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Nutrition azotée Introduction: 1-L'azoteestunélémentcléchezlesvégétaux.Ilentredanslacompositiondenombreuses T moléculesbiologiques(aa,basespuriquesetpyrimidiques,cofacteurs(NAD,NADP,FAD...), pigments à noyau pyrrole (chlo...
Nutrition azotée Introduction: 1-L'azoteestunélémentcléchezlesvégétaux.Ilentredanslacompositiondenombreuses T moléculesbiologiques(aa,basespuriquesetpyrimidiques,cofacteurs(NAD,NADP,FAD...), pigments à noyau pyrrole (chlorophylle...), composés secondaires (alcaloïdes...) L'azote est présent dans le sol sous différentes formes minérales : -dans le sol sous forme d'ammonium(N H4+) et sousforme de nitrate (NO3-) - dans l'atmosphère (N2) ou N2 oxydé, lié à de l'oxygèneau cours des orages (NO2, N2O) Les végétaux chlorophylliens sont autotrophes pour le carbone puisqu'ils le prélèvent sous forme minérale. Il en est de même pour l'azote. I -Absorption de l'azote minéral 1 - Mis en évidence des besoins azotés d'une plante eux moyens d'évaluer les besoins en azote d'une plante : l'incinération ou la culture D hydroponique. L'incinération d'une plante permet de minéraliser toute la matièreorganique. Onpeutalorsdoserl'azoteminéraletsavoirdonclapartd'azotequ'ilyadansuneplante.La culture hydroponique est une culture en milieu contrôlé hors sol en alimentant la plante uniquement avec une solution nutritive. L'azote minéral peut être dosé dans la solution au cours du temps. On sait donc ce qu'absorbe la plante. 2 - Absorption des ions T2 a-Localisation:l'immersiondesracinesdansunesolutiond'eauminéralisée, surmontéed'unesolutiond'huile,montrequepourqu'uneplanteabsorbelasolutiondusol,il fautquesespoilsabsorbantstrempentdanslasolutionminérale.Lespoilsabsorbantssontles structures principales de l'absorption racinaire. T3-T4- importance des poils absorbants, transporteurs membranaires, transport apo versus symplastique. Des systèmes racine/sol améliorés (cluster de racines, différentes symbioses avec champignons ou bactéries)(à développer). b - Mécanisme actif : T5 - Des études physiologiques où on a fait varier la concentration en NO3 d'une part et d'autres facteurs externes comme la température, la lumière... ont montré que le nitrate absorbéparlaplantedépendplusdesesbesoinsquedeladisponibilitédanslemilieu.Ilya donc unerégulation de l'absorptionde cet ion -->on a donc untransport actif. Desplantescultivéessansnitratesonttransféréessurunmilieuricheennitrate.Onremarque une augmentation linéaire de l'absorption dans une première phase puis une courbe d'absorptionquidevientexponentielle.Siuninhibiteurdelasynthèsedesprotéinesestajouté aumilieuonn’observepascettesecondephase.Cetteexpériencemontredoncquedeuxtypes detransporteursparticipentàl'absorptiondunitrate.Unpremierquiestconstitutif(absorption linéaire) et un second inductible par le substrat et dont l'action vient s'additionnée au premier. T6 Les plantes disposentdeplusieurstypesdetransporteursmembranairespourlenitrateet l'ammonium, l’urée…. Ces transporteurs peuvent être constitutifs (toujours présent) ou inductibles. Par ailleurs ces transporteurs sont soit à forte ou faible affinité. HATS: High affinity transportsystemouLATS:Lowaffinitytransportsystem.Lestransporteursàfaible affinité fonctionnent avec des fortes concentrations de nitrate (ou ammonium). Les transporteurs à haute affinité fonctionnent avec des concentrations faibles de minéraux. c - De la racine au xylème T7UnefoisentréparsymportavecrejetdesprotonsparATPase,(ouenantiportavecrejetde OH-, voir diapo suivante) le NO3 a plusieurs devenir.Il peut être - exporté dans le xylème. La diffusion simple par des plasmodesmess'effectuelelongd'un gradient radial du cortex. Puis un transport actif s'effectue pour entrer dans le xylème. 1 - réduit dans les racinespardeuxenzymeslanitrateréductase(NR)puislanitriteréductase ( NiR). - stocké dans les vacuoles et participer à l’abaissement du potentiel osmotique. 3 - Absorption d'ammonium et physiologie du végétal : T8-NH4 estlaformepotentiellementlapluséconomiqued'azotepourlaplantecarilestdéjà sousformeréduite.L’ammoniumentreenantiportavecuneexcrétiondeprotons.Cependant, cette forme peut affecter la physiologie du végétal par deux effets principaux : - L'acidification du milieu racinaire - La perturbation de la nutrition hydrominérale regroupée sous le terme de syndrome ammoniacal. a - Acidification du milieu racinaireT9 L'absorption de NH4 entraine une accélération de la sortie de H+ dans le milieu extérieur. Cetteacidificationestdepeud'ampleurdanslesolenraisondesonpouvoirtamponmaispeut être significative dans le cas d'une nutrition hydroponique. L'acidification delarhizosphère provoque à son tour une inhibition de l'absorption de l'ammonium, due à la difficulté d'exsorber les protons. Une carence azotée entraîne une baisse de croissance de la plante. b - Syndrome ammoniacalT9-T10 -Unebaissedecations:NH4+ utiliselesmêmescanauxioniquesqueleK+donccompétition. Une fois entré, onauneintégrationrapidedel'ammoniumdanslesacidesaminésetdoncil disparaît rapidement en tant que cations, d'où un déficit en cations. - Un déficit en acide organique : première cause, les ac. org sontutilisésavecl'ammonium pour former des acides aminés. La seconde cause, c'est l'absence de nitrate quiempêchela formation d'acides organiques. L'absorption de nitrate conduit à une sortie de OH-. Or ces OH- peuventsecombineravecduCO2 pourfairedescarbonates(HCO3)quipeuventformer des acides organiques en réagissant avec R-COO-. - Une augmentation des acides aminés par assimilation de l'ammonium et une baisse des sucres. c -Nutrition mixteT11 La nutrition mixte montre que le nitrate facilite l'absorption de l'ammonium. En effet, le nitrateentresymportavecH+etl'ammoniumentreenantiportavecH+ .Parailleurs,lenitrate migre facilement dans les feuilles et induit une augmentation de la photosynthèse. Enconclusionunenutritionmixteestfavorableàlaplante.Cecisetraduitparuneproduction de matière fraiche plus importante. Par l'absorption des deux ions (ammonium, nitrate) la plante résout le problème de : - l'acidification de la rhizosphère - du maintien de l'osmoticum. Le nitrate est absorbé et mis en réserves dans les vacuoles - une photosynthèse meilleure --> migration du nitrate vers les feuilles, réduction dans les feuilles en échanges d'assimilats vers la racine. d -Adaptations à la nutrition ammoniacale Dans la nature, l'ammonium qui provient de la dégradation de l'azote organique est rapidement oxydé en nitrate par les bactéries nitrificatrices. Cependant ces transformations peuvent être inhibées par - une température trop basse - un pH trop bas - un manque d'oxygène Il existe aussi des mécanismes d'adaptations Lesconifèresontsouventdesectomycorhizesquipermettentàlaplanted'oxyderl'ammonium en nitrate. Ceci permet de rétablir la balance ammonium/nitrate dans la plante 2 esplantesenC4produisentplusd'acidesorganiquesgrâceàlacarboxylationduPEPparla L PEPcaseorcePEPprovientdupyruvatedoncduglucose.Cesacidesorganiquespeuventvont donc piéger plusfacilementl'ammoniumpourfairedesacidesaminésetlàaussiabsorberle surplus d’ammonium. Enfin, d’autres plantescommeleriz,quiaunaérenchyme,émetdel'oxygèneauniveaude ses racines facilitant la présence de bactéries nitrificatricesquivontoxyderl’ammoniumen nitrate. 4 - Origine de l'azote minéral a - L'humificationT12 ar une triple action mécanique, chimique et biologique, les animaux du sol P interviennent dans les processus de décomposition de la matière organique. Cette décomposition conduit à l’humus, une matière organique par l'action des microflores humifiantes où à des éléments minéraux si l’humus est réduit en éléments plus simples par une microflore minéralisante. L'action mécanique. Les animaux dans le sol fragmentent les matières organiques. Les vers de terre les fragmentent grossièrement. Puis, dans l'ordre, les myriapodes, les collemboles, les acariens et enfin les nématodes procèdent à une fragmentation de plus en plus fine. Cette fragmentation a pour effet d'augmenter considérablement la surface d'attaque des matières organiques par les bactéries et les champignons du sol. e passage de la matière organique dans le tube digestif de ces animaux a pour effet L de la mélanger à diverses sécrétions intestinales, formant des colloïdes humiques. Il s'ensuit la formation d'agrégats stables dont les plus remarquables sont ceux que laissent les lombrics. ous ces animaux participent au transport actif de la matière organique dans les T horizons du sol. En outre, en fouissant, ces animaux améliorent l'aération du sol ainsiquelacirculationdel'eau.Onestimequelesversdeterreassurentàeuxseuls plus de 50 % de la macroporosité dans lesolquandletravailmécanique(labour) n'en assurerait qu'à peine un quart L'action chimique es vers de terre ne se contentent pas de répartir les matières organiques dans le L profil d'unsol.Parcequelecalciumestindispensableàleurmétabolisme,lesvers de terre circulent aussi cet élément. Onestimequecesanimaux,enremontantcet élément vers les couches supérieures, s'opposent au lessivage et par voie de conséquence, à la décalcification des sols. es déjections des vers de terresonttrèsrichesenpotassium,enammoniaque,en L phosphore et en magnésium. Ces éléments sont surtout mieux échangeables et mieux assimilables quand ils ont transité par leur tube digestif que lorsqu'ilssont adsorbés sur les colloïdes argilo-humiques. La faune du sol joue un rôle fondamental d'intermédiaire entre le sol et la plante. 3 L'action biologique ous les animaux danslesolsontnécessairementmicrophytophages.Laraisonen T estquelesalimentsquecesanimauxconsommentsontobligatoirementcouvertsde bactéries, de mycéliums ou de cyanobactéries. I l est certain qu'un bon nombre de ces microorganismes sont détruits par les processus digestifs (bactéries saprophytes surtout). Mais il est probable aussi que d'autres de cesorganismes,nondétruits,sontstimulésaucoursdecetransit.C'est probablement le cas des organismes de la microflore humifiante puisque l'on constatequel'humusseformeplusrapidementàpartirdesdéjectionsanimalesqu'à partir des débris végétaux n'ayant pas subi de transit intestinal. ‘ou l’intérêt du lombricomposteur b - Minéralisation de l'humusT13 résentation rapide du cycle de l’azote et des différents acteurs P T14 - Ammonisation : c'est la première étape de minéralisation de l'azote qui conduitàla libération d'ammonium (NH4+ ), ammoniac (NH3) ou ammoniaque (NH4OH) suivant le pH. Cette minéralisation fait suite à une protéolyse (l'azote organique provient surtout de la dégradationdesprotéines).Deuxtypesderéactionsréaliséespardesbactériesammonifiantes commeBacillus subtilis. T15 - Nitrification : cette étape conduit à la formation de nitrates par nitrosation et nitratation. Cette oxydation est très exergonique et dégage de l’énergie. II - Assimilation des ions nitrates et ammoniacaux 1 - La réduction des nitrates : a - Généralités T16 Mise enévidence.Plantdetomatecultivéquelquesjourssansazote.Apportdenitrate. Dosagecinétiquedel'assimilationdanslaplante.Auboutde24Honretrouvedunitratedans la feuille, puis du nitrite au bout de 36H et enfin de l'asparagine au bout de 48H. T17D'oùvientdonclepouvoirréducteur?Onobserveunecompétitionentrerespirationet réductiondesnitrate.LeNADHviendraitdoncdel'activitérespiratoire.Delamêmefaçonon observe une compétition entre activité photosynthétique et réduction du nitrite.LeNADPH viendrait donc de la photosynthèse. T18 Laréductiondel'azotes'effectuedoncendeuxétapes.LaNRestsituéedanslecytosol alorsquelaNiRestsituéedansleplaste.L'activitédechacuneestliéeàdestransporteursqui permettent aux nitrate et nitrite de traverser la membrane plasmique le tonoplaste ou l'enveloppe chloroplastique. b - Structure et fonction de la nitrate réductase : T19Lanitrateréductaseestuneenzymehomodimérique.Chaquemonomèreestconstituéde 3 domaines fonctionnels. A chaque domaine est associé un cofacteur. Les 3 domaines permettent le transfert des électrons provenant du NADH au nitrate. L'étude in vitrodecet enzymeapermisdemettreenévidencedesdonneursetdesaccepteursartificielsd'électrons. Ces molécules ont permis de caractériser la sous-unité dysfonctionnante chez des mutants. Para ailleurs la caractérisation de ces mutants a été réalisée par la mesure d'activité enzymatique partielle et par la reconnaissance par un anticorps. 4 Ils ne comprennent pas bien cetteexpérience.L’idéeestdevoircommentonpeutdécrypter les causes d’un disfonctionnement et les caractériser d’une manière moléculaire. c - Régulation de la nitrate réductase L'étude de la régulation d'une enzyme s'effectue généralement par 3 voies. - le clonage des gènes et l'étude des activités enzymatiques correspondantes - L’expression des gènes caractérisés dans des plantes transgéniques - L'étude de mutants déficients pour ce gène omment isoler des mutants ? C T20Desmutantsdéficientsennitrateréductase(NR-)ontétéisoléspartraitementmutagène sur graines. Le problèmeestlecribledesgrainesmutéessurlegèneétudié(iciceluicodant pour la NR). Utilisation du chloratecommeanaloguedunitrateetquiestréduitenchlorite. Cecomposéétanttoxiquepourlescellules,lesplantesexprimantlaNRserontintoxiquéeset mourront. Il faut néanmoins alimenter la plante en azote d'où un apport d'ammonium qui permettra la production d'acides aminés comme la glutamine. omment étudier l’expression d’un gène ? C T21LeclonageetlaconnaissancedoncdelaséquencecodantedelaNRpermetdefairedes sondespourdesNorthernblotetdemanièreplusactuelpermetaprèsextractiondesARNmde faire une réversetranscriptionpourfairedesADNc.CesADNcpeuventêtreutilisercomme matrice avec des amorces spécifiques pour l'amplification par PCR de la séquence codant pour la NR. C'est une autre manière de voir le niveau de transcription d'un gène. On peut utiliser un PCR classique ou une PCR quantitative. 22Chezdesplantesmutantespourlegènedelanitrateréductase(marquéNR-)onaréalisé T destransformationspourréintroduirecegènesoitavecsonpromoteursoitavecunpromoteur constitutifdoncnonrégulé.Cetransformantsertdetémoinpositif.Cesplantesmutantespuis transforméessontcultivéesaudépartenabsencedenitrate.Chezlaplantetémoinonretrouve en abondance des transcrits du gène NR, des protéines NR et une activité enzymatique de cette enzyme. Chez la plante portant le gène natif avec son promoteur, onobserveaucune présencedetranscrits,nideprotéine.IlsembledoncquelatranscriptiondugèneNRestinitié par la présence du substrat de l’enzyme.On a un contrôletranscriptionnel. Dans un second temps, l’addition de nitrate induit de manière cinétique la production d’ARNm puis la traduction de protéines correspondantes et enfin la présence de protéine active. Unesecondecarencedenitrateentrained’abordladisparitiondeprotéinesactivesalorsquele gène correspondant est toujours fortement exprimé ; Il y a donc un contrôle post-traductionnel. T23 L’étude de l’effet delalumièresurunprocessusphysiologiqueestsouventcompliquée carilestdifficiledeséparerl’effetdelalumièrecommenutriment(photosynthèse)del’effet de la lumière commesignalrégulateurdudéveloppementetdel’expressiondegènes. Ona prisdeuxplantes,uneplantesauvageetunmutantpourlephytochrome(pigmentquicaptela lumière rouge même en basse intensité donc en dehors de processus physiologique). A l’obscuritéchezleseuxplantesonobtientaucunesynthèsed’ARNmdugèneNR.Enlumière rouge on a la production d’ARNm de NR. Le phytochrome et donc un photorécepteur impliqué dans l’induction de la transcription du gène NR. Il y a donc bien un contrôle transcriptionneldugèneNRparlalumière.Lepassgedelalumièreàl’obscuritéinduittrès rapidement une chute de l’activité enzymatique etdelatraductionalorsquelatranscription 5 r estepluslongtempsactive.Onadoncaussiuncontrôlepost-trascriptionnel.Expliquerque post-transcriptionnel recouvre aussi bien la traduction que les modifications del’activitéde l’enzyme. T24PlusieursfacteursontétécaractériséscommejouantunrôledanslarégulationdelaNR et NiR.Larégulationdel’activitéenzymatiques’effectueparphosphorylation.Uneprotéine phosphoryléeestinactiveetsadéphosphorylationentraineunchangementdeconformationet son activité. 2 - L’assimilation de l’ammonium : a – Sources d’ammonium :T25 - Lapremièresourced’ammoniumestlaréductiondesnitrated’abordennitritepuisan ammonium - La symbiose entre une bactérie du sol (Rhizobium) et une plante de la famille des Fabacées (pois, haricot, lentille, luzerne…) permet de capter le diazote(N2)pourle réduire ne NH3 par une enzyme la nitrogénase. Nous reviendrons de manière plus précise plus tard. C’est donc aussi une voie de synthèse de l’ammonium. - La photorespiration constitue une voienonpasdeproductionmaisderemobilisation d’ammonium. Rappel et description de la photorespiration. Deux glycines peuvent conduire à une sérine avec libération d’un ion ammonium. - Enfinlecatabolismedesprotéinesdansdesfeuillesâgéespermetdelibérerdesacides aminés et/ou des fonctions amines qui peuvent être utilisées dans la synthèse de nouveaux acides aminés. b – Mécanisme d’assimilation L’assimilation de l’ammonium s’effectue en deux étapes.Une glutamine synthase (GS) permet de fixer un ion ammonium sous la forme d’une fonction amine sur du glutamate pour donner la glutamine.Cette fonction amine est transféréesur de l’a-cétoglutarate pour redonner deux glutamates. L’enzyme est la GOGAT (Glutamine OxoGlutarate AminoTransférase). 3 – La glutamine synthase :T26 L’isolement d’organes et d’organites a conduit à caractériser différents ARNm très proches codant pour des isoformes de la même enzyme. Il existe donc un gène GS spécifiquement exprimé dans les racines. Il existe aussi deux gènes GS dans les feuilles conduisantàdeux isoformes l’une adressée dansle plaste et l’autredans le cytosol. Ilyadoncunpeptidesignalquipermetd’adresserlaprotéineauchloroplasteavecuneétape de transitionparunefixationdupeptidesurl’enveloppechloroplastique.Cesisoformessont fonctionnellesquelquesoitlecontexte.Onpeutéchangerlapartiecodanted’ungèneavecle peptide signal d’un autre gène et ça fonctionne toujours. 27 L’utilisation degènesrapporteurscommeceluicodantpourlabeta-glucuronidase(gène T GUS)devantlequelonaplacélepromoteurdelaglutaminesynthaseapermisdecaractériser lesfacteursderégulationdecegèneetdelaprotéineassociée.Cetestdel’expressiondugène GUS visualise finalement une activité enzymatique à travers le glivage d’un substrat qui libère une molécule colorée. On peut aussi mesurer le niveau de transcription d’un gène rapporteur par Northern ou q-PCR. L’apport de NH4+ et/ou de NO3- augmentent la transcription et l’AE de la GS. La transcription est régulée par des stimuli lumineux (phytochrome, cryptochrome). La photorespiration augmente la libération de NH4 et par conséquent confirme que le substrat de la GS augmente sa transcription. 4 –Du nitrate à la glutamine – la GDH:T28 6 Une observation globale de l’assimilation du nitrate en glutamine montre que de n ombreux transporteurs sont nécessaires pour traverser la membrane plasmique et les différents compartiments intracellulaires. Une enzyme la glutamate deshydrogénase (GDH) est impliqué aussi dans l’assimilationdel’ammoniumenglutamate.Cettevoieestpeuexpriméemaisellepermetde générer du glutamate pour amorcer le cycle (glutamate / glutamine). Cette GDH peut fonctionner dans les deux sens permettant d’équilibrer la quantité de glutamate et de cétoglutarate pour une bonne assimilation de l’ammonium par le cycle GS/GOGAT. Ce schéma fait ressortir aussi deux voies de synthèse de la glutamine par deux isoformes de la GS (une plastidiale, l’autre cytosolique). 5 – Biosynthèse des acides aminés :T29 a – Transamination: La biosynthèse des autres acides aminés à partirduglutamateetdela glutamine s’effectue principalement par trans-amination. Les transaminases catalysent le transfert d’un groupement alpha aminé d’un acide aminé au carbone alpha d’un acide cétonique produisant ainsi un nouvel acide aminé et un autre acide cétonique l’action des transaminases est réversible. Elles sont régulées par le pH du milieu et les concentration en substrats et produits. Les transaminases jouent un rôle extrêmement important dans la synthèse des acides aminés et redistribue l’azote du glutamate à d’autres acides cétoniques. T30 Pour continuer à assimiler de l’azote il faut régénérer de l’α- cétoglutarate. Une transaminaseparticulièrevapermettrecetteréaction :l’aspartateaminotransférase.Lecouple malate/aspartatesertpourtransférerdel’énergiedelamitochondrieouduchloroplasteversle cytosol (navettes). Donc c’est uneaminotransféraseparticulièreettrèsimportante.Plusieurs isoformes ont été caractérisées qui sont localiséesdansdifférentscompartimentscellulaires. Chez un mutant d’Arabidopsisaat2l’aspartatediminuefortementàlalumièremaismoinsà l’obscurité.Parcontrechezcemêmemutantl’asparaginediminueàl’obscuritésuggérantque l’aspartate synthétisé à la lumière sert comme précurseur ransport :l’asparagineestunaaparticulier,c’estceluiquicirculeleplusdanslephloèmede T nombreusesplantes.Ilexisteplusieursvoiesdebiosynthèsedel’asparagine.Lapremièreest une amidation de l’aspartate. La seconde est une trans-amidation (un peu comme un transamination)maiselleimpliquedeuxacidesaminéscommesubstratetdeuxautrescomme produit. Cette enzyme nécessite de l’ATP 35 – T36 La synthèse des acides aminés n’est pas toujours une simple transamination : T Exemple de la synthèse des acides aminés aromatiques : tyrosine et phenylalanine. Cyclisation à partir du PEPetdel’érythrose,obtentionenplusieursétapesdushikimatequi est ensuite phosphoryle puis du PEP vient se condenser et enfin perte ‘un OP.Transfertde l’énolpyruvatesurunautrecarbone.Transaminationpuisréductionoudécarboxylationpour obtenir tyrosine et phénylalanine T37 Conclusion Les 4 ou 5 dernières dia sont à te réapproprier. 7 8
