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Techniques utilisées en MicroBiologie I) Courbe de croissance d’une culture microbienne Une préculture fournit l’inoculum pour ensemencer un milieu frais à t0 si les conditions sont favorables et que le milieu est non renouvelé. On obtient cette courbe :...

Techniques utilisées en MicroBiologie I) Courbe de croissance d’une culture microbienne Une préculture fournit l’inoculum pour ensemencer un milieu frais à t0 si les conditions sont favorables et que le milieu est non renouvelé. On obtient cette courbe : Phase de latence : la population n’évolue pas. Les cellules s’adaptent aux nouvelles conditions du milieu et met en place son métabolisme. Phase inexistante si les 2 conditions sont réunies : Les conditions de préculture et de culture sont les mêmes ET si la préculture était-elle même en phase exponentielle au moment où on l’a utilisée Phase exponentielle : multiplication, croissance explosive Phase stationnaire : milieu n’étant pas renouvelé, les nutriments s’épuisent et les déchets métaboliques s’accumulent (ce n’est pas un problème de place) et la pression osmotique augmente. On atteint un plateau. Les cellules ne meurent pas de suite, elles sont en phase de survie. Chez certaines espèces : Sporulation Production d’antibiotique Phase de déclin : mort puis lyse des cellules : « autolyse ». Les spores (de forme R) produites résistent  II) La sélection Sélection : élimination des autres microorganismes (grâce à des antibiotiques ou conditions spécifiques) Postulat de Koch : Objectif : Identifier le microorganisme responsable de la maladie Isolement et culture Purification dans des cultures pures Inoculation des cultures pures dans des souris saines On cherche les souris qui vont développer les mêmes symptômes de départ avec inoculation de cellules de cultures Vérification si souris malade à cause de l’inoculation On incube et observe : culture pour vérifier s’il y a le même pathogène Cultures pures ou clones = cellule provenant d’un seul micro-organisme, génétiquement identique (quelques différences à cause de mutations) a. Méthodes culturales Milieu sélectif : utilisés pour déceler la présence de microorganismes spécifiques, que si le MO est minoritaire. Cela permet d’augmenter leur proportion Les autres sont considéré comme contaminant b. Méthodes non culturales Pasteurisation : traitement de certains produit alimentaire visant à éliminer le MO. Chauffage entre 62 et 88°C sans ébullition pendant 30mn, puis on effectue un refroidissement brut Elimine les thermosensibles, souvent pathogènes On garde les thermorésistants et les thermophiles Filtration : suspension avec des microorganismes filamenteux et unicellulaire Si on cherche les unicellulaire on récupère le filtrat, si on veut les filamenteux on récupère sur le filtre  c. Démarche pour l’analyse microbiologique Isolement : Echantillon de colonies isolées On ensemence un milieu solide avec un petit inoculum On prend des öses qu’on répartit en stries (ou en rateau) sur le milieu solide On obtient un tapis cellulaire, il faut faire une série de dilution pour obtenir des CFC o CFC : centre formateur de colonie (une ou quelques cellules) o Colonie (millions/milliard de cellules) Colonie isolée = colonie pure si seulement elle ne contient pas des cellules d’origine différente, condition assurée que sur milieu non sélectif Pour assurer l’obtention d’une colonie pure (clone) on refait un cycle d’isolement sur un milieu non sélectif La caractérisation = étude séparée de chaque clone Souche : culture pure repiquée une ou plusieurs fois Repiquage : utilisé pour la conservation, caractérisation  III) Etude quantitative des populations ▶ Évaluer le niveau de contamination d’aliments de milieux ▶ Tester l’efficacité d’agents antimicrobiens ▶ Etudier la croissance (production) Un dénombrement se fait toujours sur un milieu liquide → il faut broyer le milieu solide pour obtenir un liquide Dénombrement direct On compte les cellules au microscope. Une « cellule de comptage » permet de rapporter le nb de cellules au volume dans lequel on les a comptées (concentration). On rapporte le nombre moyen de cellules sur 16 petits carrés au volume correspondant La concentration est en cell/mL Les cellules mortes mais non détruites sont prises en compte sauf si on peut les différencier des vivantes (colorations spécifiques) Dénombrement indirecte On étale en nappe sur milieu solide et on compte les colonies Si >300 colonies : erreurs de comptage Si Centre Formateur de Colonie Comptage des colonies aisé mais résultat non immédiat C’est aussi une méthode d’isolement Ne pas confondre cellule, CFC et colonies. Après une galerie de dilution et étalement on obtient des CFC. Une spore peut être un CFC car si conditions favorables, va germer et se développer Conclusion : Les techniques classiques d’isolement et caractérisation des microorganismes sont fondées sur leur culture Moins de 1 % des espèces de microorganismes a été cultivé Métagénomique : le séquençage en « masse » de l’ADN présent dans des échantillons naturels a permis de détecter une grande diversité de microorganismes jamais cultivés Défi : définir leurs exigences nutritionnelles et d’environnement pour pouvoir les cultive  LA LUTTE ANTIMICROBIENNE Les agents antimicrobiens ont pour effet sur les microorganismes soit : De les extraire du milieu De les tuer : effet microcide (irréversible) D’inhiber leur croissance : effet microstatique (réversible) (état de survie) L’agent antimicrobien idéal serait efficace contre les microorganismes et sans effet vis à vis des plantes et des animaux → cela n’existe pas I) Traitements stérilisants Stérilisation : extrait ou tue tous les microorganismes. Comme les endospores sont les plus difficiles à tuer, efficacité microcide évaluée sur elles a. Agents physiques → Chaleur Chaleur sèche (gaz sans eau) : flambage, four pasteur (air chaud) Chaleur humide (eau chaude liquide ou vapeur) − Appertisation : eau bouillante − Autoclavage : vapeur d’eau (121°), 20 min à 1 bar au-dessus de la pression atmosphérique (200kPA) → filtre La filtration permet d’arrêter les microorganismes. Ex : filtration de l’atmosphère de salles d’opération + filtration de la bière après fermentation A 0,45µm : tous les virus passent sauf les bactéries et archées A 0,22 µm : arrête les bactéries et archées → radiation Rayons gamma, X, UV : peuvent être des traitements stérilisants ou non stérilisants selon les rayonnements et la durée b. Agents chimiques Certains produits toxiques sont utilisables pour le matériel inerte et non alimentaire − Acide sulfurique, chaux vive, formol : désinfection carcasse… II) Traitements non stérilisants = Des microorganismes peuvent persister malgré les traitements stérilisants. L’effet microcide ou microstatique dépend de la relation entre l’agent (nature/intensité) et le microorganisme a. Agents physiques → Chaleur Chauffage modéré : pasteurisation (permet sélection), tue uniquement les thermosensibles (et la majorité des pathogènes sont thermosensibles alors que la majorité des microorganismes bénéfiques sont thermorésistants) : 65°C, durée courte, refroidissement rapide → Froid Le froid ne tue pas les microorganismes, il les conserve, effet microstatique. Attention, un produit congelé n’est pas stérile Un produit pasteurisé peut être altéré par les micr vivants qu’il contient → Radiations Rayonnement non ionisant UV : endommagement ADN sb, apparition mutations ponctuelles Rayonnements ionisants gamma et X : cassures dB b. Agent physico-chimique Forte pression osmotique : peu d’eau disponible ; dessiccation, lyophilisation Forte dessication, survie champignons c. Agents chimiques → Conservateurs alimentaires = activité antimicrobienne : directe ou indirecte Directe : sel, acide acétique, nitrites, sulfites Indirecte : sel ou sucre en grande quantité Forte pression osmotique → Antiseptiques et désinfectants Antiseptique peut toujours être utilisé sur une matière vivante alors que désinfectant pas toujours utilisable pour matières vivants − Halogènes : dérivés chlore, dérivés iode − Peroxydes et ozones : eau oxygénée et ozone − Métaux lourds − Alcool : très efficace contre les bactéries et mycètes mais moins contre endospores. Dénaturation protéines/lipides + détérioration des membranes. − Agents de surface : réduit tension superficielle entre molécules d’un lipide → agent mouillant permet une extraction mécanique (mise en suspension puis rinçage) − Colorants : éosine et violet de gentiane → Antibiotiques (Ab) Les agents physiques et chimiques décrits jusqu’à présent : − Peu sélectifs − Inutilisables en usage interne La spécificité des antibiotiques touche des fonctions vitales seulement chez les organismes visés (« spectre » de l’antibiotique) Les antibiotiques ont une nature chimique variée. Ils sont synthétisés par les microorganismes ou plantes Le premier Ab identifié : pénicilline qui vient du Penicillium Antibiotiques antibactériens : Certains antibiotiques sont toxiques pour les eucaryotes si les quantités sont trop élevées Ab anti-eucaryote Plasmodium → paludisme Candida → candidose Phytophthora : pourriture noire de la pomme de terre Les pathogènes eucaryotes ressembles bcp à l’hôte Si les pathogènes sont des eucaryotes, les antibiotiques peuvent agir sur les cellules de l’homme  Résistance à un antibiotique d’origine génétique : − Résistance par mutation au niveau de la cible : mutation ponctuelle au niveau de la cible, plus reconnaissance de la cible par l’antibiotique − Résistance par mutation au niveau du transporteur : si antibiotique a besoin d’un transporteur pour rentrer dans cellule : mutation transporteur empêche l’antibiotique de rentrer − Résistance par inactivation : acquisition d’un gène qui produit une enzyme dégradant l’antibiotique ou le modifiant ce qui l’empêche d’arriver à sa cible − Résistance par efflux : dès que l’antibiotique rentre, il ressort par un transporteur d’efflux Résistance d’origine physiologique − La plupart des antibiotiques sont efficaces uniquement sur des cellules en croissance − Si pas croissance, pas de synthèse donc inhibition de synthèse exercé par l’antibiotique n’a pas d’effet − Si utilisation fréquente d’antibiotiques, les micr sensibles disparaissent et les microorganismes résistants envahissent la niche écologique on obtient une population résistante → Phagothérapie Phage : virus spécifique des bactéries : lutte contre les bactéries → cibles très spécifiques. Très utilisé dans les pays à l’EST de l’Europe