Cours LADJOUZI Rabia - Notions de Base de la Bacteriologie Générale PDF

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université A. Mira de Bejaia Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département de Tronc Commun des Sciences de la Nature Cours p...

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université A. Mira de Bejaia Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département de Tronc Commun des Sciences de la Nature Cours pédagogique au profit des étudiants de deuxième année SNV NOTIONS DE BASE DE LA BACTERIOLOGIE GÉNÉRALE Dr : LADJOUZI Rabia  Préambule Préambule Le moins que l'on puisse dire sur les bactéries est, malgré leur petite taille, qu'elles forment un monde géant et mystérieux, ce qui rend leur étude fascinante. L'homme a d'abord étudié les organismes visibles à l'œil nu, puis la découverte et le développement de la microscopie, a permis la naissance de la microbiologie. La bactériologie est l'une des filières de la microbiologie, elle consiste à étudier les bactéries en long et en large. La connaissance des bactéries et la compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires, a permis une meilleure maitrise de ces agents dans les thérapies cliniques et une meilleure exploitation dans les différents domaines tels que l'énergie, l'environnement, l'agriculture, l'industrie et la biotechnologie. Dans ce contexte, ce polycopié de cours intitulé "notions de base de la bactériologie générale" a été élaboré. Il constitue un support pédagogique destiné à initier les étudiants de biologie ou de médecine à la microbiologie générale et notamment à la bactériologie de base. La pédagogie empruntée lors de l'élaboration de ce présent cours est basée sur l'utilisation d'un langage simple et basique, soutenu par des exemples. De plus, et afin de rendre le contenu plus accessible au public visé, beaucoup d'illustrations en forme de schémas simplifiés, de photos et de tableaux récapitulatifs ont été utilisés. Les principaux chapitres développés dans ce cours traitent essentiellement le monde microbien en grosso-modo, la structure détaillée de la cellule bactérienne, la classification, la nutrition et la croissance des bactéries, les agents antimicrobiens et enfin un aperçu sur les rôles des bactéries dans l'environnement et leur impact sur l'homme et ses activités. "Le rôle de l'infiniment petit dans la nature est infiniment grand" Louis Pasteur  Table des matières Table des matières Préambule Table des matières......................................................................................................................... 1 Liste des figures............................................................................................................................. 7 Liste des tableaux.......................................................................................................................... 9 Chapitre I : Le monde microbien.............................................................................................. 10 I- Introduction :................................................................................................................ 10 II- Historique..................................................................................................................... 12 III- Place de microorganismes dans le monde vivant...................................................... 14 IV- Caractéristiques générales de la cellule procaryote................................................... 16 Chapitre II : La cellule bactérienne........................................................................................... 17 I- Techniques d’observation de la cellule bactérienne..................................................... 17 I-1- Le microscope optique........................................................................................... 17 I-1-1- Le microscope à fond clair :........................................................................... 17 I-1-2- Le microscope à fond noir.............................................................................. 18 I-1-3- Le microscope à contraste de phase................................................................ 18 I-1-4- Le microscope à contraste d'interférence différentielle.................................. 19 I-1-5- Le microscope à fluorescence......................................................................... 19 I-1-6- Le microscope confocal.................................................................................. 19 I-2- Le microscope électronique................................................................................... 19 I-2-1- Le microscope électronique à transmission.................................................... 20 I-2-2- Le microscope électronique à balayage.......................................................... 20 II- La préparation et la coloration des échantillons pour la microscopie optique............. 21 II-1- La fixation des échantillons................................................................................ 21 1  Table des matières II-2- La coloration des échantillons............................................................................ 22 II-2-1- La coloration simple................................................................................... 22 II-2-2- La coloration différentielle.......................................................................... 22 III- La morphologie cellulaire.......................................................................................... 23 III-1- La taille............................................................................................................... 23 III-2- La forme et associations cellulaires................................................................... 23 IV- Structure cellulaire d'une bactérie :........................................................................... 25 IV-1- La paroi bactérienne........................................................................................... 26 IV-1-1- Composition chimique................................................................................ 26 IV-1-2- Les parois des bactéries Gram-positives..................................................... 28 IV-1-3- Les parois des bactéries Gram-négatives.................................................... 29 IV-1-4- Coloration de Gram..................................................................................... 32 IV-1-5- Cas de parois particulières......................................................................... 33 IV-1-6- Fonctions..................................................................................................... 34 IV-2- La membrane plasmique.................................................................................... 35 IV-2-1- Structure et composition chimique............................................................. 36 IV-2-2- Fonctions..................................................................................................... 38 IV-3- Le cytoplasme.................................................................................................... 41 IV-3-1- Les ribosomes............................................................................................. 41 IV-3-2- Les corps d'inclusion et les substances de réserve...................................... 43 IV-4- Le chromosome.................................................................................................. 44 IV-4-1- Morphologie................................................................................................ 44 IV-4-2- Composition et structure............................................................................. 45 IV-4-3- Réplication.................................................................................................. 45 IV-4-4- Rôle :........................................................................................................... 46 IV-5- Les plasmides..................................................................................................... 47 IV-5-1- Structure et réplication................................................................................ 47 2  Table des matières IV-5-2- Transfert plasmidique................................................................................. 47 IV-5-3- Propriétés.................................................................................................... 50 IV-6- Les Pilis.............................................................................................................. 50 IV-6-1- Pilis communs............................................................................................. 51 IV-6-2- Pilis sexuels................................................................................................. 51 IV-7- La capsule........................................................................................................... 51 IV-7-1- Composition et morphologie....................................................................... 51 IV-7-2- Fonctions..................................................................................................... 52 IV-8- Les cils et les flagelles........................................................................................ 52 IV-8-1- Mise en évidence......................................................................................... 52 IV-8-2- Structure et disposition............................................................................... 53 IV-8-3- Fonctions..................................................................................................... 54 IV-9- Les endospores bactériennes.............................................................................. 55 IV-9-1- Mise en évidence......................................................................................... 55 IV-9-2- Morphologie................................................................................................ 56 IV-9-3- Structure...................................................................................................... 57 IV-9-4- Phénomène de sporulation.......................................................................... 58 IV-9-5- Propriétés de la spore bactérienne............................................................... 59 IV-9-6- Germination................................................................................................ 60 Chapitre III : Introduction à la classification bactérienne...................................................... 62 I- Définition..................................................................................................................... 62 II- Types de classification bactérienne.............................................................................. 62 II-1- Classification phénétique................................................................................... 62 II-2- Classification phylogénique............................................................................... 62 II-3- Classification génotypique................................................................................. 63 II-4- Classification de Bergey..................................................................................... 63 III- Les rangs taxonomiques............................................................................................ 63 3  Table des matières IV- Critères et les techniques d'études de classification bactérienne............................... 64 IV-1- Les critères classiques........................................................................................ 65 IV-2- Les critères moléculaires.................................................................................... 65 Chapitre IV : Nutrition bactérienne.......................................................................................... 67 I- Besoins élémentaires.................................................................................................... 67 II- Facteurs de croissance.................................................................................................. 67 III- Types trophiques........................................................................................................ 68 IV- Paramètres physico-chimiques.................................................................................. 69 IV-1- La température.................................................................................................... 69 IV-2- Le pH.................................................................................................................. 70 IV-3- L'oxygène (O2)................................................................................................... 71 IV-4- Les solutés et l'activité de l'eau aW.................................................................... 71 IV-5- La pression......................................................................................................... 72 V- L’absorption des nutriments......................................................................................... 73 VI- La culture bactérienne et les milieux de culture........................................................ 73 VI-1- Notions............................................................................................................... 74 VI-2- Les caractères culturaux..................................................................................... 74 Chapitre V : Croissance bactérienne......................................................................................... 75 I- Définition..................................................................................................................... 75 II- Mesure de la croissance bactérienne............................................................................ 76 II-1- Dénombrement au microscope.......................................................................... 76 II-2- Epifluorescence.................................................................................................. 76 II-3- Compteur de particules....................................................................................... 77 II-4- Dénombrement après culture.............................................................................. 77 II-5- Mesure de la masse............................................................................................ 78 II-6- Mesure du trouble............................................................................................... 79 II-7- Filtration sur membrane..................................................................................... 79 4  Table des matières II-8- Mesure des constituants cellulaires.................................................................... 79 II-9- Mesure de l’activité cellulaire............................................................................ 80 III- Cinétique de croissance............................................................................................. 80 III-1- Paramètres de croissance.................................................................................... 80 III-1-1- Temps de génération................................................................................... 80 III-1-2- Taux de croissance...................................................................................... 80 III-1-3- Paramètres physico-chimiques.................................................................... 80 III-2- Courbe de croissance dans un système fermé.................................................... 80 III-2-1- La phase de latence..................................................................................... 81 III-2-2- La phase exponentielle................................................................................ 81 III-2-3- La phase stationnaire................................................................................... 82 III-2-4- La phase de déclin....................................................................................... 82 III-3- La culture continue............................................................................................. 83 III-3-1- Le chémostat............................................................................................... 83 III-3-2- Turbidostat.................................................................................................. 83 Chapitre VI : Agents antimicrobiens........................................................................................ 84 I- Définition et notions..................................................................................................... 84 II- Agents physiques.......................................................................................................... 84 II-1- Température....................................................................................................... 85 II-1-1- Effet des hautes températures..................................................................... 85 II-1-2- Effet des basses températures..................................................................... 85 II-2- Radiations........................................................................................................... 86 II-3- Pression.............................................................................................................. 86 II-4- Centrifugation..................................................................................................... 86 II-5- Filtration............................................................................................................. 86 II-6- Ultrasons............................................................................................................. 87 III- Agents chimiques...................................................................................................... 87 5  Table des matières IV- Agents biochimiques et modes d’action.................................................................... 87 IV-1- Définition........................................................................................................... 87 IV-2- Cibles des antibiotiques...................................................................................... 88 IV-3- Modes d'action des antibiotiques........................................................................ 89 IV-3-1- Inhibiteurs de la synthèse de la paroi.......................................................... 89 IV-3-2- Inhibiteurs de la synthèse de la membrane cytoplasmique......................... 89 IV-3-3- Inhibiteurs de la réplication d’ADN........................................................... 89 IV-3-4- Inhibiteurs de la synthèse des protéines...................................................... 89 IV-3-5- Autres mécanismes..................................................................................... 90 IV-4- Spectre d’activité des antibiotiques.................................................................... 90 IV-5- Association des antibiotiques............................................................................. 90 IV-6- L'antibiogramme et CMI.................................................................................... 91 IV-7- Concentration minimale bactéricide................................................................... 93 Chapitre VII : Aperçu sur les rôles des bactéries.................................................................... 95 I- Bactéries et environnement naturel.............................................................................. 95 I-1- Les océans et les eaux douces................................................................................ 95 I-2- Le sol et l'air........................................................................................................... 95 II- Bactéries et santé.......................................................................................................... 96 III- Bactéries et agriculture.............................................................................................. 97 IV- Bactéries et industrie................................................................................................. 97 IV-1- Industrie agro-alimentaire.................................................................................. 97 IV-2- Energie et environnement................................................................................... 98 IV-3- Biotechnologie................................................................................................... 98 Références bibliographiques.................................................................................................... 101 6  Liste des figures Liste des figures Figure 1 : Les domaines de la microbiologie........................................................................... 11 Figure 2 : La chronologie de l'évolution biologique et géologique.......................................... 15 Figure 3 : L’arbre phylogénétique universel............................................................................ 15 Figure 4 : Un microscope optique à fond clair......................................................................... 18 Figure 5 : Photo d'un microscope électronique à transmission et à balayage.......................... 20 Figure 6 : Enterococcus faecalis observée sous un microscope électronique à transmission et à balayage.................................................................................................................................... 21 Figure 7 : Schéma simplifié d'une cellule bactérienne............................................................. 25 Figure 8: La composition des sous-unités du peptidoglycane chez Salmonella...................... 27 Figure 9 : Schéma simplifié de la structure du peptidoglycane............................................... 27 Figure 10: Représentation de la paroi des bactéries Gram-positives....................................... 28 Figure 11: La structure d'un acide téichoïque.......................................................................... 29 Figure 12: Représentation de la paroi des bactéries Gram-négatives...................................... 30 Figure 13: La structure de lipopolysaccharides........................................................................ 31 Figure 14: Formation de protoplastes et de sphéroplastes....................................................... 35 Figure 15: La structure de la membrane cytoplasmique bactérienne...................................... 36 Figure 16: Structure des phospholipides membranaires.......................................................... 37 Figure 17 : Modalités de transport membranaire passif........................................................... 39 Figure 18 : Les trois systèmes de transport membranaire........................................................ 39 Figure 19 : Les trois classes de transporteurs membranaires................................................... 40 Figure 20: Composition des ribosomes procaryotes vs ribosomes eucaryotes........................ 42 Figure 21 : Processus de biosynthèse des protéines par les ribosomes bactériens................... 42 Figure 22 : Le changement de conformation de l'ADN bactérien............................................ 44 Figure 23: La structure en double hélice de l'ADN.................................................................. 45 Figure 24 : Le mode semi-conservatif de la réplication d'ADN.............................................. 46 Figure 25 : Rôle de l'ADN dans l'expression des caractères héréditaires................................ 46 Figure 26 : Modes de transfert plasmidique............................................................................. 48 Figure 27 : Le transposon de la résistance à la vancomycine chez le genre Enterococcus...... 50 Figure 28: L'ultrastructure d'un flagelle de bactéries à Gram négatif et à Gram positif.......... 53 Figure 29 : Résultats d'une coloration de Benito-Trujillo effectuée sur Bacillus subilis......... 56 7  Liste des figures Figure 30 : Les différentes morphologies de l'endospore bactérienne..................................... 56 Figure 31 : La structure d'une endospore bactérienne.............................................................. 57 Figure 32 : Le cycle sporal....................................................................................................... 58 Figure 33 : La germination d'une endospore............................................................................ 60 Figure 34 : Structure hiérarchique en taxonomie..................................................................... 64 Figure 35 : Influence de la température sur la croissance bactérienne..................................... 69 Figure 36 : Les bactéries et la température.............................................................................. 70 Figure 37 : Les bactéries et le pH du milieu............................................................................ 70 Figure 38 : Les bactéries et la concentration de l'oxygène....................................................... 71 Figure 39 : Etapes de la division cellulaire par scissiparité chez Enterococcus faecalis observées par un microscope électronique à transmission....................................................... 75 Figure 40 : La cellule de Thoma et la cellule de Malassez...................................................... 76 Figure 41 : Dénombrement après culture des bactéries........................................................... 78 Figure 42 : Courbe de croissance dans un système fermé........................................................ 81 Figure 43: Les différentes cibles des antibiotiques.................................................................. 88 Figure 44: Détermination de la CMI par la technique de dilution en tube............................... 91 Figure 45 : Antibiogramme...................................................................................................... 92 Figure 46 : Détermination de CMI par le E-test....................................................................... 93 Figure 47 : Détermination de la CMB..................................................................................... 94 Figure 48 : Impact des bactéries sur l'homme et ses activités ainsi que sur l'environnement naturel..................................................................................................................................... 100 8  Liste des tableaux Liste des tableaux Tableau I : Quelques évènements importants dans le développement de la microbiologie..... 13 Tableau II : Les principales différences entre les cellules procaryotes et les cellules eucaryotes................................................................................................................................. 16 Tableau III : Quelques types morphologiques fréquemment retrouvées chez les bactéries.... 24 Tableau IV: Illustration des étapes de la coloration de GRAM............................................... 33 Tableau V : Arrangement des flagelles chez les bactéries....................................................... 54 Tableau VI : Récapitulatif des types trophiques chez les bactéries......................................... 68 Tableau VII : Les bactéries et les paramètres physico-chimiques........................................... 72 9 Chapitre I Le monde microbien Chapitre I : Le monde microbien I- Introduction : Le terme de microbe peut être défini comme l'ensemble des êtres vivants dont la taille est invisible à l'œil nu. C’est leur seul point commun, car ils diffèrent et varient par leur morphologie, leur physiologie, leur mode de reproduction et leur écologie. Ces microbes comprennent les bactéries, les archéobactéries, les champignons microscopiques (levures et moisissures), les algues unicellulaires et les protozoaires. Les virus, quant' à eux, sont considérés comme des êtres non vivants, acellulaires qui dépendent entièrement de leurs cellules hôtes. La microbiologie est la discipline qui s’intéresse à l’étude de ces microbes appelés également: micro-organismes (du grec : mikrós " petit "; et organismós, " organisme "). Elle se divise en deux grands domaines à savoir, la microbiologie fondamentale et la microbiologie appliquée. La microbiologie fondamentale se consacre à l’étude et à la compréhension des mécanismes microbiens. C'est à dire, elle a pour but l'identification et la caractérisation des micro-organismes, l'étude de leur physiologie et leurs structures moléculaires, la compréhension des relations micro-organismes vs milieu naturel et enfin, l'étude de leur identité, leur origine et leur évolution. Grâce à la microbiologie fondamentale, beaucoup de sciences ont vu le jour, à l’instar de la bactériologie (l'étude des bactéries), la virologie (l'étude des virus), mycologie (l'étude des mycètes : levures et moisissures), parasitologie (étude des parasites)...etc. La connaissance des caractéristiques des microorganismes a permis leur mise en application afin d'exploiter au mieux leurs activités. Donc, la microbiologie appliquée a pour objet l'utilisation des micro-organismes dans différents domaines; alimentaire, agroalimentaire, industriel, biotechnologique, clinique...etc. Enfin, la microbiologie occupe une place centrale en biologie. En effet, elle contribue efficacement à comprendre l'évolution et les origines de la vie, la génétique, la biochimie et l'écologie. En outre, la microbiologie a servie de base pour le fondement de l'immunologie et l'évolution du domaine clinique et thérapeutique. 10  Chapitre I Le monde microbien Bectériologie Mycologie Par type de Virologie mocroorganisme : Taxomomie Protozoologie Parasitologie Phycologie Génétique microbienne Microbiologie Par processus Fondamentale Biochimie microbienne Ecologie microbienne Immunologie En relation avec la maladie Epidemiologie Microbiologie Etiologie Controle Santé chimiothérapeutique de l'infection Microbiologie de Environnement l'environnement Microbiologie Biotechnologie appliquée alimentaire Agroalimentaire Génie génitique Industrie biotechnologie pharmaceutique Biodégradation Bioproduction Biolexiviation Figure 1 : Les domaines de la microbiologie d'après Black, 2012 modifié. 11 Chapitre I Le monde microbien II- Historique L'homme était incapable de soupçonner l'existence du monde des micro-organismes qui l'entourait vu leur petite taille. Tout a commencé par l'invention d'un outil qui a permis leur observation. Une des découvertes les plus importantes en biologie a eu lieu en 1665. A travers un microscope relativement simple, Robert Hooke, a rapporté au monde que les organes sont composés d'unités structurales très petites qu'il a appelé "petites boîtes". En utilisant sa version améliorée d'un microscope, Hooke a été en mesure de voir les cellules individuelles et développe la théorie cellulaire. Bien que le microscope de Hooke fût capable de montrer de grandes cellules, il lui manquait la résolution qui lui aurait permis de voir clairement les microbes. En 1673, le commerçant et scientifique néerlandais Anton van Leeuwenhoek a probablement été le premier à observer des micro-organismes vivants à travers les lentilles des microscopes qu'il a construites, pour décrire enfin, les structures de ces derniers qu'il a appelé "animalicules". Van Leeuwenhoek a fait des dessins détaillés des animalicules qu'il a trouvés dans l'eau de pluie, dans ses propres selles et dans le matériel utilisé pour nettoyer ses dents. Depuis, ces dessins ont été identifiés comme des représentations de bactéries et de protozoaires (Prescott et al., 2003). Depuis la découverte de Van Leeuwenhoek, le monde des micro-organismes a été révélé. Francesco Redi en 1688 vient pour contester la génération spontanée; une théorie largement admise par ses précédents et qui prétend que la vie apparait spontanément à partir de la terre ou des matières organiques. Il fallait attendre l'arrivée de Louis Pasteur avec ses importantes découvertes pour réveiller la microbiologie (fermentations, pasteurisations, vaccins, fondement de l'immunologie....etc.). La période allant de 1857 à 1914 a été nommée l'âge d'or de la microbiologie. Pendant cette période, des progrès rapides, menés principalement par Pasteur et Robert Koch, ont conduit à l'établissement de la microbiologie comme étant une science. Les découvertes au cours de ces années comprenaient à la fois les agents de nombreuses maladies et le rôle de l'immunité dans la prévention et la guérison des maladies. Au cours de cette période productive, les microbiologistes ont étudié les activités chimiques des micro-organismes, amélioré les techniques de microscopie et de culture des microorganismes, développé des vaccins et des techniques chirurgicales (Tortora et al., 2012). Certains des événements majeurs survenus pendant l'âge d'or de la microbiologie sont répertoriés dans le tableau I. 12  Chapitre I Le monde microbien Tableau I : Quelques évènements importants dans le développement de la microbiologie (Madigane & Martinko, 2007; Cano & Borucki, 1995; Heidelberg et al., 2000; Prescott et al., 2003, 2013; Schulz et al., 1999; Tortora et al., 2012) Année Auteurs Découverte 1546 Girolamo Fracastoro Suggère que des organismes invisibles soient la cause de maladies 1500 1590- Zacharias Janssen Développe des lentilles et le premier microscope 1608 1688 Francesco Redi Conteste l'hypothèse de la génération spontanée 1600 Première description d'une cellule biologique et le premier à utiliser le 1665 Robert Hooke mot cellule 1673 Antony Van Leeuwenhoek Première observation d'animalcules grâce à sa découverte du compte-fils 1700 1735 Carl Linnæus Fondement des bases du système moderne de la nomenclature binominale 1798 Edward Jenner Premier médecin à avoir introduit et étudié le vaccin contre la variole 1835 Agostino Bassi Mise en évidence du champignon qui affecte le ver à soie Démontre que le lavage des mains diminuait le nombre des décès causés 1840 Ignace Philippe Semmelweis par la fièvre puerpérale des femmes après l'accouchement 1853 Heinrich Anton de Bary Fondateur de la phytopathologie. 1857 Louis Pasteur Phénomènes de la fermentation 1861 Louis Pasteur Mis un terme à la théorie de la génération spontanée 1864 Louis Pasteur Pasteurisation 1867 Joseph Lister pionniers de l'antisepsie dans la chirurgie opératoire la théorie microbienne (pathologique) proposant que de nombreuses 1876 Robert Koch * maladies sont causées par des micro-organismes 1879 Albert Neisser Mise en évidence de Neisseria gonorrhoeae 1881 Robert Koch * Culture pure L'âge d'or de la microbiologie 1800 1881 Carlos Finlay Fièvre jaune 1882 Robert Koch * Mycobacterium tuberculosis 1882 Fanny Hesse milieu agar (solide) 1883 Robert Koch * Vibrio cholerae 1884 Ilya Ilitch Metchnikov Phagocytose 1884 Hans Christian Gram Coloration de Gram 1885 Theodor Escherich Escherichia coli 1887 Julius Richard Petri Boite de Pétri 1889 Kitasato Shibasaburō Clostridium tetani 1890 Emil Adolf von Behring * Antitoxine diphtérique 1890 Paul Ehrlich * Théorie de l'immunité 1892 Sergueï Winogradsky Cycle de soufre 1898 Kiyoshi Shiga Shigella dysenteriae 1902 Ronald Ross * Découvre le mode de transmission de la malaria 1908 Paul Ehrlich * Syphilis 1900 1910 Carlos Chagas Trypanosoma cruzi 1911 Peyton Rous * Virus oncogènes (mais le prix Nobel en 1966) 1928 Fleming , Chain, Florey * Pénicilline 1928 Frederick Griffith Transformation bactérienne 13  Chapitre I Le monde microbien 1934 Rebecca Lancefield Antigènes des streptocoques 1935 Stanley, Northrup, Sumner * Cristallisation de virus 1941 Beadle et Tatum Relation entre gène et enzyme 1943 Delbrück et Luria * Infection virale de bactérie 1944 Avery, MacLeod, McCarty l'ADN est le matériel génétique 1946 Lederberg et Tatum Conjugaison bactérienne 1952 Selman A. Waksman * Découverte de la streptomycine 1953 Hans A. Krebs * Découvre le cycle de Krebs (étapes de dégradation des carbohydrates) 1953 Watson et Crick * Structure de l'ADN 1957 Jacob et Monod Régulation de la synthèse protéique 1959 Sarah Stewart cause virale du cancer humain 1962 Edelman et Porter * Anticorps 1964 Epstein, Achong, Barr virus Epstein-Barr comme cause de cancer humain 1900 1971 Nathans, Smith, Arber * Enzyme de restriction 1973 Paul Berg Génie génétique 1975 Dulbecco, Temin, Baltimore Reverse transcriptase 1978 Carl Woese Archaea 1978 Peter Mitchell * Mécanismes de chimioosmose 1981 Lynn Margulis Origine des cellules eucaryotes 1982 Aaron Klug * structure du virus de la mosaïque du tabac 1983 Barbara McClintock * Transposons 1988 Deisenhofer, Huber, Michel * Photosynthèse des pigments bactériens Identification et reviviscence des spores bactériennes de l'ère dominicaine 1995 Cano RJ et Borucki MK de 25 à 40 millions d'années 1997 Stanley Ben Prusiner * Prions 1997 Schulz et al Découverte de bactéries géantes "Thiomargarita namibiensis" 2000 Heidelberg et al Découverte de deux chromosomes distincts chez Vibrio cholera (*) : Lauréats de prix Nobel 1857-1914 : L'âge d'or de la microbiologie III- Place de microorganismes dans le monde vivant Les micro-organismes existaient sur terre depuis des milliards d’années (figure 2). Selon l'ancienne classification, le monde vivant a été subdivisé en trois (3) règnes à savoir; le règne animal, le règne végétal et le règne des protistes. Ce dernier est, à son tour, divisé en protistes inferieurs (procaryotes) comprenant les bactéries et algues bleues et protistes supérieurs (eucaryotes) comprenant les champignons (levures et moisissures), les protozoaires et les algues autres que les algues bleues. Dans cette classification, ni les virus ni les archéobactéries ne sont classifiés. Actuellement, avec le développement de la biologie moléculaire, une nouvelle classification est proposée. Cette dernière est basée sur la comparaison des séquences d’ARN ribosomique (ARNr). Cette classification a permis de 14 Chapitre I Le monde microbien tracer l’arbre phylogénétique universel qui comprend trois domaines à savoir; deux domaines procaryotes (Bacteria et Archaea) et un domaine eucaryote (Eucarya) (Figure 3). Figure 2 : La chronologie de l'évolution biologique et géologique d'après Madigane & Martinko, 2007. Figure 3 : L’arbre phylogénétique universel (Prescott et al., 2013). Root étant le premier ancêtre commun 15 Chapitre I Le monde microbien IV- Caractéristiques générales de la cellule procaryote Contrairement à la morphologie complexe et la taille de la cellule eucaryote, la cellule procaryote est plutôt de petite taille et de morphologie simple avec un noyau non entouré par une membrane nucléaire. Généralement, la notion de compartimentation en utilisant des membranes pour délimiter chaque organite est une caractéristique des eucaryotes. Les cellules procaryotes, comprenant les bactéries et archéobactéries, sont délimitées uniquement d'une membrane cytoplasmique dans laquelle le chromosome, les ribosomes et les autres constituants baignent dans le cytoplasme. Le tableau 2 rapporte les principales différences entre les deux types de cellule procaryote et eucaryote. Tableau II : Les principales différences entre les cellules procaryotes et les cellules eucaryotes. Cellule procaryote Cellule eucaryote Organisation génétique Enveloppe nucléaire Absente Présente Nombre de chromosomes Généralement 1 et circulaire > 1 non circulaire Nucléole Absent Présent Structures cellulaires Réticulum endoplasmique Absent Présent Appareil de Golgi Absent Présent Lysosomes Absents Présents Mitochondries Absentes Présentes Chloroplastes Absents Présents chez les plantes Microtubules Absents Présents Paroi cellulaire avec Présente (sauf chez mycoplasmes et Absente peptidoglycane archaeobactéries) Ribosomes 70 S 80 S (sauf mitochondries et chloroplastes) 16 Chapitre II La cellule bactérienne Chapitre II : La cellule bactérienne I- Techniques d’observation de la cellule bactérienne Les dimensions des micro-organismes et des entités microbiologiques sont microscopiques, allant des virus dont la taille est de l'ordre de nanomètre (nm) jusqu'aux protistes dont les plus grands atteignent 200 micromètres (µm) de diamètre. Par conséquent, le microscope est d'une importance primordiale pour observer et comprendre les structures cellulaires. De plus, certains types de microscopes fournissent de précieux détails sur les fonctions des structures observées. Donc, la compréhension du fonctionnement d'un microscope ainsi que la maitrise des méthodes de préparation des échantillons à examiner est particulièrement nécessaire pour un microbiologiste. Actuellement, il existe plusieurs types de microscopes. Par ailleurs, considérant uniquement le type des ondes traversant l'échantillon; on distingue le microscope optique qui utilise les photons (lumières) et le microscope électronique qui utilise les électrons. Ces microscopes se différent dans la résolution de l'image (agrandissement), les objectifs attendus ainsi que les techniques de préparation des échantillons. I-1- Le microscope optique Le principe d'un microscope optique repose sur le fonctionnement des lentilles convexes qui condensent et focalisent les rayons lumineux provenant d'une source éloignée à point (le foyer) d'une distance au centre de la lentille appelée; la distance focale. En général, la limite de résolution d'un microscope optique est de 0.2µm (200 nm). Cependant, il permet un certain nombre d'avantages comme l'observation à l'état frais, l'utilisation de colorants, préparation facile d'échantillons...etc. Les microbiologistes utilisent divers microscopes optiques à utilité particulière. Parmi ces microscopes, on cite : I-1-1- Le microscope à fond clair : Le microscope à fond clair est utilisé en routine dans un laboratoire de microbiologie. Dans ce type de microscope, l'image apparait foncée sur un fond clair d'ou son appellation. Pour le décrire brièvement, Il est composé d'une source lumineuse (miroir ou lampe éclectique) située dans le socle, d'un condensateur (condense la lumière émise), d'une platine porte 17 Chapitre II La cellule bactérienne échantillon réglable, des objectifs et deux oculaires dont le rôle est de grossir l'image. L'ensemble est tenu grâce à un corps métallique solide (figure 4). NB : Les micro-organismes non pigmentés ne sont pas clairement visibles, il faut les colorer pour augmenté le contraste. Figure 4 : Un microscope optique à fond clair (Genty, 2013). I-1-2- Le microscope à fond noir Les micro-organismes non pigmentés sont moins visibles dans un microscope à fond clair à cause de la faible différence de contraste entre la cellule et le milieu dans lequel est y mise (ex : l'eau). Afin de pouvoir observer ces micro-organismes, sans être obligé de les fixer ou de les colorer, le microscope à fond noir répond à ce problème. En effet, il permet d'observer des cellules vivantes non colorées en utilisant un con creux de lumière qui est dirigé vers l'échantillon de telle sorte à l'éclairer uniquement par les cotés (en lumière rasante). Donc, les seuls rayons qui atteignent la lentille sont ceux diffusés par l'échantillon lui même. Ceci donne comme résultat une image d'un échantillon lumineux sur un fond noir. I-1-3- Le microscope à contraste de phase Le principe d'un microscope à contraste de phase est la transformation de différences légères d'indice de réfraction et de densité cellulaire en différences d'intensité lumineuse bien observables. Le résultat de l'observation se traduit par un fond légèrement clair (formé par la lumière non déviée) et un échantillon non coloré qui parait sombre mais bien défini. Ce type de 18 Chapitre II La cellule bactérienne microscope est spécialement utilisé pour voir la mobilité, la forme des cellules vivantes ainsi que certains constituants bactériens comme l'endospore et les corps d'inclusion. I-1-4- Le microscope à contraste d'interférence différentielle Le microscope à contraste d'interférence différentielle fonctionne avec le même principe que le microscope à contraste de phase. La différence réside dans l'ajout de prismes qui génèrent des rayons polarisés dans des plans perpendiculaires. Alors, la recombinaison et l'interférence des ces derniers, forme une image d'un l'échantillon vivant non coloré en trois dimensions avec des couleurs vives. Des structures comme la paroi cellulaire, les vacuoles, les endospores sont nettement visibles. I-1-5- Le microscope à fluorescence Dans la microscopie à fluorescence, les échantillons sont habituellement contrastés par un colorant appelé fluorochrome. L’échantillon est alors éclairé avec une lumière ultra-violette, violette ou bleue, permettant ainsi d’obtenir une image de l’objet résultante de la lumière fluorescente émise par l'échantillon. I-1-6- Le microscope confocal Le microscope confocal appelé plus précisément le microscope confocal à balayage laser (MCBL). Il est considéré comme un très bon moyen pour avoir un seul plan d'un échantillon tridimensionnel. Dans ce microscope, un rayon laser monochromatique illumine un échantillon habituellement rendu fluorescent. Grace à une ouverture qui bloque tout autre rayon émis par les autres cotés de l'échantillon ou d'un l'échantillon en superposition, seule la lumière provenant du plan focal sert à créer une image nette. I-2- Le microscope électronique A l'inverse d'un microscope optique, caractérisé par une résolution limitée de 0.2µm, rendant l'observation des virus ou d'ultra-structures de bactérie impossible, un microscope électronique peut atteindre une résolution de 0.2nm. De plus, la microscopie électronique utilise les électrons au lieu des photons pour la construction de l'image. Grâce à ce dernier, des molécules comme les protéines ou les acides nucléiques sont nettement observables. Il existe différents types de microscopes électroniques à savoir; Le microscope électronique à transmission, le microscope électronique à balayage, la cryomographie 19 Chapitre II La cellule bactérienne électronique, le microscope électronique à balayage de sonde...etc. Pour l'ensemble de ces microscopes, l'échantillon observé est fixé (non vivant). I-2-1- Le microscope électronique à transmission Dans un microscope électronique à transmission (figure 5), les électroaimants fonctionnent comme les lentilles et le système fonctionnent sous vide total. De plus, il est équipé d'un appareil photo. Contrairement à la lumière visible, une source d'électron ne pénètre pas bien la cellule (elle est trop épaisse pour être observée). C'est pourquoi, des techniques spécifiques de coupes fines sont nécessaires pour préparer l'échantillon avant l'observation. Afin d'obtenir suffisamment de contraste, les coupes fines sont traitées par des colorants tels que l'acide osmique, les sels de plomb, de permanganate, d'uranium ou de lanthanum. En fin, l'image de l'échantillon apparait en noir et blanc (figure 6). I-2-2- Le microscope électronique à balayage En microscopie électronique à balayage, la réalisation de coupes fine est inutile. Au contraire, les cellules sont intactes et peuvent directement être observées grâce à une technique appelée coloration négative. En effet, l'échantillon est recouvert d'une fine couche de métal lourd (ex: l'or). Les rayons d'électrons qui parcourent toute la longueur de l'échantillon dispersés par le métal, seront collectés sur un écran pour former une image (figure 5). A noter que les surfaces de plusieurs cellules de l'échantillon peuvent êtres observées à la fois (figure 6). Figure 5 : Photo d'un microscope électronique à transmission (à gauche) et à balayage (à droite) (Bantegnies et al., 2010). 20 Chapitre II La cellule bactérienne Figure 6 : Enterococcus faecalis (bactérie à Gram positif) observée sous un microscope électronique à transmission (à gauche) et à balayage (à droite) (Ladjouzi, 2013) II- La préparation et la coloration des échantillons pour la microscopie optique La préparation de l'échantillon pour un examen par la microscopie optique varie selon l'objectif visé. Il peut être directement observé à l'état frai entre lame et lamelle afin d’observer les cellules vivantes, leur mobilité ainsi que leur morphologie. Cependant, dans la plus part des cas, la visibilité est limitée notamment chez les espèces non pigmentées. Alors, il est souvent nécessaire de fixer les échantillons et les colorer pour augmenter la visibilité et mettre en évidence certaines particularités morphologiques. II-1- La fixation des échantillons La fixation est un procédé par lequel toutes les structures internes et externes de la cellule sont figées et conservées en place. Pour ce faire, deux méthodes sont utilisées à savoir; la fixation à la chaleur et la fixation chimique. La fixation à la chaleur consiste à chauffer doucement une monocouche de bactérie séchée à l'air en le passant brièvement sur une flamme. Ce procédé préserve correctement la morphologie générale de la cellule mais pas les structures intracellulaires. La fixation chimique est plus utilisée pour protéger les structures cellulaires fines et la morphologie de microorganismes plus gros et plus délicats. Les fixateurs chimiques pénètrent à l’intérieur des cellules pour inactiver les protéines et les lipides et les rendent insolubles et 21 Chapitre II La cellule bactérienne immobiles. Les fixateurs couramment utilisés contiennent de l'éthanol, de l'acide acétique, du chlorure mercurique, le formaldéhyde et le glutaraldéhyde (Prescott et al., 2013). II-2- La coloration des échantillons Les colorants utilisés en biologie sont constitués d'un groupement chromophore (couleur) et d'un groupement auxochrome (groupement ionisé). Ce dernier, attribut souvent une charge globale soit positive (colorants basiques), soit négative (colorants acides). La coloration se fait par une fixation permanente sur des constituants cellulaires de charges opposées. Certaines colorations sont compatibles avec la vie cellulaire, d'autres nécessitent la fixation des cellules. Il est à noter que certains colorants sont utilisés pour obtenir une coloration négative, c'est à dire, le fond est coloré mais pas la cellule (ex : encre de chine qui donne un fond noir et les cellules apparaissent brillantes non colorées). Selon la charge des colorants on distingue : Les colorants basiques : mettent en évidence des constituants cellulaires acides, dits basophiles tels que les acides nucléiques et de nombreuses protéines. Les colorants de ce type les plus utilisés dans les laboratoires de microbiologie sont ; le crystal violet (violet), le bleu de méthylène (bleu), la fuchsine basique (rouge), la safranine (orange), le vert de malachite (vert), le carmin (rouge)…etc. Les colorants acides : révèlent des constituants cellulaires basiques, dits acidophiles. Les plus couramment utilisés sont ; éosine (rouge), rose bengale (rose), fuschine acide (rouge). II-2-1- La coloration simple La coloration simple est obtenue en utilisant un seul colorant acide ou basique à caractère général (pas d’affinité spécifique à une structure cellulaire particulière). Ce genre de coloration reflète la forme générale de la cellule. II-2-2- La coloration différentielle La coloration différentielle nécessite l'application d’un ou plusieurs colorants et réactifs. Ce type de coloration permet la mise en évidence de certaines structures particulières (comme la coloration négative de la capsule à l’encre de chine et la coloration de la spore au vert de malachite) ou la différenciation de groupes microbiens (comme la coloration de Gram pour 22 Chapitre II La cellule bactérienne déterminer le type de la paroi de la bactérie, la coloration de Zielh Nielsen qui relève le groupe des mycobactéries...etc.). NB : La coloration de Gram sera développée dans le cours sur la paroi III- La morphologie cellulaire Les cellules bactériennes sont caractérisées par leur taille, leur poids, leur morphologie et leur type de regroupement spécifique. Ce sont des caractères communs au sein d'une espèce voire même du genre bactérien. III-1- La taille Généralement, la taille approximative de la plupart des bactéries varie entre 0.2µm (ex : Mycoplasma pneumoniae, chlamydia...) et 18µm (ex : Thiovulum majus). Cependant, certaines espèces peuvent dépasser largement cet intervalle, à l'instar des certaines cellules de Spirochaeta qui avoisinent les 250 µm de long ou également l'espèce Epulopiscium fishelsoni, qui habite l'intestin du poisson chirurgien Acanthurus nigrofuscus, qui mesure plus de 600 µm (Angert et al., 1993). Exceptionnellement, Thiomargarita namibiensis présente la plus grande dimension rapportée pour une bactérie (à ce jour) et dont certaines cellules mesurent jusqu'à 750µm (Schulz et al., 1999). III-2- La forme et associations cellulaires Quant aux formes et au poids des cellules bactérienne, celles-ci diffèrent selon les espèces. Le poids d’une bactérie est d’environ 10-12g. Concernant les formes, les plus retrouvées sont; les formes coques (sphériques), les formes bacilles (bâtonnets allongées), les formes coccobacilles (formes intermédiaires entre coques et bacilles, ovoïdes), les formes incurvées (vibrions), les formes spiralées dont certaines sont rigides (spirilles) et d'autres sont flexibles (spirochètes), les formes filamenteuses (mycélium des actinomycètes), les formes pédonculées (allongement dans l'extrémité) et enfin des formes pléomorphes (changent de formes). Toutes ces formes peuvent être retrouvées seules, associées par deux (diplococoques, diplobacilles), en chaînette (streptocoques, streptobacilles), en amas (groupées), en tétrades (par quarte), amas en grappe de raisin,...etc. Dans le tableau ci-dessous, les formes les plus retrouvées avec leurs caractéristiques, les groupements fréquents et les schémas correspondants de chaque forme sont rapportés (Tableau III). 23  Chapitre II La cellule bactérienne Tableau III : Quelques types morphologiques fréquemment retrouvés chez les bactéries. Exemple de genre Formes caractéristiques Regroupement Schéma bactérien Isolés Genre Micrococcus Diplocoques Genre Enterococcus Forme sphérique Genre Streptococcus Chaînettes Coques généralement de Genre Enterococcus 0.5 à 2 µm Amas réguliers, grappe Genre Staphylococcus de raisin Genre Sarcina Tétrades Genre Deinococcus Genre Bacillus Forme droite Souvent isolés mais Genre Lactobacillus Bacilles Jusqu’à 6 µm de long, 0.5 à retrouvés également en Genre Pesudomonas (Bâtonnets) 2µm de large. Extrémités paires ou en chaînettes Genre Chlostridium plates, arrondies ou carrées (streptobacilles). Genre Mycobacterium Forme intermédiaire entre les coques et les bacilles. Genre Brucella Coccobacilles Isolés ou en paires Courts et larges, Genre Pasteurella ressemblant à des coques Incurvés Forme de virgule Le plus souvent Isolés Genre Vibrio Genre Spirulina Spirilles hélices rigides en spirale Souvent en chaînettes Genre Rhodospirillum Spirochètes hélices flexibles Isolés Genre Treponema Genre Borrelia réseau de longs filaments Ramifié ou non ramifié Filamenteuses (Mycélium) Genre Streptomyces (souvent en chaînettes) Genre Haemophilius Pléomorphes Change de forme Isolés Genre Mycoplasma Pédicule à grande capacité Pédonculées adhésive due aux Isolés Genre Caulobacter polysaccharides 24 Chapitre II La cellule bactérienne IV- Structure cellulaire d'une bactérie : Une cellule bactérienne est composée d'éléments constants qu'on retrouve chez la quasi- majorité des bactéries. Ces éléments de nombre cinq (5), sont de l'intérieure à l'extérieure ; un chromosome circulaire et des ribosomes qui baignent dans le cytoplasme, l'ensemble est entouré par une membrane cytoplasmique, elle même, entourée par une paroi bactérienne. Cependant, d'autres éléments de structure peuvent être retrouvés chez certaines bactéries mais pas chez d'autres, appelés "éléments inconstants". Parmi ces structures, on cite; la capsule qui entoure la paroi bactérienne, les plasmides, les pilis sexuel, les fimbriae, les flagelles, les spores et les corps d'inclusions (Figure 7). Le rôle et la composition chimique de chaque structure seront développés dans ce présent chapitre. Figure 7 : Schéma simplifié d'une cellule bactérienne. Les structures soulignées représentent les éléments constants. 25 Chapitre II La cellule bactérienne IV-1- La paroi bactérienne La paroi bactérienne est un élément constant présent chez la plupart des bactéries. C'est un élément de structure rigide situé à l’extérieur de la membrane plasmique. Elle est simple de conception et à la fois sophistiquée et complexe dans son assemblage. Cette structure est si indispensable qu'elle est historiquement une cible privilégiée des thérapies antibactériennes (Betalactamines, fosfomycine, vanvomycine, bacitracine...etc.) IV-1-1- Composition chimique Plusieurs éléments constituent la paroi bactérienne. Selon la nature chimiques, les composants suivants sont fréquemment retrouvés ; peptidoglycane, acides téichoïques et acides lipotéichoïques, lipopolysaccharides, protéines, lipides et lipoprotéines. La composition de la paroi n'est pas constante chez toutes les bactéries. En effet, dans le domaine des Bacteria, il existe deux types de parois que l'on rencontre chez les bactéries dites "à Gram positif" et les bactéries dites "à Gram négatif". Ces différences de structure bien visibles en microscopie électronique à transmission sont à la base de la coloration de Gram. Dans cette partie, la structure de la paroi des bactéries Gram(+) et Gram(-) seront développées séparément. Concernant les constituants de la paroi, la structure du peptidoglycane sera élucidée en premier car il s'agit d'un élément commun présent dans les deux types de paroi, puis les autres structures seront traitées selon leur présence dans le type de la paroi étudiée. La structure du peptidoglycane Le peptidoglycane, constituant clé de la paroi, est assez rigide pour fournir une intégrité physique à la cellule mais aussi suffisamment flexible pour permettre son expansion (Höltje, 1998). Brièvement, le peptidoglycane (appelé également mureine ou mucopeptide) est une structure macromoléculaire continue dont les principaux composants sont des chaînes linéaires de glycanes, reliées entre elles par des petites chaînes peptidiques. Ces unités répétées de glycanes sont composées de l'alternance d'unités de N-acétylglucosamine (NAG) et d'acide N-acétylmuramique (NAM). Toutes les liaisons entre les sucres sont de type β 1-4. Le groupement carboxyle de chaque NAM est substitué par une sous-unité peptidique de cinq résidus d’acides aminés (ex : L-Ala-γ-D- Glu- mDAP-D-Ala-D-Ala) (figure 9). Il est à noter que le dernier acide aminé de la chaine est enlevé en fur et à mesure de l'élongation de la chaine du peptidoglycane. Les trois acides aminés ; l'acide D-glutamique (D-Glu), la D-alaline (D-Ala) et l'acide méso-diaminopimélique (DAP), ne sont pas présents dans les protéines. Donc, ces acides aminés de la série D empêchent la dégradation par la plupart des peptidases qui reconnaissent que les isomères de la série L. La 26 Chapitre II La cellule bactérienne synthèse du peptidoglycane nécessite plus de trente enzymes et a lieu dans différents compartiments de la cellule bactérienne (cytoplasme, membrane et paroi). Les chaînes de peptidoglycane voisines sont interconnectées (entre le 3ème acide aminé d'une chaine et le 4ème acide aminé d'une autre chaine voisine) soit par une liaison peptidique directe, soit par une courte chaine d'acides aminés entre deux sous-unités peptidiques (ex : Gly-Gly-Gly-Gly-Gly). Bien que la composition des peptides puisse varier d'une espèce à l'autre, la composition du squelette carbohydraté est généralement considérée comme étant constante (figure 9). Figure 8: La composition des sous-unités du peptidoglycane chez Salmonella (Roujeinikova, 2008). NAG: N-acétylglucosamine, NAM : acide N-acétylmuramique, L-Ala: L-alaline, D-Glu: acide D-glutamique, mDAP: acide méso-diaminopimélique, D-Ala: D-alaline. Figure 9 : Schéma simplifié de la structure du peptidoglycane. 27 Chapitre II La cellule bactérienne IV-1-2- Les parois des bactéries Gram-positives La plupart des bactéries à Gram positif présente une paroi épaisse constituée principalement de peptidoglycane (jusqu'à 80nm). De plus, elles contiennent généralement une grande quantité de polymères secondaires dont les acides téichoïques et les acides lipotéichoïques, et peuvent contenir également des protéines pariétales (ex: adhésines, couche S...etc.) (Figure 10). L'espace périplasmique, situé entre la membrane cytoplasmique et la paroi, est petit par rapport à celui des bactéries Gram-négatives et peu de protéines sont retrouvées fixées au coté extérieur de la membrane cytoplasmique. Il est admis que la plupart des protéines secrétées par les cellules traverse habituellement le peptidoglycane. Ces dernières sont considérées comme des exo-enzymes, car elles servent souvent à dégrader les substrats nutritifs trop grands pour être transportés à travers la membrane cytoplasmique. Figure 10: Représentation de la paroi des bactéries Gram-positives. La structure des acides téichoïques et les acides lipotéichoïques Les acides téichoïques (AT) et les acides lipotéichoïques (ALT) sont formés d’un squelette d’alditol (glycérol ou ribitol) connecté par des liaisons phosphates et sont reliés aux résidus N-acétylmuramique du peptidoglycane (AT) ou à la membrane plasmique (ALT). 28 Chapitre II La cellule bactérienne D’autres molécules comme le glucose ou le D-alanine, peuvent se lier aux résidus de glycérol ou de ribitol (Figure 11) Les AT et ALT sont considérés comme des éléments importants qui stabilisent davantage la structure de la paroi bactérienne. Par ailleurs, plusieurs fonctions ont été attribuées aux AT et ALT notamment leur implication dans la pathogénicité. Ces acides téichoïques contribuent à la résistance aux peptides antimicrobiens, la formation de biofilms, l’adhésion aux cellules eucaryotes et stimulent l'inflammation par exposition des cellules au complément (Fabretti et al., 2006; Jett et al., 1994). Figure 11: La structure d'un acide téichoïque. Un segment d'acide téichoïque comprenant des glycérols reliés par des molécules de phosphate. La chaine R peut être du glucose ou de D- alanine. Exemples de bactéries à Gram positif Beaucoup de bactéries forment le groupe des bactéries à Gram positif à l'instar des genres Staphylococcus, Micrococcus, Enterococcus, Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Bacillus, Clostridium, Listeria....ect. IV-1-3- Les parois des bactéries Gram-négatives La paroi des bactéries Gram-négatives est plus complexe que celle des bactéries Gram- positives. Elle est composée d'une mince couche de peptidoglycane qui ne représente pas plus 29 Chapitre II La cellule bactérienne de 10% du poids total de la paroi avec une épaisseur d'environ 2 nm chez certaine espèce comme Escherichia coli (Prescott et al., 2013). La particularité de la paroi des bactéries Gram-négatives est qu'elle est entourée par une membrane externe en plus de sa membrane cytoplasmique. Entre les deux membranes s'intercale le peptidoglycane qui est, lui même, attaché à la membrane externe grâce aux lipoprotéines (lipoprotéines de Braun). L'espace périplasmique est différent de celui des bactéries à Gram+, il couvre tout l'espace entre les deux membranes (Figure 12) et peut atteindre 71 nm voire 20 à 40% du volume cellulaire total (Prescott et al., 2013). Cet espace contient des enzymes qui participent à la nutrition (hydrolases) et des protéines qui sont impliquées dans le transport de molécules à l’intérieur de la cellule. Figure 12: Représentation de la paroi des bactéries Gram-négatives. La membrane externe est une double couche de phospholipides qui renferme plusieurs protéines et des lipopolysaccharides (LPS) (Figure 12). Ces dernières (LPS), sont de grandes molécules composées de trois parties; le lipide A enfoui dans la membrane externe, le polysaccharide central composé de glucides (10 glucides chez Salmonella) et la chaine latérale O à l'extrémité appelée également l'antigène O qui est une courte chaine de polysaccharides 30 Chapitre II La cellule bactérienne particuliers dont la composition varie selon les espèces (spécifiques). Les LPS jouent plusieurs rôles. En effet, ils contribuent à la charge négative de la surface externe de la bactérie, il peut faciliter l'adhésion de la bactérie à des surfaces, il participe à la sélectivité de la membrane externe en empêchent la perméabilité de certaines molécules et enfin, il suscite une réponse immunitaire chez l'hôte via l'antigène O et agit également comme une endotoxine à cause de la toxicité du lipide A. La perméabilité de la membrane externe est plus importante par rapport à celle de la membrane cytoplasmique et ce malgré le rôle des LPS dans l'imperméabilité de certaines molécules. Ceci est dû à la présence de protéines spéciales de forme d'un tube appelées "porines". Ces porines de caractère aqueux laissent rentrer des petites molécules inferieures à 600 daltons. Cependant, les plus grosses molécules traversent la membrane externe par les transporteurs spécifiques (ex : vitamine B12) Figure 13: La structure de lipopolysaccharides (Julio, 2015) Exemples de bactéries à Gram négatif Beaucoup de bactéries forment le groupe des bactéries à Gram positif à l'instar des genres Escherichia, Proteus, Klebseilla, Peudomonas, Aeromonas, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Neisseria, Rhizobium, Bordetella....etc. 31 Chapitre II La cellule bactérienne IV-1-4- Coloration de Gram En 1884, le bactériologiste danois Hans Christian Gram a mis au point le protocole de la coloration de Gram. C'est une coloration différentielle qui permet de mettre en évidence les propriétés de la paroi bactérienne. La coloration de GRAM est la base de la taxonomie bactérienne (Bergey & Holt, 2000); elle a permis de diviser les bactéries en deux groupes distincts à savoir; les bactéries à Gram positif, caractérisées par une paroi très riche en peptidoglycane (couche épaisse) et en acide teichoïques et lipoteichoïques (ce qui empêche la pénétration des solvants organiques tel que l’alcool et l’acétone), et les bactéries à Gram négatif, caractérisées par une paroi très riche en lipides et lipopolysaccharides grâce à la présence d’une membrane externe. Cependant, la couche du peptidoglycane est beaucoup moins importante par rapport aux bactéries Gram positives. Ce qui permet la pénétration des solvants organiques. La méthodologie de la coloration de GRAM qui est rapide et précise, consiste à l'application, sur un frottis fixé, de deux colorants basiques séparés par une étape de décoloration (Tableau IV). Tout d'abord, recouvrir un frottis fixé avec le violet de gentiane ou avec le crystal violet. Puis, le lugol sera appliqué afin de fixer la première coloration. Ensuite, l'étape la plus importante qui distingue les deux types de parois (Gram+ et Gram-) est la décoloration à l'éthanol ou l'acétone (ou le mélange éthanol/acétone). Enfin, une contre coloration avec de la fuschine qui va colorer uniquement les bactéries décolorées avec de l'éthanol (Bactéries Gram-) qui vont apparaitre en rose. En effet, les bactéries non décolorées par l'éthanol (bactéries à Gram+) gardent toujours leur première coloration et paraissent alors en violet. Il est à noter qu' un rinçage à l'eau est nécessaire après chaque étape pour enlever l'excès de colorant et une décoloration massive (long) peut entrainer la décoloration de certaines bactéries à Gram+. NB : L'utilisation de bactéries vieilles (âgées) peut fausser le type de Gram de certaines bactéries Gram+ qui peuvent paraitre en rose à cause de vieillissement de la paroi bactérienne. 32 Chapitre II La cellule bactérienne Tableau IV: Illustration des étapes de la coloration de GRAM. Etape Observation Résultats Interprétation violet de gentiane est un Recouvrir le frottis colorant basique qui Toutes les bactéries préalablement fixé avec le colore toutes les violet de gentiane et laisser sont colorées en violet agir 1mn puis rincer à l'eau structures chargées négativement Toutes les bactéries Le lugol est un fixateur Appliquer le lugol et laisser restent colorées en et mordant de la agir 1mn puis rincer à l'eau violet première coloration. Les bactéries à Gram A l'inverse des bactéries positif restent colorées Gram-, La paroi des Décoloration à l’éthanol en violet mais les bactéries Gram+ sont pendant 20s puis rincer à l'eau bactéries à Gram imperméables aux négatif sont décolorées solvants organiques. Bactéries Les bactéries à Gram- Gram- prennent la coloration Les bactéries à Gram de la fuschine (vu positif sont colorées en Cotre coloration avec de la qu'elles étaient fuschine puis rincer à l'eau violet et les bactéries à incolores), alors que les Gram négatif sont bactéries à Gram+ Bactéries colorées en rose. Gram+ gardent toujours la première coloration. IV-1-5- Cas de parois particulières Les parois bactériennes ne sont pas toutes identiques à celles des bactéries Gram+ et des Gram- conventionnelles. Car certaines bactéries présentes des parois particulières voire même absentes. Chez les Mycoplasmes, la paroi bactérienne est absence. De ce fait, ils sont insensibles aux antibiotiques ciblant la paroi bactérienne. Vu l'absence de paroi, les mycoplasmes ont tendance à être pléomorphes. Le genre Chlamydia par exemple, qui fait partie des bactéries à Gram-, le peptidoglycane est inexistant. Ce sont des parasites intracellulaires obligatoires. Chez l'homme, 33 Chapitre II La cellule bactérienne Chlamydia trachomatis est responsable de l'urétrite (maladie sexuelle transmissible) et de la cécité évitable (trachome) (Prescott et al., 2013). Le genre Mycobacterium dont l'espèce Mycobacterium tuberculosis fait partie de ce groupe de bactérie Gram+, cependant en plus de peptidoglycane, leur paroi est très riche en acides mycoliques (lipide de la classe des cirides) qui résulte d'une estérification entre un acide gras long avec un alcool long). Ces bactéries sont dites "acido-alcoolo-résistantes" et elles sont mises en évidence par la coloration de Zielh Nielsen. Parmi les parois anormales des bactéries; les protoplastes et les sphéroplastes. Ces deux appellations désignent respectivement des bactéries à Gram + et à Gram - ayant un peptidoglycane dégradé par un agent comme le lysozyme. Les archéobactéries représentent un domaine à part très différent de celui des bactéries. Ces Archaea ne présentent pas de peptidoglycane habituel, mais certaines possèdent une pseudomureine composée de N-acétyl-alosaminuronique à la place de l'acide N- acétylmuramique (NAM). IV-1-6- Fonctions Afin de mettre en évidence les rôles de la paroi bactérienne, l'expérience au lysozyme a été utilisée. Le lysozyme clive les liaisons β (1-4) glycosidiques entre le NAG et le NAM. Il en résulte une destruction totale du peptidoglycane chez les bactéries Gram(+), et une fragmentation de celui-ci chez les Gram(-) car le peptidoglycane est moins accessible à cause de la membrane externe (Figure 14). L'expérience démontre que l'hydrolyse du peptidoglycane par le lysozyme rend la bactérie sensible à la pression osmotique. Donc la mise en suspension de ces bactéries dans un milieu hypotonique engendre une lyse cellulaire. Cette sensibilité n'est pas retrouvée chez les bactéries ayant un peptidoglycane intact. Cependant, la mise en suspension des bactéries (Gram + et Gram -) ayant un peptidoglycane dégradé dans un milieu isotonique permet la formation des protoplastes (à partir des bactéries à Gram +) et des sphéroplastes (à partir des bactéries à Gram-). Les protoplastes ne gardent plus les propriétés antigéniques de la bactérie, ne se divisent plus, ne fixent plus les bactériophages et sont immobiles. Alors que les sphéroplastes conservent toutes les propriétés initiales de la bactérie. 34 Chapitre II La cellule bactérienne Figure 14: Formation de protoplastes et de sphéroplastes. A partir de cette expérience, les rôles de la paroi bactérienne sont déduits. Grâce à la paroi, la bactérie peut résister à la pression de turgescence exercée par le cytoplasme bactérien (une pression d'environ 2 barres), ainsi qu’à diverses agressions du milieu environnemental. De plus, elle fournit la forme et la structure caractéristique à la cellule grâce à la rigidité et l'élasticité du peptidoglycane. D'autres rôles sont également attribués à la paroi, par exemple, elle permet la fixation des bactériophages, elle participe à la mobilité du fait qu'une bonne partie du flagelle est maintenue par la paroi, Elle joue un rôle de barrière à perméabilité sélective et enfin contribue à la toxicité. En effet, chez les bactéries à Gram -, le LPS est une endotoxine qui peut donner des fièvres et lésions. IV-2- La membrane plasmique La membrane plasmique (ou cytoplasmique) est un élément de structure fluide qui entoure le cytoplasme et se situe sous la paroi bactérienne. Généralement, c'est une couche fine de 7.5 à 8 nm d'épaisseur, organisée, asymétrique, flexible et dynamique. Plusieurs antibiotiques ciblent la membrane cytoplasmique de bactéries telles que les polymyxines et polypeptides antimicrobiens. 35 Chapitre II La cellule bactérienne IV-2-1- Structure et composition chimique Au microscope électronique, les membranes cytoplasmiques des bactéries apparaissent en triple feuillet; deux feuillets denses limitant une couche claire. De point de vu moléculaire, la membrane cytoplasmique bactérienne (Figure 15) est principalement constituée de lipides (de 30 à 40%) et de protéines (de 60 à 70%). Les glucides sont quantitativement des constituants mineurs et souvent associés aux lipides (glycolipides) ou aux protéines (glycoprotéines). Figure 15: La structure de la membrane cytoplasmique bactérienne (modèle en mosaïque fluide). Les lipides membranaires de bactéries La fraction lipidique représente de 30 à 40% des molécules totale de la membrane. La nature chimique des lipides membranaires est essentielle pour qu’il soit capable de former une bicouche lipidique. La pluparts de ces lipides (ex : les phospholipides), présente une structure asymétrique avec deux extrémités à savoir une extrémité polaire qui interagissent avec de l'eau (hydrophile) et une autre non polaire (hydrophobe) (Figure 16). 36 Chapitre II La cellule bactérienne Figure 16: Structure des phospholipides membranaires. Les phospholipides sont des molécules classées parmi les lipides complexes. Ils sont tous formés d'un acide phosphatidique qui renferme deux acides gras liés au carbone 1 et 2 du glycérol par des liaisons ester (ce qui forme la queue hydrophobe), et d'un acide phosphorique lié au carbone 3 avec le même type de liaison (ce qui représente le pole hydrophile). D'autres molécules viennent se lier à l'acide phosphorique (le X montré sur la Figure 16) comme l'éthanolamine, la choline, la sérine l'inositol ou glycérol. A noter que le phosphatidyl- éthanolamine est le plus retrouvé dans les membranes bactériennes. Les phospholipides sont dits amphipatiques vu le caractère polaire est non polaire que présente chaque molécule. La composition lipidique des membranes cytoplasmiques bactériennes varie selon la température du milieu du sorte qu'elle reste toujours fluide, c'est à dire, les bactéries qui se développent à basse température possèdent plus d'acides gras insaturés dans les phospholipides (car il présente un faible point de fusion). A l'inverse, aux températures élevées, il y a plus d'acide gras saturés dans les phospholipides (Prescott et al., 2013). A la différence des eucaryotes, les stérols (notamment le cholestérol) qui stabilisent la structure des membranes cytoplasmiques sont absents chez les procaryotes. Ce rôle est probablement assuré par des lipides appelées; les hopanoïdes tel que le bactériohopanetétrol. Les protéines membranaires Les protéines membranaires sont les molécules majoritaires de la membrane (60% à 70%). On distingue deux types de protéines membranaires à savoir; les protéines 37 Chapitre II La cellule bactérienne périphériques (20%à 30% des protéines totales) qui sont associées avec des liaisons faibles à la membrane avec un caractère polaire (solubles dans l'eau), et les protéines transmembranaires (intrinsèques) qui présentent un caractère amphipatique. En effet, les régions hydrophobes sont enfouies dans la bicouche lipidique alors que les régions hydrophiles s'associent pour former des canaux. Ces régions polaires peuvent être également exposées sur les deux surfaces de la membrane (interne et externe), sur lesquelles des glucides sont souvent griffés sur la surface extérieure (Figure 15). Les protéines membranaires sont essentiellement des enzymes et des transporteurs tels que les enzymes de la chaîne respiratoire, les enzymes impliquées dans la biosynthèse du peptidoglycane, les perméases...etc. IV-2-2- Fonctions La membrane cytoplasmique sépare le cytoplasme de sont environnement. Par conséquent, une déchirure de la membrane provoque une fuite du contenu cellulaire et ainsi la mort de la cellule. En plus de ce rôle protecteur, la membrane constitue une barrière perméable qui permet sélectivement l'entrée des nutriments, de l'eau et la sortie des déchets du métabolisme et beaucoup d'autres molécules. Donc, elle est responsable des échanges cellulaires grâce aux transports membranaires. Le déplacement de l'eau à travers la membrane se fait par un phénomène physique appelé l'osmose par lequel l'eau se déplace du milieu moins concentré au milieu plus concentré. La molécule d'eau, vu sa petite taille, peut traverser la membrane bien que son passage soit facilité par des protéines spécifiques appelées aquaporines. Concernant les nutriments (sucres, acides aminés, sels, nucléotides, vitamines etc.), le passage des molécules s'effectue par deux types de transport à savoir; le transport passif et le transport actif. Le transport passif s'effectue dans le même sens du gradient de concentration et ne nécessite pas d'énergie. Les modalités de transfert par le transport passif impliquent le phénomène de diffusion soit d'une façon direct à travers la bicouche lipidique si la molécule transportée est hydrophobe et non chargée, soit une diffusion facilitée par un transporteur membranaire de nature protéique (Figure 17). 38 Chapitre II La cellule bactérienne Figure 17 : Modalités de transport membranaire passif Le transport actif s'effectue cotre le sens du gradient de concentration et nécessite de l'énergie. Les modalités de transfert par impliquent trois systèmes de transport. Le transport simple, la translocation de groupe et le système ABC. Le transporteur simple requiert uniquement une protéine transmembranaire, alors que la translocation de groupe implique une série de protéines lors du transport. Quant au système ABC, il implique une protéine liant le substrat, un transporteur et une protéine hydrolysant l'ATP (Figure 18). L'ensemble de ces trois systèmes nécessite de l'énergie sous forme d'ATP, de force proton-motrice ou d'autres composés riches en énergie (Madigane & Martinko, 2007; Prieur et al., 2011). Figure 18 : Les trois systèmes de transport membranaire 39 Chapitre II La cellule bactérienne Ces trois systèmes font intervenir des transporteurs protéiques regroupés en trois classes (Figure 19) : les uniports transportent une seule molécule dans une seule direction. Les antiports assurent le transfert de deux molécules différentes dans deux sens inverses. Les symports transportent deux molécules au même temps dans le même sens (Madigane & Martinko, 2007; Prieur et al., 2011) Figure 19 : Les trois classes de transporteurs membranaires. Chez la bactérie