Cours de Biologie cellulaire-Méthode d'étude cellulaires PDF

CHAPITRE IV METHODES D’ETUDE DE LA CELLULE I : HISTOIRE SUR L’INVENTION DU MICROSCOPE Il est difficile de dire qui a inventé le microscope composé. On dit souvent que l'opticien hollandais Hans Janssen et son fils Zacharias Janssen fabriquèrent le premier microscope en 1590, mais ceci provient d'un...

CHAPITRE IV METHODES D’ETUDE DE LA CELLULE I : HISTOIRE SUR L’INVENTION DU MICROSCOPE Il est difficile de dire qui a inventé le microscope composé. On dit souvent que l'opticien hollandais Hans Janssen et son fils Zacharias Janssen fabriquèrent le premier microscope en 1590, mais ceci provient d'une déclaration de Zacharias Janssen lui-même au milieu du XVIIe siècle. La date annoncée est assez improbable étant donné qu'il a été montré que Zacharias Janssen est né vers 1590. Un autre favori au titre d'inventeur du microscope est Galilée. Il a développé un microscope composé d'une lentille convexe et d'une autre concave en 1609. Christiaan Huygens, un autre Hollandais, a développé à la fin du XVIIe siècle un oculaire simple à deux lentilles corrigé des aberrations chromatiques, ce qui fut un grand pas en avant dans le développement du microscope. L'oculaire de Huygens est toujours fabriqué aujourd'hui, mais souffre d'un champ assez réduit et d'autres problèmes mineurs. On attribue en général à Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723) le fait d'avoir attiré l'attention des biologistes sur les utilisations du microscope, même si des loupes ordinaires étaient déjà fabriquées et utilisées au XVIe siècle. Les microscopes artisanaux de Van Leeuwenhoek étaient des instruments simples et de taille réduite comprenant une lentille unique mais forte. En comparaison, les systèmes à plusieurs lentilles restaient difficiles à mettre au point et il a fallu pas moins de 150 ans de développement des optiques avant que le microscope composé puisse livrer une qualité d'image équivalente à celle des microscopes simples de Van Leeuwenhoek. Néanmoins, et malgré de nombreuses revendications, on ne peut pas considérer Van Leeunwenhoek comme l'inventeur du microscope composé. II : INTRODUCTION Les cellules sont de très petite taille et d’organisation très complexe. L’étude de leur structure, de leur composition chimique et de leur fonctionnement (physiologie) a nécessité la mise au point d’outils et de techniques appropriés qui ont été perfectionnés au fur et à mesure des progrès scientifiques et technologiques réalisés dans divers domaines. Les progrès de la microscopie ont repoussé la frontière entre le visible et l'invisible. Au microscope électronique, on parvient même obtenir l'image d'atomes d'or cristallin. Aujourd'hui, la médecine, la biologie ne peuvent plus se passer du microscope. Pour comprendre la biologie cellulaire contemporaine, il est indispensable de se familiariser avec les méthodes et les appareillages utilisés pour son étude. Trois approches sont développées pour étudier les divers aspects de la cellule : *- les techniques morphologiques. *- les techniques chimiques et biochimiques. *- les techniques physiologiques. Ces techniques sont toutes basées sur l’emploi de microscopes optiques et électroniques ; les manipulations sont justifiées par les deux exigences de l’examen au microscope : - Les objets à examiner doivent être minces - Leurs différents éléments doivent présenter un certain contraste. En cytologie de nombreux procédés préparatoires des cellules sont utilisés pour une analyse morpho fonctionnelle. Nous traiterons dans ce chapitre que les principales techniques histologiques et cytologiques. III : LA MICROSCOPIE La microscopie est un ensemble de techniques permettant d'obtenir une image des structures biologiques. Le principe est dans tous les cas le même : une onde est envoyée sur la préparation ou émise par la préparation. Cette onde est captée par un objectif qui la concentre et passe par un oculaire qui crée une image observable. Cette image est soit observée à l'œil nu, soit photographiée, soit enregistrée par caméra CCD et stocké sur ordinateur pour retraitement. Aujourd'hui la microscopie est divisée en deux grands groupes, différents par la nature de la particule élémentaire impliquée : le microscope optique, aussi appelé photonique, parce qu'il utilise des photons et le microscope électronique qui utilise des électrons pour étudier l'objet. Afin d’étudier des structures on utilise un certain nombre de techniques : préparation des coupes fines, coloration négative, ombrage métallique, cryodécapage etc…. A : LA MICROSCOPIE OPTIQUE OU PHOTONIQUE Cette technique est la plus ancienne utilisée. Elle est également celle dont il existe le plus de variantes. Le principe est le suivant, la préparation est éclairée par une lampe. Les molécules à observer vont interagir avec la lumière de plusieurs façons : - soit en absorbant certaines longueurs d'onde de la lumière. C'est la microscopie en lumière directe. - soit en provoquant un déphasage des différents rayons lumineux. C'est la microscopie en contraste de phase. - soit en émettant de la lumière à une autre longueur d'onde que celle d'origine. C'est la microscopie à fluorescence. Le microscope optique est un instrument d'optique muni d'un objectif et d'un oculaire qui permet de grossir l'image d'un objet de petites dimensions (ce qui caractérise son grossissement) et de séparer les détails de cette image (et son pouvoir de résolution) afin qu'il soit observable par l'œil humain. Il est utilisé en biologie, pour observer les cellules, les tissus, en pétrographie pour reconnaître les roches, en métallurgie et en métallographie pour examiner la structure d'un métal ou d'un alliage. Il ne faut pas le confondre avec la loupe binoculaire qui n'exige pas des échantillons plats de faible épaisseur Ce microscope il a l’avantage de donner une vue générale des cellules ou des tissus et aussi de permettre l’examen de cellules vivantes ; mais le pouvoir séparateur du microscope optique ne peut dépasser 0,2 µm, le grandissement étant au maximum de 1000. 1 : Présentation du microscope optique Un microscope optique en général est composé d’un statif (pied) qui assure la stabilité de l’appareil, d’un tube optique le long duquel existe un système de lentilles en verre et comportant à ses extrémités un oculaire permettant de recueillir l’image et des objectif servant à agrandir un certain nombre de fois l’image de la préparation, d’une platine (porte objet) percée d’un trou et munie de pinces pour immobiliser la lame et d’une source lumineuse éclairant la préparation. Le microscope est caractérisé par : - son grossissement ou puissance : Egal au produit du grossissement ( ou puissance) de l’objectif et de l’oculaire Plus le grossissement de l’objectif est important, plus l’objectif doit être proche de l’objet à observer. - Son pouvoir de résolution : La résolution d'un microscope désigne sa capacité à séparer des détails très voisins. Indépendamment du capteur utilisé et des aberrations ou imperfections des lentilles, la résolution du microscope optique est fondamentalement limitée par la diffraction de la lumière. La résolution ou le pouvoir séparateur (PS) est définie comme étant la distance minimale séparant deux points individualisables. Chez l’homme le PS est de 0,1 mm à une distance de 25 cm. L’œil humain ne peut distinguer à 25cm que deux objets distants l’un de l’autre que de 0,1 mm. Au-delà l’image des 02 objets sera unique ou nulle. Le PS du microscope optique est de 0,2 µm alors que celui du microscope électronique est de l’ordre de A° 2 : Principe du fonctionnement du microscope : Deux types d’observations sont réalisables en microscopie : l’observation par transmission pour le microscope optique et pour le microscope électronique à transmission et l’observation par réflexion pour le microscope électronique à balayage. Donc le microscope travaille en : Transmission : l’échantillon est traversé par des photons et électrons ; les lentilles de verre (MO) ou les champs électromagnétiques (MET) permettent l’obtention d’une image qui est reprise par l’oculaire (MO) ou écran fluorescent (MET). Réflexion : le microscope ne capte que les rayons réfléchis par les parois de la préparation. Ce type de microscopie donne une image de la surface des objets et non de leur structure interne. L’intensité étant fonction de l’orientation des parois par rapport au système optique, cela donne une image « en relief » de l’objet. Elles ne sont donc pas applicables à des objets sans relief comme les coupes de tissus ! Elles nécessitent « un éclairage latéral » de l’objet. Ce mode de microscopie est peu utilisé, il correspond aux loupes binoculaires ou stéréomicroscopes, au microscope à fond noir en microscopie optique et au microscope électronique à balayage (MEB) en microscopie électronique. 3 : Conditions d’observation en microscopie Pour effectuer une observation en microscopie deux exigences s’imposent : l’épaisseur de l’échantillon et le contraste. L’épaisseur de l’échantillon : pour une observation par transmission l’échantillon doit présenter une faible épaisseur afin de permettre le passage du faisceau incident des photons ou d’électrons d’où la nécessité de faire des coupes très très fines. Les coupes exigées en (MO) varient entre 2 µm à 10 µm et de 0,03µm à 0,05µm Le contraste : L’observation par transmission n’est possible que si certaines régions de la coupe absorbent les photons ou les électrons plus que d’autres (effet contraste). En règle générale, les constituants cellulaires présentent des contrastes naturels faibles d’où l’utilisation de certains artifices tels que les montages optiques qui amplifient les contrastes naturels comme le microscope à contraste de phase ou des colorants vitaux sélectifs (MO) ou encore des sels de métaux lourds comme les sels de plomb (ME).  4 : Types de microscopes optiques : Un certain nombre de microscopes ayant chacun des montages optiques spéciaux ont été mis au point pour permettre l’observation des cellules dans certaines conditions et améliorer la qualité de celle-ci. Le développement de ces microscopes répond principalement à 2 objectifs - augmenter les contrastes pour mieux visualiser les structures subcellulaires - améliorer le pouvoir de résolution (voir des détails de plus en plus petits !) Parmi ces microscopes, on peut citer: Microscope à fond noir; Microscope à contraste de phase ; Microscope à fluorescence; Microscope à lumière polarisée; Microscope à balayage confocal. B : LA MICROSCOPIE ELECTRONIQUE Le microscope électronique est beaucoup plus récent : le premier a été construit en 1931, par Max Knoll et Ernst Ruska, ce dernier a d'ailleurs reçu le prix Nobel de physique en 1986 pour cette invention. Puis il s'est répandu à partir des années 60. La résolution d'un microscope électronique peut atteindre 2 angströms, mais généralement les meilleurs microscopes atteignent 20 angströms seulement. Le principe de fonctionnement d'un microscope électronique ressemble un peu à celui d'un microscope optique sauf qu’au lieu des photons ce microscope fonction avec des électrons le faisceau est produit et accéléré par un canon à électrons (cathode et anode percée). L’ensemble du dispositif est placé sous vide. Les lentilles de verre sont remplacées par des bobines électromagnétiques ("lentilles" électromagnétiques) seules capables de focaliser les électrons, et de créer des images. Avec ces microscopes on ne peut examiner que des cellules tuées, mais le pouvoir séparateur est de l’ordre de quelques A°. On aura donc accès à l’ultra structure des organites. 1 : Types de microscopes électroniques Il existe deux variantes de la microscopie électronique : a) Microscope électronique à transmission C'est la technique la plus performante. Dans son principe, elle ressemble à la microscopie optique en lumière directe. Le faisceau d'électron est émis par un canon à électron, focalisé sur la préparation à l'aide de lentilles électromagnétiques et la traverse, ils sont plus ou moins absorbée (la préparation est dite plus ou moins dense aux électrons), l'image se forme derrière la préparation sur un écran fluorescent similaire à ceux qui équipent les téléviseurs noirs et blanc. Hormis le fait que les absorbeurs d'électrons sont des métaux lourds les mêmes techniques de révélation que pour la microscopie en lumière directe peuvent être utilisées. b) Microscope électronique à balayage (scaning) Bien que de résolution plus faible que la précédente, cette technique donne des images absolument spectaculaires, en pseudo 3D. Le flux d’électrons balaye la surface de l’objet au préalable recouvert d’une couche métallique. Ce sont les électrons secondaires, renvoyés par la surface métallique, qui sont utilisés pour fournir une image. Cet appareil permet de gagner en profondeur de champ, mais son pouvoir séparateur est plus faible que celui du microscope à transmission. Il fournit des renseignements sur l’aspect tridimensionnel des surfaces cellulaires, par exemple. Comparaison entre le microscope optique et électronique M. OPTIQUE Caractéristiques M. ELECTRONIQUE *grossissement : de 25 à 1500 fois * grossissement : 1500à 200000 fois *pouvoir séparateur : environ 0.2µm * pouvoir séparateur : 10A° * préparation est traversée par des photons * Préparation traversée par les électrons *longueur d’onde : 0,4 à 0,8 µm * longueur d’onde : variable de l’ordre de 0,05 A° *lentilles sont en verre * les lentilles sont des champs magnétiques *image : est reçue directement * image : est reçue sur écran fluorescent *les coupes au microtome : 2 à 10 µm * les coupes à l’ultramicrotome : 0,05µm Avantages * on peut voir la cellule en entier * on peut voir la structure fine de la cellule * on peut observer une cellule vivante * on atteint très souvent le niveau moléculaire * on peut utiliser des colorants et voire *a permis de résoudre de vieux litigesdes couleurs réelles(ex : synapse Golgi des végétaux) Inconvénients * on ne peut pas pousser l’analyse * la cellule est morte assez loin * on n'a pas une vue d’ensemble des structures artificielles (artefacts) apparaissent Unités *l’unité est le micromètre ou micron (µm) * l’unité est le nanomètre (nm) 1µm = 10-3 mm 1nm = 1 millimicron = 10-6 mm ou 10-9 m IV : TECHNIQUES DE COUPES ET DE REPLIQUES Le microscope permet d'observer les cellules d'un tissu, mais dans des conditions très strictes : il faut que l'objet à examiner soit transparent à la lumière. Les objets biologiques ne le sont que rarement, à l’exception des objets naturellement très minces : suspensions (sang,..) ou cultures cellulaires. Il faut donc les découper en tranches très minces (coupes) de l'ordre de 5 à 10 microns. Pour cela, il faut « durcir » l’objet par différentes techniques physiques ou chimiques. Mais la coupe causerait des dommages irréparables aux tissus et aux cellules et l'observation ne correspondrait pas à la réalité des cellules vivantes : séparation physique de structures proches plus ou moins entraînées par l’outil de coupe, libération d’enzymes lytiques (protéases essentiellement) contenues dans des compartiments spécifiques (lysosomes, peroxysomes, …) il faut donc au préalable "immobiliser" les structures dans un état aussi proche que possible de l'état vivant et inactiver ces enzymes : c'est le but de toute une série de manipulations qui amèneront les objets biologiques à l'examen convenable au microscope. A : TECHNIQUES DE COUPE Pour un examen morphologique des cellules ou des échantillons biologiques en microscopie, des procédés préparatoires de l’échantillon sont nécessaires. Examen des échantillons en microscopie optique Examen de cellules vivantes Elles peuvent être examinées sans préparation, mais dans un nombre très limité de cas. Il ne peut s’agir que des cellules isolées, naturellement ou en culture. Une cellule animale dépourvue d’exosquelette se déshydrate très rapidement dans l’air. Son observation ne peut s’effectuer qu’en milieu liquide. L’observation en milieu de culture permet de maintenir la physiologie cellulaire. Mais les boîtes de culture interdisent des objectifs de grossissement utile (maximum X5). L’astuce consiste à inverser le montage du système optique : on illumine la boîte par le haut (les condenseurs actuels permettent de focaliser la lumière sur le fond de la boîte de culture) et l’on observe à travers le fond : microscope inversé. Comment observer correctement les cellules vivantes ? Il faut utiliser des techniques qui augmentent les contrastes sans toxicité pour la cellule. Examen des cellules mortes Il est nécessaire la mise en œuvre de manipulations indispensables à l’obtention d’objets minces et contrastés. On ne peut en effet, examiner que des celles colorées ; il est aussi nécessaire d’obtenir des coupes minces de ces cellules et donc de les inclure au préalable dans des substances relativement dure, il faut auparavant les fixer, pour éviter toute altération susceptible de se produire au cours des manipulations. La séquence de ces manipulations est donc la suivante : Prélèvement, fixation, inclusion, coupe et coloration. Techniques de préparation de coupes pour le microscope photonique  Examen des échantillons en microscopie électronique La séquence de manipulation est analogue à celle qui a été exposée pour la microscopie optique. a) Fixation : encore plus exigeante (les artefacts sont plus visibles), elle est réalisée avec des fixateurs spéciaux, comme : le tétraoxyde d’osmium OsO4 et le glutaraldehyde C5H8O2. Ce sont les deux principaux fixateurs chimiques utilisés en microscopie électronique. b) Déshydratation : elle suit le même principe qu'en microscopie optique; mais elle est délicate car les tissus doivent être conservés jusqu'au niveau moléculaire. c) Inclusion : elle se fait dans un milieu très dur, dans des matières plastiques telles que la résine. Une fois refroidi, durci par polymérisation, on obtient un échantillon solide. d) Coupe : effectuée sur un ultramicrotome, elle fournit des tranches encore plus minces, de 50 nm. e) Coloration: c’est plutôt une imprégnation (il n’y a que le noir et le blanc en microscopie électronique) par des sels de métaux lourds, comme les sels de plomb ou d’uranyle, qui augmente le contraste des structures cellulaires. B : TECHNIQUE DE REPLIQUES Elle est généralement applicable au MEB et s’effectue en 03 étapes : la congélation de l’échantillon, la cryofracture et l’obtention des réplique. Préparation de répliques de cryofracture pour l’observation au microscope électronique Le microscope électronique convient tout autant pour l’étude de très petites particules, comme les virus, les ribosomes, éléments de cytosquelette et complexes protéiques. On peut également mettre en évidence la forme des protéines et acides nucléiques individuels au microscope pour autant qu’on leur donne un contraste suffisant. Un des meilleurs moyens de rendre ces substances visibles est l’utilisation de techniques de coloration négative. Il y a également une autre technique largement utilisée pour rendre visible de très petites particules isolées est leur ombrage. LA COLORATION NEGATIVE Les échantillons minces (de quelques nanomètres à quelques dizaines de nanomètres d'épaisseur) sont adsorbés sur une grille métallique recouverte d'un film de carbone fin (quelques nanomètres). Ce sont typiquement des complexes protéiques ou des virus. On forme un dépôt de métal lourd sur toute la surface de la grille sauf aux endroits où se trouvent les particules. Par conséquent, la structure de l’objet se distingue par sa clarté relative sur l’écran fluorescent.Dans cette technique, on place une goutte de colorant (acétate d’uranyle ou phosphotungstate de potassium) sur une grille qui porte les particules à étudier et on laisse s’évaporer la plus grande partie de la goutte. A cause de la tension superficielle, le colorant a tendance à envelopper la particule sur le film qui le supporte et pénètre dans toutes les irrégularités qui s’ouvrent à la surface de la particule. Le reste de la particule recueille peu de colorant.De par sa forte masse atomique, le contrastant dévie les électrons dans le diaphragme objectif. Ainsi l'échantillon biologique apparaît plus clair que ce qui l'entoure, d'où le nom de coloration négative. L'échantillon apparaît blanc sur un fond sombre sur les photographies. L’OMBRAGE Une autre technique largement utilisée pour rendre visible de très petites particules isolées est leur ombrage. Les grilles sont placées dans un espace fermé, où l’on fait le vide. Dans la chambre se trouve un filament composé d’un métal lourd (généralement le platine) avec du carbone. Le filament est porté à haute température, ce qui provoque son évaporation et le dépôt d’un revêtement métallique sur toutes les surfaces accessibles dans la chambre. Le métal se dépose donc sur les surfaces qui font face au filament, tan disque les surfaces opposées de l’objet et les parties du support qui sont dans l’ombre restent non revêtues et incapable de diffracter les électrons. Par conséquent, les zones qui sont dans l’ombre sont éclairées sur l’écran, alors que les régions couvertes de métal sont foncées. Cette relation est inversée sur la plaque photographique, qui est le négatif de l’image. Par conséquent, on représente les préparations ombrées en imprimant une image négative dans laquelle la particule parait éclairée par une vive lumière blanche (correspondant à la surface revêtue), avec une ombre foncée produite par la particule. Cette technique donne un très bon contraste pour un matériel isolé et produit une impression d’image en trois dimensions (3D). V : TECHNIQUES D’ISOLEMENT DES ORGANITES Fractionnement cellulaire Afin d'analyser leur structure ou leur composition, il peut être intéressant de séparer les différentes structures présentes dans la cellule. Pour ce faire, on broie une culture de cellules. La séparation des constituants peut alors se faire par centrifugation. Soumis à l'effet centrifuge, les structures les plus massives se rassemblent dans le fond du tube en rotation. L'accélération centrifuge est exprimée en multiples de l'accélération de pesanteur terrestre notée g. L'accélération à laquelle on soumet les échantillons atteint des valeurs de 100 000 à 200 000 g. Les différentes fractions issues de la centrifugation peuvent ensuite être identifiées et analysés chimiquement. N B : Les techniques histologiques, cytologiques, coloration négative et ombrage, renseignent sur la morphologie des cellules et de leurs organites, alors que les techniques d’Autoradiographie et de fluorescence renseignent sur la physiologie de la cellule.