellulaire bactérien. Méthodes pour étudier le cycle cellulaire: 2-La cytométrie en flux: -permet de démontrer directement le lien entre l’initiation à oriC et la masse cellulaire. -Dans un milieu riche les cellules ont plusieurs origines de réplication. -Si elles sont toutes initiées en même temps, à la fin des rondes de réplication (rifampicine ou chloramphénicol pour bloquer d’autres initiations) on aura 2n chromosomes par cellule ou n est le nombre d’origines (oriC) au départ. -On aura donc des cellules avec 2, 4, 8 chromosomes  Le cycle cellulaire bactérien. Méthodes pour étudier le cycle cellulaire: 2-La cytométrie en flux: Timing of initiation of chromosome replication in individual Escherichia coli cells. Skarstad K, Boye E, Steen HB. EMBO J. 1986 Jul;5(7):1711-7.  Le cycle cellulaire bactérien. Méthodes pour étudier le cycle cellulaire: 2-La cytométrie en flux: Timing of initiation of chromosome replication in individual Escherichia coli cells. Skarstad K, Boye E, Steen HB. EMBO J. 1986 Jul;5(7):1711-7. Patrons de cytométrie en fonction de la richesse du milieu. Notez à droite l’augmentation du nombre de chromosomes en fonction de la richesse du milieu.  Le cycle cellulaire bactérien. Une mutation dans oriC confère un phénotype asynchrone dans un mutant topA (topo I). Usongo V, Drolet M (2014) Roles of Type 1A Topoisomerases in Genome Maintenance in Escherichia coli. PLOS Genetics 10(8): e1004543. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004543 http://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1004543 Trouver l’énoncé qui est faux concernant la cytométrie en flux et le cycle cellulaire: A. Après l’ajout de rifampicine ou de chloramphénicol, le nombre de chromosome par cellule à la fin de la réplication devrait être égal à 2n (n: nombre d’oriC). B. Après l’ajout de chloramphénicol la seule réplication détectée sera celle initiée avant son ajout. C. Des cellules ayant l’équivalent de 8 chromosomes seront détectées en quantité significative seulement dans les milieux les plus riches. D. La rifampicine inhibe l’initiation de la réplication parce que la transcription peut stimuler directement l’ouverture à oriC et est essentielle pour la synthèse de DnaA. E. Aucune de ces réponses. * Le cycle cellulaire bactérien. La décaténation et la ségrégation des chromosomes: -immédiatement après la terminaison de la réplication du chromosome: 1-La décaténation et la résolution des dimères de chromosomes: séparation physique des chromosomes reliés entre eux à cause de la recombinaison homologue et de l’entrelacement (caténation). Protéines impliquées: FtsK, XerCD, Topo IV 2- La ségrégation des chromosomes: mouvement des chromosomes répliqués et séparés physiquement, vers les pôles cellulaires. Protéines impliquées: FtsK, gyrase (pour le surenroulement négatif: condensation), MukB et autres (condensation).  Le cycle cellulaire bactérien. La décaténation des chromosomes: -À cause de leur grande taille, la séparation des chromosomes, afin qu’éventuellement ils puissent être distribués vers les cellules filles (ségrégation), n’est pas une tâche facile. -Méthode pour son étude: microscopie à fluorescence pour: -visualiser le nucléoide (chromosome(s)). -visualiser des protéines interagissant avec des sites spécifiques sur le chromosome, qui sont fusionnées avec une protéine GFP (« green fluorescence protein »).  Le cycle cellulaire bactérien. La résolution des dimères de chromosomes: -Résolution de dimères de chromosomes (15% de la population cellulaire) qui sont dus à la recombinaison homologue qui survient suite à la réparation des fourches de réplication: 1-en trans: XerC et XerD: recombinases site-spécifique 2-en cis: site dif (répliqué) situé au centre de la région Ter du chromosome (terminaison de réplication) -Pourquoi le site dif est situé à cet endroit? -synchronisation avec la terminaison de la réplication -pour s’assurer qu’il n’y ait qu’un seul site dif jusqu’au moment qui précède le début de la division cellulaire. En fait, l’action de XerCD à dif est dépendante de la formation du septum de division via une interaction avec FtsK (Fts: « Filament thermo-sensitive »)  Le cycle cellulaire bactérien. La résolution des dimères de chromosomes: -Pour être actif à dif, XerCD doivent interagir avec FtsK. -La localisation de FtsK au septum limite le processus de résolution des dimères dans l’espace et dans le temps, quand les chromosomes sont entrain de se déplacer du septum vers les cellules filles, un processus facilité et coordonné par FtsK.  Le cycle cellulaire bactérien. La ségrégation des chromosomes: -En fait, le processus de résolution des dimères ne peut pas par lui- même déplacer les chromosomes vers les cellules filles, ce qui pourrait avoir comme effet d’entraîner la cassure des chromosomes par le septum de division (effet « guillotine ») -La protéine FtsK est une translocase ADN qui peut « pomper » l’ADN pour déplacer les deux sites dif dans un dimère de chromosome vers le septum au milieu de la cellule, avant qu’ils recombinent (XerCD), pour ainsi faciliter la ségrégation vers les cellules filles.  Le cycle cellulaire bactérien. La ségrégation des chromosomes: -Comment la protéine FtsK arrive à pomper l’ADN dans la bonne direction? -Cela se fait grâce à des séquences KOPS (FtsK-Orientation Polar Sequence) sur l’ADN que FtsK utilise pour s’orienter. -Les séquences KOPS sont orientées pour faire en sorte qu’elles seront lues seulement dans la direction oriC vers dif par FtsK. -De cette façon les sites dif seront toujours pompés vers le centre.  Le cycle cellulaire bactérien. La ségrégation des chromosomes: FtsK-dif  Le cycle cellulaire bactérien. La ségrégation des chromosomes: FtsK-dif  Le cycle cellulaire bactérien. La décaténation des chromosomes: Élimination des caténanes de chromosomes (100% des cellules): Une des sous-unités de TopoIV interagit avec FtsK pour réguler la décatenation complète des chromosomes dans le temps (juste avant début de division) et dans l’espace (au centre de la cellule).  Le cycle cellulaire bactérien. La condensation des chromosomes pour permettre leur ségrégation: -La séparation physique des chromosomes au centre de la cellule grâce à l’action de FtsK, va faciliter la ségrégation des chromosomes vers les cellules filles via leur condensation.  Le cycle cellulaire bactérien. La condensation des chromosomes pour permettre leur ségrégation: -Par la gyrase via le surenroulement négatif -Par la protéine MukB, une condensine de la famille SMC (« structural maintenance of chromosome ») d’abord identifiée chez les eucaryotes. -Topo IV interagit également avec MukB pour faire en sorte que des caténanes encore présents n’empêche pas le processus de condensation.  Le cycle cellulaire bactérien. La condensation des chromosomes pour permettre leur ségrégation: Trouver l’énoncé qui est vrai à propos de la décaténation et la ségrégation des chromosomes: A. XerCD est responsable de la décaténation, alors que Topo IV sépare les dimères de chromosomes. B. FtsK fait le lien entre la ségrégation des chromosomes et la division cellulaire. C. Les séquences KOPS permettent à FtsK de déplacer les sites dif vers les pôles cellulaires. D. MukB condense les chromosomes en stimulant l’action de Topo IV et gyrase. E. Aucune de ces réponses.  La division cellulaire. Génétique de la division cellulaire. -Les premiers mutants de division ont été isolés chez E. coli dans les années 1970. -Il s’agissait de mutants conditionnels thermosensibles: température permissive à 30oC et non-permissive à 42oC. -L’observation de ces mutants à la température non-permissive a permis d’établir l’ordre d’action des gènes dans le processus de division: gènes précoces (début de la formation du septum) jusqu’aux gènes tardifs (séparation des cellules filles). Également, mutants dans le positionnement du septum (min). -L’observation de ces mutants a également permis d’identifier des gènes impliqués dans la ségrégation ou partition des chromosomes (appelés mutants par). -Les mutants thermosensibles de division ont été appelés mutants fts pour « filamentation thermosensible ». Il forment donc de très longs filaments à la température non-permissive.  La division cellulaire. Génétique de la division cellulaire. mutants thermosensibles par: défaut de ségrégation des chromosomes fts: défaut de division cellulaire  La division cellulaire. Génétique de la division cellulaire. La division cellulaire. Génétique de la division cellulaire.  La division cellulaire. Génétique de la division cellulaire. -Une procédure plus récente consiste à placer un gènes fts sous le contrôle d’un promoteur Pbad inductible à l’arabinose. -En premier lieu on inactive la copie chromosomique correspondante du gène fts, soit par délétion ou par intégration d’une cassette de résistance à un antibiotique. Cela s’effectue en présence d’arabinose pour permettre la synthèse de la protéine Fts à partir du plasmide. -En second lieu on fait pousser le mutant en présence d’arabinose jusqu’en phase log, pour ensuite centrifuger les cellules et les resuspendre dans un milieu sans arabinose et avec glucose (répression catabolique) -On peut alors observer les conséquences de l’absence du produit du gène sur différents phénotypes dont la viabilité et la morphologie cellulaire.  La division cellulaire. Génétique de la division cellulaire. -Avec de tels systèmes et des fusions de protéines de division avec GFP il a été possible d’aborder le problème de la chronologie des évènements dans la formation du septum et la division. -la génétique, combinée à l’étude des cellules en microscopie optique, a permis initialement de déterminer l’ordre d’action de certains gènes fts (une douzaine de gènes essentiels) dans le processus de division cellulaire. Des techniques d’immunofluorescence et de marquage spécifique de protéines (fusion « GFP » : green fluorescent protein ») ont permis de confirmer ces résultats et de les détailler davantage. -Différentes études ont montré que le premier gène à entrer en action est ftsZ. -L’utilisation de microscopie à fluorescence et de fusion de protéines de division avec la GFP (« green fluorescent protein ») ont permis de localiser les autres protéines de division et de déterminer l’ordre d’assemblage de celles-ci. La division cellulaire. La division cellulaire.  La division cellulaire. Génétique de la division cellulaire. -Il a été montré qu’en absence de ftsZ, aucune autre protéine de division n’est localisée au site de division.  La division cellulaire. La localisation de FtsZ n’est pas altérée dans des mutant ftsA ou zipA. ZipA- FtsA- Trouver l’énoncé qui est vrai concernant l’étude de la division cellulaire chez E. coli: A. Tous les mutants thermosensibles qui forment de longs filaments sont des mutants fts de division cellulaire. B. La morphologie des différents mutants fts en microscopie a permis de découvrir que la protéine FtsK était la première impliquée dans la formation du septum. C. Le système pBAD permet de construire des mutants fts conditionnels indépendants de la température. D. Les mutants par forment de longs filaments et ces gènes sont donc impliqués directement dans la division cellulaire. E. Aucune de ces réponses.  La division cellulaire. FtsZ: -La protéine centrale est FtsZ, conservée chez les procaryotes et Archaea. -FtsZ est à la base de la formation du septum de division et maintien la cohésion du cytosquelette. -FtsZ: homologue de la tubuline (protéines structurelles des microtubules et constituant majeur du cytosquelette des eucaryotes) -environ 20,000 par cellule (740 FtsA (famille actine du cytosquelette aussi impliquée dans la formation du septum), 1250 ZipA et 30 à 50 pour les autres protéines de division)  La division cellulaire. FtsZ: -FtsZ est une protéine qui lie le GTP et qui possède une activité GTPase. L’attachement du GTP à la protéine FtsZ mène à la polymérisation et à la formation des anneaux Z in vivo. -Ces longs filaments FtsZ, dont la formation est induite par le GTP, ressemblent beaucoup aux microtubules eucaryotes. -Des anneaux FtsZ sont présents aux sites de division future avant même le début de l’invagination du septum. -Aucune autre protéine n’est assemblée au site de division en absence de FtsZ.  La division cellulaire. FtsZ:  La division cellulaire. MreB: -MreB: homologue de l’actine : elle forme des filaments du cytosquelette qui se localisent en structures hélicoidales sur le côté interne de la membrane cellulaire. -MreB est donc un élément du cytosquelette impliquée dans la morphologie des bactéries. -Elle joue un rôle clé dans la croissance du peptidoglycan -Elle interagit avec FtsZ pour transférer au niveau du septum en formation, les enzymes impliqués dans la synthèse longitudinale de la paroi, afin qu’ils synthétisent la paroi de division. -Il y aura donc un couplage entre division et élongation qui serait initié par l’interaction FtsZ-MreB. La division cellulaire.  La division cellulaire. Protéines du divisome: -cytosoliques: FtsZ, FtsA, ZipA et ZapA (Zip: FtsZ interacting Protein et Zap: FtsZ associated protein) -membranaires: 1-avec un seul domaine transmembranaire: (FtsI, FtsL, FtsQ, FtsN, FtsB) 2-avec plusieurs domaines transmembranaires: FtsK et FtsW. -FtsI , FtsL et FtsQ requisent pour assemblage du septum -Le domaine périplasmique de FtsI (aussi appelé PBP3 (PBP: penicillin binding protein) est responsable de l’activité transpeptidase impliquée dans la synthèse du peptidoglycan. -Plusieurs bactéries résistantes aux pénicillines ont une mutation dans FtsI.  La division cellulaire. Protéines du divisome: -FtsL, FtsQ et FtsB forment un complexe trimérique qui connectent les protéines assemblées précocement (proto-ring: anneau Z avec protéines stabilisatrices, FtsA et ZipA) et celles assemblées tardivement, tel que FtsN. -FtsN se positionne tardivement dans le divisome et sa fonction est associée à son domaine périplasmique. -Un manque de FtsN cause le démantèlement des autres membres du divisome y compris le proto-ring. -FtsN interagit avec de nombreuses autres protéines du divisome et avec certaines muréine-synthétases. La division cellulaire. La division cellulaire. Trouver l’énoncé qui est faux concernant la division cellulaire: A. La formation de l’anneau Z à partir de la membrane cytoplasmique implique les protéines FtsZ, FtsA et ZipA. B. MreB contact FtsZ pour permettre le transfert de la machinerie de synthèse du peptidoglycan vers le divisome. C. Les protéines FtsQ, B et L font partie du connecteur périplasmique qui permet l’interaction avec les protéines impliquées dans la synthèse du peptidoglycan. D. Il y a environ 20,000 monomères de FtsZ par cellule. E. Aucune de ces réponses.  La division cellulaire. Régulation dans l’espace et dans le temps: 1- Dans le temps: occlusion du nucléoide: il n’y aura pas formation du septum tant et aussi longtemps que du chromosome sera présent dans le centre de la cellule (la protéine SlmA s’associe préférentiellement avec l’ADN à proximité des pôles (oriC) et un gradient se forme; donc à la fin lorsqu’il y a moins d’ADN le blocage diminue. SlmA inhibe FtsZ 2- Dans l’espace: système Min: MinD s’attache à la membrane et à MinC qui est une protéine inhibant FtsZ. MinE fait oscillé continuellement le complexe MinCD entre les pôles inhibant la polymérisation de FtsZ aux pôles. MinE, forme un anneau autour du centre cellulaire et prévient l’action et la localisation de MinCD à cet endroit. En conséquence, FtsZ peut polymériser seulement à cet endroit.  La division cellulaire. Mutants min: minicells Les mutant min de même que la surproduction de FtsZ font en sorte que le septum est formé à n’importe laquelle position dans la cellule.  La division cellulaire. Le système Min fait en sorte que la formation du septum se fait au milieu de la cellule: MinC: protéine qui interagit avec FtsZ pour inhiber sa polymérisation (anneau Z); elle déstabilise également les polymères de FtsZ. MinD: une ATPase membranaire qui est nécessaire pour l’activité de MinC. Confère à MinC la sensibilité à MinE et est requise pour localiser MinE au centre la cellule. MinE: permet la localisation de MinCD aux pôles. MinE est concentrée au centre de la cellule sous forme d’anneau pour détacher graduellement MinCD de la membrane, ce qui permet la formation de l’anneau Z au centre. MinE cause l’hydrolyse de l’ATP de MinD pour donner MinD-ADP qui se retrouve dans le cytoplasme, est alors reconvertie en MinD- ATP qui se lie à la membrane à un pôle. Trouver l’énoncé qui est vrai concernant le système min: A. MinC est une ATPase membranaire. B. MinD interagit avec FtsZ pour empêcher sa polymérisation. C. MinE permet la formation du septum au centre la cellule en délocalisant MinC. D. MinD-ADP se retrouve dans le cytoplasme à cause MinC. E. Aucune de ces réponses. La division cellulaire. Occlusion du nucléoide: -NOC-NBS chez B. subtilis SLM-SBS chez E. coli -système pour empêcher la formation du septum lorsque l’ADN est encore présent au centre de la cellule. Ces protéines lorsque présentent sur l’ADN causent le désassemblage des polymères de FtsZ. La division cellulaire. Occlusion du nucléoide: Mécanisme d’action de SlmA sur FtsZ. L’attachement sur l’ADN démasque le site d’interaction avec FtsZ. Le mutant FtsZ K190V est résistant à l’action de SlmA. Trouver l’énoncé qui est faux au sujet du mécanisme d’occlusion du nucléoide: A. En absence de tels mécanismes, l’ADN encore présent au centre de la cellule serait fragmenté (effet « guillotine ») B. SlmA est présente chez E. coli. C. Plus on se rapproche de la région Ter, plus il y a de sites d’interaction avec la protéine SlmA. D. L’interaction de la protéine SlmA avec l’ADN permet son interaction avec FtsZ. E. Aucune de ces réponses. Croissance et composition cellulaire. MCB2992, 29 novembre 2024  Croissance et composition cellulaire. La croissance d’une population bactérienne va dépendre de plusieurs facteurs: -Facteurs physiques: température, le pH, la pression osmotique, la présence d’oxygène -Facteurs chimiques: composés inorganiques ou organiques -Génotype de la souche bactérienne  Croissance et composition cellulaire. La température Notez que la température optimale de croissance est toujours plus proche de la température maximale que de la température minimale.  Croissance et composition cellulaire. Le pH Notez que le pH intracellulaire est toujours neutre.  Croissance et composition cellulaire. Pression osmotique.  Croissance et composition cellulaire. Oxygène Croissance et composition cellulaire. Oxygène Croissance et composition cellulaire. Oxygène Aération et croissance de beaucoup supérieure dans un erlenmeyer vs tube.  Croissance et composition cellulaire. Milieux minimal typique pour E. coli:  Croissance et composition cellulaire. Milieux riche typique pour E. coli: Tryptone est composé d’acides aminés (hydrolysat de caséine): azote et carbone Yeast Extract: source d’azote et de vitamines Trouver l’énoncé qui est faux concernant les facteurs qui affectent la croissance microbienne: A. Le pH intracellulaire est toujours proche de la neutralité. B. Les bactéries micro-aérophiles n’ont pas d’enzymes pour se protéger des dérivés toxiques de l’oxygène. C. Les hétérotrophes utilisent des composés organiques ou inorganiques comme source de carbone. D. La température optimale est toujours plus proche de la température maximale que de la température minimale. E. Aucune de ces réponses.  Croissance et composition cellulaire. Croissance exponentielle: -division binaire: 2n n: nombre de générations (divisions) La croissance est exponentielle N=N0 x 2 t/T N: nombre de cellules au moment t N0: nombre de cellules lors de l’ensemencement T: temps nécessaire au doublement de la population (temps de génération) Exemple: N0= 1000, t= 5 heures (300 min.) et T (temps de génération)= 30 minutes: 1000 x 2300/30= 1000 x 210= 1 024 000 cellules.  Croissance et composition cellulaire. Croissance exponentielle:  Croissance et composition cellulaire. Croissance exponentielle: Croissance et composition cellulaire.  Croissance et composition cellulaire. L’échelle logarithmique permet d’illustrer le taux d’augmentation du nombre de cellules et non pas le nombre brut de cellules. Croissance et composition cellulaire. Croissance exponentielle: -Temps de génération g: temps pour une division -Taux de croissance k: Nombre de générations (divisions) par heure  Croissance et composition cellulaire. Méthodes pour mesurer la croissance: 1-Turbimétrie: Mesure spectroscopique de la diffusion de la lumière par la suspension à étudier (mesure de la masse cellulaire totale dans la population; DO600 nm)). Technique simple et rapide mais qui suppose que la volume et la morphologie des cellules varient peu au cours de la croissance (cellules normales vs filaments). Ne dit pas non plus si toutes les cellules sont viables.  Croissance et composition cellulaire. Méthodes pour mesurer la croissance: 1-Turbimétrie:  Croissance et composition cellulaire. Méthodes pour mesurer la croissance: 2- Unités viables (dénombrement des colonies): La seule technique qui mesure les bactéries viables. Le dénombrement des colonies consiste à déposer des échantillons de la suspension à étudier, de volumes de dilution connus, sur des milieux nutritifs solides dans des boîtes de pétri. Chaque cellule forme une colonie.  Croissance et composition cellulaire. Méthodes pour mesurer la croissance: 2- Unités viables (dénombrement des colonies):  Croissance et composition cellulaire. Méthodes pour mesurer la croissance: Nombre de cellules DO600 Unités viables 4 4 4 1 Trouver l’énoncé qui est vrai à propos de la croissance bactérienne. A. Le temps de génération est le nombre de divisions par heure. B. La turbimétrie permet de révéler la filamentation des cellules. C. Dans N=N0 x 2 t/T, T= le temps de génération et t= le temps total de croissance. D. La représentation arithmétique de la croissance permet de bien / illustrer la phase exponentielle. E. Aucune de ces réponses.  Croissance et composition cellulaire. Courbe de croissance 1 bactérie, temps de génération 20 min, 25 hrs: 80,000 tonnes (porte- avion!) et 48 heures: masse de la terre!  Croissance et composition cellulaire. Courbe de croissance Beaucoup de mort sans lyse: observation en unités viables seulement  Croissance et composition cellulaire. Phase exponentielle: -Phase de croissance proprement dite. -Pendant cette période, les bactéries se développent et se divisent à la vitesse maximale possible par rapport à la composition du milieu de culture, aux conditions environnementales et à leur génotype.  Croissance et composition cellulaire. Phase exponentielle: -La vitesse de croissance est constante durant cette période. Il est alors possible de déterminer le temps de génération (temps pour une division et donc pour doubler la population bactérienne) et le taux de croissance (nombre de divisions par unité de temps).  Croissance et composition cellulaire. Phase exponentielle: -Pour chaque souche, le temps de génération, pour des conditions définies, est remarquablement constant et reproductible. -Pour E. coli cultivé à 37oC, il varie de 20 minutes (en milieu riche; e.g. LB) à près de 2 heures (en milieu minimal avec succinate comme source de carbone), en passant par 40-50 minutes dans un le même milieu minimal additionné de glucose à la place du succinate. -Par contre, dans son habitat naturel, le côlon, le temps de génération de E. coli est de 10 à 20 heures.  Croissance et composition cellulaire. Phase exponentielle: -Pour une espèce bactérienne donnée, une croissance plus rapide dans un milieu riche par rapport à un milieu pauvre est simplement due à une plus grande quantité de ribosomes par cellule dans un milieu riche et non pas due à une activité enzymatique augmentée. Ainsi, une plus grande quantité de ribosomes permettra à la bactérie de synthétiser plus de protéines par molécule d’ARN messager.  Croissance et composition cellulaire. Phase exponentielle: -Durant la phase exponentielle, la population bactérienne est uniforme en termes de propriétés chimiques et physiologiques. C’est donc une période idéale pour effectuer des études biochimiques et physiologiques.  Croissance et composition cellulaire. Phase de latence: -C’est un période d’adaptation des bactéries au nouvel environnement (milieu de culture en laboratoire). -La durée de cette phase dépend de plusieurs facteurs dont l’état physiologique de la population bactérienne (vieillesse de la culture), la composition du nouveau milieu de culture et les nouvelles conditions environnementales (pH, température, oxygène, etc.) par rapport aux paramètres précédents.  Croissance et composition cellulaire. Phase de latence: -Milieu riche à pauvre : phase de latence longue pour permettre à la bactérie de synthétiser les enzymes nécessaires à la fabrication des constituants de base (acides aminés, nucléotides, etc.) pour la synthèse des macromolécules (acides nucléiques et protéines).  Croissance et composition cellulaire. Phase de latence: -Milieu pauvre à riche : phase de latence plus courte mais tout de même présente principalement pour la synthèse d’un nombre suffisant de ribosomes qui permettra une croissance rapide en milieu riche.  Croissance et composition cellulaire. Phase de latence: -Lorsqu’une culture bactérienne en phase exponentielle est diluée dans un milieu de culture de composition identique la phase de latence sera absente.  Croissance et composition cellulaire. Phase de latence: -Une des protéines importantes pour la remise en marche du métabolisme est la protéine FIS. -C’est une protéine abondante de type histone qui reconnaît des séquences spécifiques sur l’ADN. -Elle est impliquée entre autre dans la transcription des ARNr et dans l’initiation de la réplication.  Croissance et composition cellulaire. Phase stationnaire: -La notion de phase stationnaire est directement issue de l’analyse des courbes de croissance obtenues en laboratoire. -Il suffit de comparer la concentration en sources de carbone d’un milieu naturel tel que l’océan (1 mg/L en surface et 0.5 mg/L en profondeur) aux 10 g/L fournis dans un milieu de culture de laboratoire pour comprendre que ces deux « mondes » ne sont pas identiques. -Dans les conditions naturelles, les cellules sont plus ou moins constamment dans des conditions assez semblables à la phase stationnaire définie dans les conditions expérimentales.  Croissance et composition cellulaire. Phase stationnaire: -Elle est le résultat d’un ensemble de processus variés: épuisement du milieu de certains éléments en concentrations limitantes et modification de facteurs physicochimiques tels que l’alcalinisation ou l’acidification du milieu. -Le nom de phase stationnaire est un peu trompeur, car il ne s’agit en aucun cas d’un arrêt total du métabolisme. -En fait, c’est un état dynamique durant lequel des cellules meurent et d’autres croissent, partiellement aux dépens des produits issus de la lyse des cellules mortes.  Croissance et composition cellulaire. Phase stationnaire: -Les cellules en phase stationnaire subissent des modifications importantes. -Elles sont notablement plus petites que les cellules en phase exponentielle et plus rondes (elles ressemblent à des cocci et la coloration de Gram les identifie comme Gram+) -On observe une condensation accrue de l’ADN sous l’action d’une autre protéine de type histone, Dps. -La majorité des cellules de la population n’ont qu’un seul chromosome car la réplication via oriC est arrêtée.  Croissance et composition cellulaire. Phase stationnaire: -Dans le cas de E. coli (et plusieurs autres espèces), la phase stationnaire préside la mise en place d’un programme de gestion de la carence nutritionnelle. -L’essentiel des modifications cellulaires observées est dû à l’expression de gènes sous le contrôle du facteurs S (RpoS).  Croissance et composition cellulaire. Phase stationnaire: -Ce régulateur transcriptionnel contrôle directement et indirectement l’expression de 10% du génome de E. coli. -Le rôle déterminant de RpoS est clairement démontré par le phénotype de mutants dépourvus de cette protéine: leur arrivée en phase stationnaire se traduit par une mort massive et rapide dès le début de cette phase. Trouver l’énoncé qui est faux concernant les phase de croissance des populations bactériennes. A. C’est pendant la phase exponentielle que la composition cellulaire est la plus semblable entre les cellules. B. La phase de latence permet aux cellules de s’adapter au nouvelles conditions de croissance. C. Le génotype n’est pas un facteur important pour la phase exponentielle / D. Dans leur environnement naturel, les bactéries sont la plupart du temps dans un état de phase stationnaire tel que défini en laboratoire. E. Aucune de ces réponses.  Croissance et composition cellulaire. Composition cellulaire en fonction du taux de croissance: Seule la quantité d’ARNr varie dramatiquement en fonction du taux de croissance.  Croissance et composition cellulaire. Composition cellulaire en fonction du taux de croissance: Deux observations majeures de la physiologie bactérienne « classique »: 1- équivalent génomes par cellule augmente avec le taux de croissance (masse d’initiation atteinte plus rapidement. 2-Le nombre de ribosomes augmente dramatiquement avec le taux de croissance.  Croissance et composition cellulaire. Composition cellulaire en fonction du taux de croissance: -Si les rapports ARNt/ADN et protéines/ADN sont relativement indépendants du taux de croissance, le rapport ARNr/ADN augmente fortement avec le taux de croissance. -Quand l’estimation est rapportée en quantité de chaque macromolécule par cellule, il apparaît que la quantité d’ADN en équivalent génome augmente avec le taux de croissance (initiation à oriC vs masse d’initiation) et que la quantité de ribosomes par génome augmente encore plus. -Le taux de synthèse protéique augmente avec la richesse du milieu à cause d’une augmentation du nombre de ribosomes et non pas à cause d’une augmentation de la vitesse de traduction.  Croissance et composition cellulaire. Enrichissement brutal (shift-up):  Croissance et composition cellulaire. Enrichissement brutal (shift-up): -Augmentation du taux de synthèse des ARN (surtout ARNr pour ribosomes) quasi instantanément, suivi de peu par celui des synthèses protéiques (mesurée en masse cellulaire totale: turbimétrie). -En revanche, la synthèse d’ADN comme la division cellulaire se poursuivent d’abord au rythme du milieu précédent. -Le taux de synthèse d’ADN augmente après environ 20 minutes (temps pour synthétiser ribosomes, DnaA et ATP) et le taux de division (colonies) notablement plus tard (étape suivante du cycle cellulaire).  Croissance et composition cellulaire. Appauvrissement brutal (shift-down):  Croissance et composition cellulaire. Appauvrissement brutal (shift-down): -L’appauvrissement rapide du milieu conduit à un arrêt brutal et de longue durée des synthèses d’ARN (trop de ribosomes) et de protéines. -Cet effet résultant probablement, entre autre, de la réponse stringente (ppGpp). -La synthèse d’ADN et la division suivent le rythme antérieur au transfert avant de ralentir à une nouvelle vitesse, en concordance avec celle des ARN et des protéines (DnaA, ATP). Trouver l’énoncé qui est faux au sujet de la composition cellulaire. A. La quantité d’équivalent génomes et de ribosomes par cellule est proportionnelle à la richesse du milieu. B. Il y a beaucoup plus de protéines par cellules dans un milieu riche que dans un milieu pauvre à cause d’une plus grande quantité de ribosomes. C. Lors d’un enrichissement brutal, il y a presqu’instantanément une augmentation du taux de synthèse d’ARNr. D. Lors d’un appauvrissement brutal, la synthèse d’ARN arrête immédiatement. E. Aucune de ces réponses. Dommages et réparation de l’ADN MCB 2992, 29 novembre 2024  La réparation de l’ADN -L’ADN des cellules en pleine croissance est régulièrement exposé à des agents chimiques et physiques qui peuvent causer des dommages de toutes sortes. -Ces dommages doivent être réparés afin, d’abord, d’assurer la survie des cellules, puis de permettre le transfert d’un génome intact aux cellules filles.  La réparation de l’ADN -Les premières évidences pour la présence de systèmes de réparation de l’ADN dans la cellule, furent obtenues en mesurant dans le temps la survie de cellules exposées à un agent endommageant l’ADN, principalement les rayons UV.  La réparation de l’ADN -Au lieu d’une droite, qui reflèterait l’absence de systèmes de réparation, une courbe avec un « coude » fut obtenue. -Une telle courbe signifiait que les cellules étaient capables de réparer des dommages à l’ADN jusqu’à un certain temps, à partir duquel la machinerie de réparation devenait surchargée, ce qui causait alors la mort cellulaire. La réparation de l’ADN  La réparation de l’ADN -Les mécanismes de réparation peuvent être classés sur la base de leur spécificité: 1-Les systèmes de réparation spécifiques: Ils reconnaissent des dommages spécifiques dans l’ADN.  La réparation de l’ADN -Les mécanismes de réparation peuvent être classés sur la base de leur spécificité: 2-Les systèmes de réparation non-spécifiques (généraux): Les systèmes de réparation généraux, plutôt que de reconnaître des dommages spécifiques dans l’ADN, reconnaissent des distorsions dans la double-hélice, qui sont causées, entre autre, par des mauvais appariements de bases.  La réparation de l’ADN 1-Les systèmes de réparation spécifiques: A- La désamination des bases -Un des dommages à l’ADN parmi les plus communs, est la perte du groupement amine des bases nucléotidiques (désamination). -De telles modifications font en sorte de changer l’appariement entre les nucléotides, et causent des mutations ponctuelles de type transition.  La réparation de l’ADN 1-Les systèmes de réparation spécifiques: A- La désamination des bases -Quoique les désaminations puissent survenir d’une manière spontanée, spécialement lorsque la température de croissance est élevée, elles peuvent être induites par des agents désaminants, tels que l’hydroxylamine, le bisulfite et l’acide nitreux.  La réparation de l’ADN 1-Les systèmes de réparation spécifiques: A- La désamination des bases  La réparation de l’ADN 1-Les systèmes de réparation spécifiques: A- La désamination des bases  La réparation de l’ADN 1-Les systèmes de réparation spécifiques: A- La désamination des bases -L’absence d’uracil dans l’ADN s’explique en partie par le fait que la désamination spontanée de la cytosine, une base de l’ADN, donne de l’uracil. Comment la cellule ferait pour discriminer entre les bonnes bases uracil, incorporées en face de l’adénine durant la réplication, de celles qui proviennent de la désamination de la cytosine?  La réparation de l’ADN 1-Les systèmes de réparation spécifiques: A- La désamination des bases -Réparation de bases désaminées De tels dommages sont réparés par l’action spécifique de glycosylases ADN (une pour chaque type de base désaminée) qui brisent le lien glycosyl entre la base endommagée et le sucre dans le nucléotide.  La réparation de l’ADN 1-Les systèmes de réparation spécifiques: A- La désamination des bases -Réparation de bases désaminées -Une AP endonucléase apurinique ou apyrimidinique (dépendant du type de base éliminée) coupera le lien phosphodiester du côté 5’ du dommage. -La polymérase ADN I, de part son activité exonucléasique 5’- 3’ et polymérasique, va ajouter les bons nucléotides. Le tout sera ensuite scellé par l’action de la ligase.  La réparation de l’ADN 1-Les systèmes de réparation spécifiques: A- La désamination des bases -Réparation de bases désaminées Trouver l’énoncé qui est faux à propos de la désamination des bases. A. Le système de réparation des bases désaminées est un système de réparation spécifique. B. Une glycosylase spécifique à la base désaminée élimine cette dernière avant l’action d’une AP-endonucléase. C. La désamination de la cytosine donne de l’uracile. D. La désamination des cytosines peut survenir spontanément. E. Aucune de ces réponses.  La réparation de l’ADN 1-Les systèmes de réparation spécifiques: B- Les dommages causés par l’oxygène réactif. -Quoique l’oxygène moléculaire soit inoffensif pour l’ADN, d’autres formes plus réactives de l’oxygène sont très dommageables. Ces formes réactives de l’oxygène ont plus d’électrons que l’oxygène moléculaire et comprennent les radicaux superoxydes, le peroxyde d’hydrogène et les radicaux hydroxyls.  La réparation de l’ADN 1-Les systèmes de réparation spécifiques: B- Les dommages causés par l’oxygène réactif. -L’accumulation de tels produits peut être causée par des réactions métaboliques normales de la cellule (chaîne respiratoire) ou peut être induite par des conditions environnementales particulières, telle qu’une exposition à une dose élevée de rayons ultraviolets.  La réparation de l’ADN 1-Les systèmes de réparation spécifiques: B- Les dommages causés par l’oxygène réactif. -Les cellules sont équipées pour contrer l’accumulation de tels produits dérivés de l’oxygène moléculaire. En effet, la présence d’enzymes tels que les superoxide dismutases, les catalases, et les peroxydases, peut empêcher leur accumulation.  La réparation de l’ADN 1-Les systèmes de réparation spécifiques: B- Les dommages causés par l’oxygène réactif.  La réparation de l’ADN 1-Les systèmes de réparation spécifiques: B- Les dommages causés par l’oxygène réactif. -Cependant, vue la grande sensibilité de l’ADN à des dommages oxydatifs, la cellule ne peut empêcher l’action des dérivés toxiques de l’oxygène moléculaire sur l’ADN avant qu’ell