Compactación del ADN y Arquitectura de la Cromatina 3D PDF

Compactación del DNA y Jerarquías Organizacionales  Introducción Por principio, el material genético de los seres vivos ocupa un volumen limitado dentro del cual se llevan a cabo sus funciones (replicación y transcripción). El almacenamiento del material genético debe permitir la transición...

Compactación del DNA y Jerarquías Organizacionales  Introducción Por principio, el material genético de los seres vivos ocupa un volumen limitado dentro del cual se llevan a cabo sus funciones (replicación y transcripción). El almacenamiento del material genético debe permitir la transición de estado activo a inactivo. Problema común: nunca hay suficiente espacio. La longitud del Acido Nucleico (AN) superaría las dimensiones del compartimiento. Por ello es necesario compactar al AN y organizarlo en paquetes (empaquetarlo). En contraste a la imagen clásica del DNA existiendo como una molécula extendida, en realidad se encuentra deformada, doblada y enrollada en los seres vivos.  Empaquetamiento La densidad del AN en estos compartimientos es elevada (equivalente a la de un gel de gran viscosidad). En bacterias es de aprox 10 mg/ml. En núcleos eucariotas es de aprox 100 mg/ml. En el Fago T4 es de aprox 500 mg/ml. El empaquetamiento de la cromatina es flexible, cambia durante el ciclo celular. Durante la mitosis/meiosis se aumenta el nivel de empaquetamiento del AN para formar cormosomas.  Condensación de genomas virales Diferencia fundamental entre compartimientos pro/eucariotas y los virales: Tamaño El núcleo de los eucariotas adaptado a un genoma de tamaño cambiante (duplicaciónes, deleciones y rearreglos) = SOLO REQUIERE DE UN METODO GENERALIZADO DE EMPAQUETAMIENTO. En los virus: 1).- Cantidad PREDETERMINADA de AN por empaquetar. 2).- Todo debe caber un compartimento codificado por dicho AN. Estrategia viral de mantener las cosas lo más sencillas posible (partícula viral) obliga a diseños compactos. El diseño de TODA partícula viral gira alrededor del ácido nucleico (AN). El genoma está contenido por una CAPSIDE formada por una (o pocas) proteínas alrededor de la cual se incorporan otras proteínas necesarias para la infección del hospedero. El volumen interno del virus raramente posee más espacio del necesario para albergar a la cápside y AN. Condensación de genomas virales El extremo más ergonómico lleva a que la cápside viral esté formada por un solo tipo de subunidad protéica. Dos tipos esenciales de cápsides: 1.- Filamentosas u helicoidales = Empalmamiento helicoidal de proteinas alrededor de AN. 2.- Icosaédricas = formada por estructura pseudoesférica simétrica en forma de poliedro icosaédrico.  Condensación de genomas virales Dos formas de construir las cápsides: 1.- Ensamblar cascarón proteico alrededor del AN, condensando al AN a través de interacciones proteícas. 2.- Construir una cápside vacía y posteriormente introducir el AN.  Condensación de genomas virales Por otro lado, existen virus más complejos... Reovirus y ortomixovirus (influenza) poseen genomas segmentados. Influenza posee 8 segmentos de RNA diferentes (tamaños y secuencias), no obstante algún proceso aun desconocido permite ensamblar partículas virales con exactamente 8 segmentos diferentes. Virus del Mosaico de la Alfalfa posee genoma segmentado empaquetado en cápsides diferentes.  Compactación y jerarquias organizacionales Los cromosomas bacterianos circulares se compactan con poliaminas (como la espermina) las cuales se unen a las cargas negativas del DNA para neutralizar su carga y evitar + ++ la repulsión con el objeto de permitir la formación de + ++ + madejas. + + El problema se agrava cuando se contempla que el ser + humano posee 3 mil millones de pares de bases...pero no somos los más “grandes” La salamandra común...poseee 4x más DNA que nosotros. Incluso algunas plantas poseen más DNA que nosotros. Paradoja el tamaño del genoma no es directamente proporcional a la complejidad del organismo.  Cromosoma bacteriano (Genóforo) Varias proteinas bacterianas fijadoras de DNA semejantes a las proteinas cromosómicas eucariotas han sido descubiertas. Otra proteina bacteriana involucrada La proteina HU es un dímero que condensa al en la condensación del genoforo es DNA, envolviendolo en una estructura la H1 (también llamada H-NS) forma esférica. puentes entre dos hebras de dsDNA.  Compactación y jerarquias organizacionales El DNA (ca 2 mts de largo) se almacena en el núcleo de las células eucariótas. El diámetro del núcleo celular fluctúa entre 5 y 10 m. El contorno de los cromosomas mide entre 1.6 y 8.2  m. Compactación cromosómica human altamente eficiente: Condensación de 100,000 X Compactación y jerarquias organizacionales Supercoiling (super-embobinado) Es crítico para compactación del DNA. Especialmente util durante eventos de división nuclear. Las cohesinas y condensinas (Proteinas de mantenimiento estructural de los cromosomas) la inducen para condensar las cromátides. Resulta de la apertura del duplex de DNA durante la síntesis de DNA/RNA para darle acceso a la polimerasa (girasa, una topoisomerasa tipo II). Supercoiling (super-embobinado) Plectonémica Solenoide Superbobina  Supercoiling (super-embobinado) En procariotas la plectonémica es suficiente para su pequeño genoma circular. Eucariotas emplean diversos grados de ambos tipos (pero la solenoidal es más eficiente). La solenoide reduce el espacio ocupado por DNA acoplado a histonas a través de giros que lo compactan en fibras de 10 y 30 nm. Compactación plectonémica: Bobinas extendidas con sentido horario. Se observa en DNA in vitro. Compactación Toroidal (solenoidal): Giros anti-horarios muy apretados DNA in vivo Más compacto que la plectonémica.  Supercoiling (super-embobinado) Duplex relajado, una vuelta sobre su eje cada 10 bp. Una molécula de DNA circular (como en las bacterias) puede ser sometida a torceduras que la obliguen a ocupar menos espacio...DNA-B Figura 8 = super-embobinado (plectonémico) elemental. Lóbulos de figura 8 exhibirán rotación horaria o antihoraria (sobreembobinado o infraembobinado). Superembobinado Relajado Compactación en levaduras  Supercoiling (super-embobinado) Topoisomerasas generan o relajan el super- embobinamiento. La Topoisomerasa II eucariota no puede introducir giros negativos. El super-embobinado positivo es deseable por que: 1.- Reduce la posibilidad de interacciones con proteínas (hendidura M y m). 2.- Reduce el espacio físico ocupado por el DNA.  Nucleosomas Estructura propuesta por Roger Kornberg (1974). Premio Nobel Quimica 2006 “base molecular de la transcripción de DNA hacia RNA” Cromatosoma = Nucleosoma + proteina espaciadora. Nucleosoma posee coro de histonas (octámero) y ca 146 bp DNA. Compactación: 7x Histone complexes Kornberg R 1974  Nucleosomas Histonas poseen carga positiva y hacen función de poliaminas bacterianas. Coro formado por ocho histonas formando disco de 11 nm de diámetro. 146 bp de DNA se enrollan alrededor de coro. Particulas de coro separadas entre ellas por 54 bp (varía desde 8 hasta 114 bp) de DNA espaciador envuelto alrededor de proteina espaciadora (H1). Cantidad total en particula cromatosomal ca 200 bp de DNA. Las histonas interfieren con la unión de otras proteinas al DNA. El enrollamiento del DNA alrededor de las histonas es un proceso dinámico y regulado. 1.8 vueltas de DNA por nucleosoma.  Compactación y jerarquias organizacionales Formación del nucleosoma aporta al super-embobinamiento negativo (DNA in vivo)...por lo que no necesitamos una enzima para lograrlo (topo II no puede). Modelo de collar de cuentas en ME: Cuentas = nucleosomas Hilo = DNA espaciador H1 se une al DNA espaciador Pérdida de H1 no disrumpe nucleosoma Observable bajo microscopía electrónica. Solenoide - Fibras de 30 nm Solenoide - Fibras de 30 nm 6 nucleosomas forman un arreglo helicoidal. El arreglo helicoidal resultado del super- embobinamiento solenoidal del “collar de cuentas” forma una fibra de 30 nm. El “collar de cuentas” se fija al andamiaje nuclear. Fibra cromatínica observada en ME. En general solo regiones inactivas (sin expresión genética). Corresponde a la mayor 1 parte de la heterocromatina. 6 2 Compactación: 100x 5 3 4 Asas de 300 nm Fibras de 30 nm forman asas largas (300 nm de largo) ancladas al andamiaje nuclear. Cada asa posee aprox 75,000 bp Asas de 300 nm = Dominios estructurales (no confundir con dominios funcionales...otro cuento). Andamiaje nuclear Asas 300 nm Andamio (c) Looped domains (300-nm fiber)  Asas, dominios y andamiaje eucariota La cromatina de interfase se encuentra dispersa ocupando una gran parte del volumen nuclear. En contraste, los cromosomas de la metafase representan corpúsculos organizados de estructura reproducible. Los cromosomas eucariotas se encuentran formados por fibras de dsDNA de 10nm finamente enrolladas para formar asas y dominios. Las asas se encuentran ancladas al andamiaje proteico cromosómico. Andamiaje nuclear Asas 300 nm Andamio Asas, dominios y andamiaje eucariota Los cromosomas eucariotas depletados de DNA conservan su aspecto morfológico. El andamiaje del cromosoma de metafase constituye una red intrincada de fibras densas de la cual emanan asas de DNA de aprox 10 a 30 M (30 a 90 kb). El DNA puede ser digerido sin deformar al andamiaje. Depleción de DNA DNA depletado de histonas Andamiaje cromosómico Asas, dominios y andamiaje eucariota Las células en interfase poseen un matriz nuclear filamentosa ocupando el interior del núcleo. La cromatina se adhiere a dicha matriz lo cual es indispensable para la transcripción y replicación (Topoisomerasas). Matriz nuclear de interfase = Andamiaje cromosómico de la metafase Asas, dominios y andamiaje eucariota Los sitios del DNA que entran en contacto con el sustrato protéico de la matriz nuclear durante la interfase se denominan MARs o SARs. MARs = Matrix Attachment Regions SARs = Scaffold Attachment Regions MARs o SARs: No hay secuencias de DNA conservadas. Secuencias de DNA son ricas (70%) en A-T. Secuencias poseen sitios con efectos-cis reguladores de la transcripción. Sitio de reconocimiento para la Topoisomerasa II usualmente presente. Asas, dominios y andamiaje eucariota Topoisomerasa II es un componente importante tanto del andamiaje cromosómico como de la matriz nuclear = Resalta la importancia de la topología del DNA en ambas instancias. Rosetas En los cromosomas condensados (de metafase) las asas (entre 6 y 9) de 300 nm forman estructura helicoidal llamada kernel o roseta. Andamiaje nuclear = cromosómico Bobinas Las rosetas (ca 30) se apiñan una sobre otra de manera helicoidal formando las bobinas de las cromátides. Bobina cromatínica (solenoide cromatínico) = como el cordón teléfono. Bobina Roseta Asa Cromátides Bobinas cromatínicas empalmadas forman cromátides. Cromosomas Cromosoma de metafase forma más compacta. DNA depletado de histonas Compactación: 15,000 x Andamiaje En los procariotas el cromosoma consiste en una cromosómico sola molécula circular de DNA de doble cadena desnuda (con excepción de las poliaminas). Los eucariotas poseen un conjunto diploide de cromosomas lineares. Cromosomas Especie Num. Cromosomas (diploide) D. melanogaster 8 Cobayo 16 Pichón 16 Caracol de tierra 24 Lombriz de tierra 36 Zorro 36 Gato 38 Cerdo 38 Ratón 40 Rata 42 Conejo 44 Hamster 44 Liebre 46 Humano 46 Gorillas, chimpances 48 Oveja 54 Elefante 56 Vaca 60 Burro 62 Caballo 64 Ophioglossum “Adder’s-tongue Fern” Perro 78 Tropical/Subtropical Pollo 78 1400 Cromosomas Carpa dorada 104 Centrómeros y Telómeros Centrómero formado por heterocromatina empleada en la fijación a huso mitótico/meiótico (microtúbulos). Telómero formado por heterocromatina repetitiva destinada a proteger extremos cromosómicos. Centrómeros y telómeros contienen cantidades abundantes de DNA de secuencia simple repetitiva (SSR). SSR: Multiples copias en tandem de secuencias cortas). SSR desempeñan funciones estructurales en telómeros y centrómeros. ¡Los centrómeros humanos poseen una secuencia de 170 bp repetida entre 500 y 3,000 veces! ¡Misma secuencia telomérica para todos los vertebrados! TTAGGG  Mini cromosoma “genes activos NO deberían tener nucleosomas “  Nucleosomes of SV40 are transcribed Nucleosomes mRNA Gariglio P, Chambon P.J Mol Biol. in: Genes IX, Lewin B. Organización del genoma espacial Arquitectura 3D de la cromatina Analizamos la compactación del DNA durante un proceso de división celular, pero como se encuentra en un estado “normal”…. Los nucleosomas y hasta solenoides, espacialmente se encuentran cercanos para formar dominios asociados topológicamente (TADs) donde esa parte de la cromatina se encuentra cercana una de otra.  Loops (Bucles) TADs Alta orden de la organización de la Compartimentos cromatina y su arquitectura nuclear funcional Territorios FRITZ AJ, GENES CHROM. CANCER. 2019 Características de la cromatina en diferentes escalas SIKORSKA N. Journal of Molecular Biology. 2020 Modelo 3D de la cromatina del mamifero Territory Nuclear lamina TAD CTCF / Cohesin GOEL VY. Wires. Developmental Biology. 2020  Nuclear lamina / LAD / Compartment A, B / CTCF Los TADs más cercanos a la lámina nuclear son conocidos como LADs (Dominios asociados a lamina) PONGUBALA J. Frontiers in Immunology. 2021 MODEL OF CHROMATIN ORGANIZATION Loops (Bucles) se forman a partir de sitios con secuencias CTCF donde es reconocida por un complejo cohesinas para formar el característico lazo (como de vaqueros). Quedan dentro diferentes secuencias. Cabe resaltar que una alteración en los sitios o mayor tamaño de la secuencie entre los sitios de reconocimiento o frontera del CTCF podría causar instabilidad genómica. MIYAZAKI K. Frontiers in immunology. 2021  Compartmentalization of active and inactive chromatin El compartimento B es conocido como heterocromatina donde no hay expresión génica, mientras que el compartimento A es llamado eucromatina y está activo transcripcionalmente. STEENSEL AND FURLONG. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Separación por micro fase promueve la formacion de los dominios activos e inactivos de la cromatina GHOSH RP. ANNU REV CELL DEV BIOL. 2021