Clases Ariana Parte 1 (1) PDF - Biología Molecular

Lic. Biociencias Dra. en C. Ariana Sandoval Duarte Mecanismos biológicos de las enfermedades  Agenda del día Presentacion Evaluación clases teoricas Quizz Introducción al cultivo celular. - Definición de cultivo celular. - Diferencias entre cultiv...

Lic. Biociencias Dra. en C. Ariana Sandoval Duarte Mecanismos biológicos de las enfermedades  Agenda del día Presentacion Evaluación clases teoricas Quizz Introducción al cultivo celular. - Definición de cultivo celular. - Diferencias entre cultivo celular y linea celular. - Condiciones de cultivo. - Morfologia de las células en cultivo.  Su profesora: Ariana Sandoval Duarte Departamento de Genética y Biologia molecular Maestría: “Expresión y distribución subcelular del beta distroglicano y las proteínas de envoltura nuclear en líneas celulares de cáncer de próstata” Químico Farmacéutico Biólogo Doctorado: Universidad Autónoma de “Efecto de los repetidos CTG de la Distrofia Miotónica de Zacatecas tipo 1 sobre la estructura del núcleo” Evaluación Quiz por tema Ponderación Estudio molecular y manejo celular 1.75% Medicina moderna 1.75% Ética 1.5 % TOTAL 5% QUIZZ https://quizizz.com/join?gc=866462 Introducción al Cultivo celular  Cultivo celular Remoción de las células de un animal o planta y su subsecuente crecimiento en un ambiente artificial adecuado. Características del ambiente artificial: Toma de células desde Semejanza al microambiente natural un cultivo in vitro. de la célula. Toma de células directamente del tejido. Cultivo celular primario CULTIVO PRIMARIO Estado del cultivo celular posterior al aislamiento desde el tejido donde las células han proliferado bajo condiciones microambientales establecidas. Subcultivo = Pasaje celular Linea celular Diferencias entre cultivo primario y linea celular. Transformación inducida por químicos o virus: Inhibición de reguladores del ciclo celular: p53 Senescencia Linea celular inmortalizada celular = Muerte ó transformada celular Diferencias entre cultivo primario y linea celular. Cultivo primario Línea celular Diferencias entre cultivo primario y linea celular. Condiciones de cultivo: Microambiente artificial Campana de bioseguridad Nivel II Condiciones de esterilidad https://www.youtube.com/watch?v=7H7pcGuNN0c  Varían dependiendo del tipo celular. Condiciones de cultivo: Microambiente artificial Generalmente el microambiente artificial consiste en: Recipiente con substrato o medio que provee de nutrientes a la célula y regula el medio fisicoquímico del cultivo. Incubadora: 37֯ C, 4% CO2 Condiciones de cultivo: Microambiente artificial Características del medio de cultivo https://www.youtube.com/watch?app=desktop&v=UV7T9JsxdXA  Condiciones de cultivo: Microambiente artificial Ej. La mayoria de las células derivadas de vertebrados Crecen en monocapa Adherentes sobre un sustrato Sistemas de crecimiento celular Crecen libremente En suspensión flotando en el medio de cultivo Células hematopoieticas, células cancerosas, etc. Condiciones de cultivo: Microambiente artificial Células adherentes ó en suspensión Morfologia de las células en cultivo Conclusiones sobre la importancia de los cultivos celulares en el área biomédica Bibliografia CELL CULTURE BASICS HANDBOOK. Thermo Fisher Scientific. P. Segeritz. (2019) Cell Culture: Growing Cells as Model Systems In Vitro. Chapter 9. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Agenda del día Análisis de proteinas: Ensayo de ELISA Introducción al análisis de ácidos nucleicos.  Ensayo de ELISA Ensayo que permite la detección y cuantificación de una proteína de interés. Se basa en la utilización de un anticuerpo dirigido especialmente a la proteína blanco. Utilización de Anticuerpo asociado a una enzima espectrofotómetro para la Reaccion enzima – sustrato = producción de detección del color. color ELISA ELISA directo indirecto El anticuerpo que El anticuerpo que detecta a la proteína detecta a la proteína esta ligado es reconocido por un directamente con la 2do anticuerpo ligado enzima. a la enzima.  ELISA directo Detección de una proteína o antígeno específico para el anticuerpo. Cantidad relativa de proteína: Absorbancia ELISA indirecto Cantidad relativa de proteína: Absorbancia ELISA: Detección de proteinas mediante espectrofotometría Cantidad relativa de proteína: Absorbancia del color amarillo. La presencia de color indica la presencia de la proteína: Unión proteína – anticuerpo. Principales características de las técnicas de identificación de proteínas individuales Western Blot ELISA Principales características de las técnicas de identificación de proteínas individuales Referencias DNA, RNA and protein etxraction: The past and the present. Review article. Journal of Biomedicne and Biotechnology. 2009. Recent advances on protein separation and purification methods. Elsevier. 2020. https://www.nature.com/scitable/topicpage/protein-structure-14122136/ Molecular Biology of the cell. 4th edition. Alberts 2002. En línea https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26830/ Estudios bioquímicos y moleculares de ácidos nucleicos MECANISMOS BIOLÓGICOS DE LAS ENFERMEDADES Dra. En C. Ariana Sandoval Duarte ¿Por qué es importante estudiar y analizar el ADN y el ARN? Objetivo del análisis del ADN y el ARN El análisis del genoma y el transcriptoma nos ha permitido entender la expresión de nuestros genes y como afectan el funcionamiento del organismo. Entender la red de regulación de procesos biológicos: Obtener información acerca de: Estructura genética Regulación de la expresión genética Diagnóstico de Terapia clínica enfermedades < Función del producto de un gen. Dinámica del genoma. Extracción y purificación de ácidos nulcéicos Todos los métodos de análisis requieren primeramente la extracción de ADN / ARN del organismo y su posterior purificación para la realización de diferentes técnicas moleculares: Ej. Electroforesis, PCR, microarreglos, secuenciación, etc. Pasos llevados a cabo en las técnicas de extracción de ADN/ARN 2. Inactivación 3. Disrupción de 4. Separación de 5. Concentración 1. Disrupción de enzimas macromoléculas biomoléculas del ADN ó ARN mecánica de las RNAsas con y complejos indeseadas. mediante células o tejido sales caotrópicas nucleotídicos (adición de precipitación proteasas). Métodos de extracción de ácidos nucléicos más utilizados Métodos de extracción de ADN/ARN Extracción por tiocianato de Métodos quimicos guanidinio y fenol – cloroformo. Matrices de hibridación: silica Métodos de extracción en fase sólida. Perlas magnéticas Extracción por tiocianato de guanidino y fenol/cloroformo Utilizado para la extracción tanto de ADN como de ARN. Basado en la utilización de soluciones orgánicas y ciclos de centrifugación que permiten la separación específica ya sea de ADN o ARN, bajo condiciones de PH específicas.  Extracción por tiocianato de guanidino y fenol/cloroformo ADN /ARN : moléculas polares Tiocianato de guanidino: Lípidos: moleculas no polares Degrada proteínas de unión a ácidos nucleicos. Ej. Histonas, Proteinas: a.a. polares/no polares RNAsas. Soluciones orgánicas: permiten la separación de los ARN componentes celulares de acuerdo a sus características quimicas: Cloroformo: Permite la correcta difusión de las fases acuosa y orgánica. Fenol: (fase orgánica). Desnaturalización de las proteínas y separación de los ácidos nucleicos. Cambios hacia un PH ácido en la solución permiten la separación de ADN del ARN: Isopropanol: Precipita al ADN/ARN de la solución debido a la formación de puentes de H+ con el agua. PH= 4-6 Dejando libre a los ácidos nucleicos.  Métodos de extracción / purificación: Matriz de silica Basado en la utilización de columnas de silica Retención por afinidad: ADN /ARN: carga negativa + silica: carga positiva El resto de los componentes celulares pasa a través de la columna. Elusión de los ácidos nucleicos: buffers alcalinos. Métodos de visualización y análisis de ácidos nucleicos Electroforesis de ADN/ARN en geles de agarosa Electroforesis en gel Electroforesis Pero ¿porque queremos separar fragmentos de ácidos nucleicos? en gel ¿Para qué seria esto útil en el análisis de los mismos? Le electroforesis en geles de agarosa nos permite: Analizar la secuencia de una molécula determinada de ADN/ARN: enzimas de restricción. Identificar cambios en la estructura y topología de moléculas de ADN/ARN. Visualizar productos de PCR. Realizar el proceso de clonación genética. Identificar diferencias genéticas entre muestras de distintos individuos. Etc. GELES DE AGAROSA AGAROSA: Polímero de polisacárido. Proveniente de algas marinas GELES DE AGAROSA Polymerase Chain Reaction: PCR Basado en el proceso natural de la celula para replicar el ADN durante la división celular. Permite la obtención de un número ilimitado de copias de una molécula de ADN. PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) Taq polimerasa: Thermophilus aquaticus (bacteria) Created with BioRender.com  Mecanismo básico de PCR. ADN molde con el gen blanco a amplificar. Primers de ADN con características específicas: ADN Pol alta fidelidad: Taq Polimerasa Resto de elementos para la reacción de PCR. Video de apoyo: https://www.youtube.com/watch?v=c07_5BfIDTw Algunos tipos de PCR y su utilidad. Droplet Digital PCR Interpretación de productos de PCR: VNTRs Análisis forense Tinción con bromuro de etidio en geles de agarosa.  Análisis de secuencias de ADN / ARN Microarreglos de ADN Hibridación in situ: FISH RNAseq Southern blot Secuenciación masiva de ARN Dot blot Etc. Análisis de la expresión genética Identificación de secuencias de ADN / ARN Localización de moléculas de ADN / ARN Identificación de alelos específicos en una muestra. Referencias Ali, N. (2017). Current nucleic acid extraction methods and their implications to point of care diagnostics. Review article. BioMed Research International. New England Biolabs web page https://international.neb.com/ Addgene web page https://www.addgene.org/  Estudios bioquímicos y moleculares de proteínas MECANISMOS BIOLÓGICOS DE LAS ENFERMEDADES Dra. En C. Ariana Sandoval Duarte Agenda del día Introducción al análisis de proteinas Proteínas Extracción y purificación de proteínas Identificación y análisis de proteínas Análisis de biomoléculas del dogma central de la biología molecular ¿Por qué es importante? Funciones de las Proteínas ¿De qué están constituidas las proteínas? Las proteínas se encuentran unidas mediante enlaces peptídicos Enlaza el grupo amino de uno de los aminoácidos con el grupo carboxilo del siguiente aminoácido, para de esta manera, ir formando la cadena polipeptídica. Cada aminoácido tiene una cadena lateral única, con distintas características químicas: Polares, no polares, carga +. Etc. Estructura primaria de una proteína Estructura de las proteínas Proteína funcional  Métodos de extracción y cuantificación de proteinas/péptidos  ¿Para que realizamos la extracción de proteínas de la célula? Para obtener información acerca de la función de un organismo, las vías de señalización celular en las que se encuentran implicadas y sobre cómo se expresa el código genético. Para comparar la estructura de una proteína expresada en diferentes organismos. Para la detección y el diagnóstico de enfermedades. Para estudiar los mecanismos de acción (enzimas).  Consideraciones para la elección del método de extracción de proteínas Tipo de muestra de donde se desea extraer a la proteína (tejido /cultivo Extracción de proteínas celular). Proceso por el cual las Localización celular de la proteína en estudio: citosol, transmembranal, proteínas de la célula asociación con un compartimento subcelular (ej. nucleolo). son recuperadas para su Se analizará a la proteína desnaturalizada o en su forma nativa. análisis. Si se desea extraer de forma generalizada las proteínas de una muestra: Extracción Total. Metodologia general para la extracción de proteínas 3. Separación de 1. Colectar y proteínas de preparar la 2. Lisis celular compuestos muestra: lavar celulares Tejido Celulas 6. Purificación y 5. Separación de la 4. Recuperación de concentración de la proteína blanco del proteínas proteína blanco pool de proteínas PROTEÍNAS TOTALES  Métodos para llevar a cabo la lisis celular Tienen como objetivo debilitar y romper las membranas celulares (plasmática y nuclear) para permitir la salida de las macromoléculas. Tejidos o muestras sólidas: Es necesario desintegrar la Buffers de lisis muestra primero. Contienen una mezcla de: Agentes surfactantes Sales Inhibidores de proteasas Sonicación Permeabilización mediante: Detergentes / Homogeneización por Surfactantes cambios rápidos de presión Tratamiento con sales iónicas Tratamientos con cambios de temperatura Choque hipotónico Detergentes / Surfactantes  Separación de proteínas de los restos celulares Normalmente llevado a cabo mediante múltiples rondas de centrifugación (4֯ C). Donde obtenemos una pastilla (restos celulares) y la fracción soluble (donde Proteínas podemos encontrar a las proteínas) Membranas y organelos celular Video de apoyo https://www.youtube.com/watch?v=amsLgkjO1Yg Consideraciones durante y después de la extracción de proteínas El procedimiento debe llevarse a cabo siempre en frio (hielo) para evitar desnaturalización Las condiciones del Evitar el contacto buffer de con agentes extracción / oxidantes que mantenimiento puedan dañar a las dependen del tipo proteinas en de proteína a condiciones nativas extraer La pureza del agua utilizada puede Evitar ciclos de afectar el producto descongelación y obtenido congelación (contaminantes, proteasas, etc.) Actividad de repaso: NEARPOD Únete con el código en: https://nearpod.com/student/ SJZAI Cuantificación y detección de proteínas Esencial para la realización de técnicas de laboratorio que permitan el estudio de la función de las proteínas. Métodos de cuantificación / detección de proteínas Proteínas Proteínas totales individuales Espectrometría Ensayo de de masas ELISA Western Blot Bradford MS  Método de Bradford Método popular para determinar la concentración de proteínas. Basado en la formación de un complejo entre el colorante azul brillante G-250 Coomassie y las proteínas en la muestra. La forma azul, más aniónica, se une a las proteínas de forma no covalente, permitiendo la medición del color a 595 nm mediante un espectrofotómetro. Determinación de la concentración de proteina: Comparando con una curva de concentraciones estándar de una proteína conocida: Ej. BSA (albumina sérica bovina). Video de apoyo: https://www.youtube.com/watch?v=7o65va089S4 Identificación y análisis de proteínas / péptidos  Separación de proteínas Métodos e separación de proteínas Cromatografia Cromatografía Electroforesis Cromatografía de intercambio de filtración en en geles de de afinidad iónico gel poliacrilamida  Separación de proteínas Electroforesis en geles de poliacrilamida Método utilizado para separar proteínas de acuerdo a su masa y carga. Puede ser utilizado después de la obtención y separación de proteínas mediante los métodos cromatográficos. Permite purificar a la Naturalizante proteína manteniendo su PAGE plegamiento natural (estructura cuaternaria). Electroforesis en gel Utilización del detergente SDS SDS: Sodio Desnaturalizante Dodecil SDS -PAGE Provoca la pérdida de las estructuras secundaria, Sulfato terciaria y cuaternaria de las proteínas  Electroforesis en geles de poliacrilamida POLIACRILAMIDA Agente gelificante que produce poros de distinto tamaño que permiten la separación de las proteínas mediante su tamaño y carga eléctrica. (Sólo tamaño en SDS-PAGE). Electroforesis: Movilización de las proteínas mediante un campo eléctrico Inmunodetección en fase sólida: Western Blot Técnica basada en la detección de una proteína de interés a partir de una muestra de proteínas totales. Acoplada a la electroforesis en geles de poliacrilamida: SDS-PAGE. Consiste en el corrimiento electroforético de la muestra de proteínas, su posterior transferencia a una membrana y la detección específica de una proteína mediante el uso de anticuerpos específicos para la proteína de interés. Anticuerpo secundario: acoplado a la enzima Horse Radish Peroxidase Sustrato: Luminol Inmunodetección en fase sólida: Western Blot Proceso general experimental: Inmunodetección en fase sólida: Western Blot Ejemplo de resultado experimental: Detección de la proteína ERK en diferentes condiciones. Evaluación de los niveles relativos de la proteína mediante densitometría. Video de apoyo: https://www.youtube.com/watch?v=qT_AqI-MKJc  Ensayo de ELISA Ensayo que permite la detección y cuantificación de una proteína de interés. Se basa en la utilización de un anticuerpo dirigido especialmente a la proteína blanco. Utilización de Anticuerpo asociado a una enzima espectrofotómetro para la Reaccion enzima – sustrato = producción de detección del color. color ELISA ELISA directo indirecto El anticuerpo que El anticuerpo que detecta a la proteína detecta a la proteína esta ligado es reconocido por un directamente con la 2do anticuerpo ligado enzima. a la enzima.  ELISA directo Detección de una proteína o antígeno específico para el anticuerpo. Cantidad relativa de proteína: Absorbancia ELISA indirecto Cantidad relativa de proteína: Absorbancia ELISA: Detección de proteinas mediante espectrofotometría Cantidad relativa de proteína: Absorbancia del color amarillo. La presencia de color indica la presencia de la proteína: Unión proteína – anticuerpo. Principales características de las técnicas de identificación de proteínas individuales Western Blot ELISA  Principales características de las técnicas de identificación de proteínas individuales Referencias DNA, RNA and protein etxraction: The past and the present. Review article. Journal of Biomedicne and Biotechnology. 2009. Recent advances on protein separation and purification methods. Elsevier. 2020. https://www.nature.com/scitable/topicpage/protein-structure-14122136/ Molecular Biology of the cell. 4th edition. Alberts 2002. En línea https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26830/