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1 Técnicas GENERALIDADES DE LAS TÉCNICAS MICROSCOPÍA / 12 UTILIZADAS EN HISTOLOGÍA / 1 Microscopía óptica / 12 PREPARACIÓN DEL TEJIDO / 2...

1 Técnicas GENERALIDADES DE LAS TÉCNICAS MICROSCOPÍA / 12 UTILIZADAS EN HISTOLOGÍA / 1 Microscopía óptica / 12 PREPARACIÓN DEL TEJIDO / 2 Examen de un preparado histológico en el Tinción con hemaxotilina y eosina con fijación microscopio óptico / 13 en formalina / 2 Otros sistemas ópticos / 16 Otros fijadores / 2 Microscopía electrónica / 18 Otras técnicas de tinción / 3 Microscopía de fuerza atómica / 21 HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA / 3 Microscopía virtual / 22 Composición química de las muestras Cuadro 1-1 Correlación clínica: biopsias por histológicas / 3 congelación / 4 Fundamentos químicos de la tinción / 5 Cuadro 1-2 Consideraciones funcionales: Digestión enzimática / 7 microespectrofotometría de Feulgen / 7 Histoquímica enzimática / 7 Cuadro 1-3 Correlación clínica: anticuerpos Inmunocitoquímica / 8 monoclonales en medicina / 9 Técnicas de hibridación / 10 Cuadro 1-4 Consideraciones funcionales: uso Autorradiografía / 12 correcto del microscopio óptico / 15 HISTOLOGÍA 101. Puntos esenciales / 23 GE N E R A L I D A D E S D E L A S un microscopio electrónico (ME) – tanto con el microscopio electrónico de transmisión (MET) como con el microsco- Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas T É CN I C A S U T I L I Z A D A S EN HI STO L O G Í A pio electrónico de barrido (MEB). Hoy, el microscopio de fuerza atómica (MFA) también puede proporcionar imágenes El objetivo de un curso de histología es conducir al estu- de alta resolución que son comparables o incluso mejores que diante a comprender la microanatomía de las células, teji- las obtenidas a través del MET. Tanto el ME como el MFA, dos y órganos y a correlacionar la estructura con la función. debido a su mayor resolución y más útil aumento, suelen ser el último paso en la adquisición de datos a partir de muchas téc- Histología [Gr., ἱστός, histos = tejidos; λογíα, logía = ciencia], nicas auxiliares de la biología celular y molecular. Estas técnicas también llamada anatomía microscópica, es el estudio cientí- auxiliares incluyen: fico de las estructuras microscópicas de los tejidos y órganos del cuerpo. La histología moderna no es sólo una ciencia descrip- histoquímica y citoquímica, tiva sino que también incluye muchos aspectos de la biología inmunoquímica y técnicas de hibridación, molecular y celular, que ayudan a describir la organización y autorradiografía, función celular. Las técnicas utilizadas por los histólogos son cultivo de tejido y órganos, diversas en extremo. La mayor parte de los contenidos de un curso de histología se puede formular en términos de la mi- separación de células y orgánulos por centrifugación di- ferencial, croscopia óptica. En la actualidad, los estudiantes en los labo- ratorios de histología utilizan ya sea microscopios ópticos o, microscopios y técnicas microscópicas especializadas. con mayor frecuencia, microscopía virtual, que representa Es posible que los estudiantes se sientan distantes de estas métodos para examinar muestras microscópicas en la pantalla técnicas y procedimientos experimentales debido a que no de un ordenador o dispositivo móvil. Anteriormente, se reali- suele estar contemplada una experiencia directa con ellos en zaba una interpretación más detallada de la microanatomía con los programas actuales de la asignatura. Sin embargo, es im- Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas 1 CH001.indd 1 07/09/2015 01:17:18 p.m.  portante saber algo acerca de los procedimientos y los datos que proveen. Este capítulo proporciona un estudio de técnicas TA B LA 1-1 Equivalencias en las medidas de longitud 2 y una explicación de cómo los datos aportados por éstas pueden ayudar al estudiante a comprender mejor la función de las célu- 1 picómetro (pm) 5 0,01 angstroms (A) las, tejidos y órganos. 1 angstrom 0,1 nanómetro (nm) P R E PA R A C I Ó N D E L T E J I D O 5 Un problema que enfrentan los estudiantes de histología 10 angstrom 1,0 nanómetro 5 es comprender la índole de la imagen bidimensional de un preparado histológico de una micrografía electrónica y cómo 1 nanómetro 5 1 000 picómetros la imagen se relaciona con la estructura tridimensional de la 1 000 nanómetros 5 1,0 micrómetro (mm) cual proviene. Para salvar esta brecha conceptual, primero de- 1 000 micrómetros 5 1,0 milímetro (mm) bemos presentar una descripción de las técnicas mediante las cuales se producen los preparados y las muestras de la micros- copia electrónica. las técnicas de inmunocitoquímica (v. pág. 8). La solución co- mercial estándar de formaldehído amortiguado con fosfatos (pH 7) actúa con lentitud pero penetra bien en el tejido. Sin PRE PA R A C I Ó N D E L T E J ID O embargo, dado que no reacciona con los lípidos, es un mal fijador de las membranas celulares. Tinción con hematoxilina y eosina con fijación En el segundo paso, la muestra se dispone para su inclu- en formalina Técnicas sión en parafina con el fin de permitir su corte. El corte de rutina teñido con hematoxilina y eosina es la Para examinar una muestra se requiere de su infiltración con muestra que se utiliza con mayor frecuencia. un medio de inclusión que permita realizar corte muy del- El grupo de preparados que se entrega a cada estudiante junto gados, por lo general en el rango de 5 mm a 15 mm (1 micrón con el microscopio óptico contiene por lo general muestras [mm] equivale a una milésima parte de un milímetro [mm]; fijadas en formalina, incluidas en parafina y coloreadas con v. tabla 1-1). Después de la fijación la muestra se lava y se CAPÍTULO 1 hematoxilina y eosina (H&E). Cas todas las fotomicrografías deshidrata en una serie de soluciones alcohólicas de concen- ópticas en las secciones del atlas de esta obra son de prepara- tración creciente hasta alcanzar alcohol al 100 %. En el paso dos de estos mismos grupos. Además, la mayor parte de las siguiente, el aclarado, se utilizan solventes orgánicos tales fotomicrografías utilizadas para ilustrar tejidos y órganos en como el xileno o tolueno que son miscibles tanto en alcohol la cátedra de histología y en conferencias se obtienen de estos como en parafinas, para extraer el alcohol antes de la infiltra- preparados. A veces se utilizan otras técnicas de tinción para ción de la muestra con la parafina fundida. mostrar componentes específicos de las células y los tejidos; Cuando la parafina fundida se ha enfriado y endurecido, varias de estas técnicas se describen más adelante. se empareja para formar un bloque de tamaño adecuado. Este El primer paso en la preparación de una muestra de tejido bloque se coloca en una máquina cortadora especial, el mi- u órgano es la fijación para conservar la estructura. crótomo que lo corta en rebanadas finas con una cuchilla de acero. Los cortes obtenidos se montan sobre portaobjetos de La fijación, obtenida en general mediante una sustancia quí- vidrio utilizando un medio de montaje (pineno o resinas de mica o una mezcla de sustancias químicas, conserva de forma acrílico) como adhesivo. permanente la estructura del tejido para tratamientos poste- Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas riores. Las muestras deben sumergirse en el fijador inmedia- tamente después de extraerse del organismo. La fijación se utiliza para: En el tercer paso, la muestra se tiñe para permitir su examen. Debido a que los cortes en parafina son incoloros, la muestra todavía no está lista para su examen bajo el microscopio óp- abolir el metabolismo celular, tico. Para colorear o teñir los cortes histológicos, la parafina impedir la degradación enzimática de las células y tejidos debe disolverse y extraerse, con xileno o tolueno y los tejidos por la autólisis (autodigestión), deben rehidratarse mediante el uso de una serie de soluciones destruir microorganismos patógenos tales como bacterias, de alcohol de concentración decreciente. Después, el tejido hongos o virus y sobre el portaobjetos se tiñe con hematoxilina en agua. De- endurecer el tejido como resultado de la formación de bido a que el colorante de contraste, la eosina, es más soluble enlaces cruzados o de la desnaturalización de moléculas en alcohol que en agua, se vuelve a deshidratar la muestra a proteicas. través de una serie de soluciones alcohólicas de concentración l El fijador de uso más común es la formalina, una solución creciente y después se tiñe con eosina en alcohol. En la figura acuosa de formaldehído al 37 %, en diluciones variadas y en 1-1 se muestran los resultados de la tinción con hematoxilina combinación con otras sustancias químicas y amortiguadores sola, con eosina sola y con ambos colorantes. Después de la (buffers). El formaldehído conserva la estructura general de la tinción, la muestra se pasa por xileno o tolueno y se le coloca célula y de los componentes extracelulares al reaccionar con un medio de montaje no acuoso antes de cubrirla con un cu- los grupos amino de las proteínas (con frecuencia los enlaces breobjetos para obtener un preparado permanente. cruzados de residuos de lisina). Debido a que el formalde- hído no altera su estructura tridimensional de forma signi- Otros fijadores ficativa, las proteínas mantienen su capacidad de reaccionar La formalina no preserva todos los componentes de las cé- con anticuerpos específicos. Esta propiedad es importante en lulas y los tejidos. Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas CH001.indd 2 07/09/2015 01:17:18 p.m.  3 CAPÍTULO 1 Técnicas a b c FIGURA 1-1 ▲ Coloración con Hematoxilina y eosina (H&E). Esta serie de muestras de cortes de páncreas seriados (contiguos) demues- tran el efecto de la hematoxilina y la eosina utilizadas solas o combinadas. a. En esta fotomicrografía se ve una tinción con hematoxilina sola. Si bien hay una tinción general de la muestra, aquellos componentes y estructuras con gran afinidad por el colorante se tiñen con una intensidad mucho mayor, H I S T O Q U Í MI C A Y C I T O Q U Í MI C A por ejemplo, el ADN nuclear y el ARN citoplasmático. b. En esta fotomicrografía, la eosina, colorante de contraste, consigue una tinción general de los tejidos al usarse sola. Sin embargo, debe notarse que los núcleos son menos conspicuos que en la muestra teñida sólo con hematoxilina. Después de que la muestra se colorea con hematoxilina y que se le prepara para la tinción con eosina en solución alcohólica, la hematoxilina que no estaba unida con firmeza se pierde, y entonces la eosina tiñe esos componentes para los que tiene gran afinidad. c. Esta fotomicrografía muestra el efecto de la tinción con ambos colorantes (H&E). 480 Χ. Si bien los corte teñidos con H&E de muestras fijadas en saber lo que el método permite observar que conocer su fun- formalina son convenientes ya que muestran adecuadamente cionamiento. las características estructurales generales, no son específicos para dilucidar la composición química de los elementos ce- lulares. Además, muchos componentes se pierden durante la H IS TO Q U ÍM IC A Y C ITO QUÍMICA preparación de la muestra. Para retener estos componentes y Los procedimientos químicos específicos pueden proveer estructuras, se deben utilizar otras técnicas de fijación. Por lo información acerca de la función de las células y de los general, estas técnicas se fundamentan en un conocimiento componentes extracelulares de los tejidos. sólido de la química involucrada. Por ejemplo, los alcoholes y Los procedimientos histoquímicos y citoquímicos pueden solventes orgánicos que se usan en preparados de rutina dilu- yen los lípidos neutros. tener su fundamento en la unión específica de un colorante, Para conservar los lípidos neutros, como los de las células en el uso de anticuerpos marcados con un colorante fluo- rescente con un componente celular en particular o en la adiposas, se deben utilizar cortes por congelación de tejido fi- actividad enzimática inherente de un elemento constitutivo jado en formalina y colorantes que se disuelvan en grasa; para de la célula. Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas conservar las estructuras de la membrana, se utilizan fijadores especiales con metales pesados, como permanganato y osmio, Además, muchas macromoléculas presentes en las células pueden detectarse mediante la autorradiografía, en la cual que se unan a los fosfolípidos. El empleo de rutina de te- tróxido de osmio como fijador en la microscopia electrónica precursores moleculares marcados radiactivamente se incor- es la razón principal del excelente estado de conservación de poran en las células y en los tejidos antes de la fijación. Mu- las membranas en las fotomicrografías electrónicas. chos de estos procedimientos pueden utilizarse en preparados tanto para la microscopia óptica como para la microscopia Otras técnicas de tinción electrónica. Antes de comentar sobre la química de las tinciones de ru- La hematoxilina y la eosina se utilizan principalmente para tina y de las técnicas histoquímicas y citoquímicas, es conve- poner en evidencia las características estructurales. niente describir brevemente la índole de un corte histológico A pesar de los méritos de la tinción con H&E, el procedi- de rutina. miento no permite ver de forma adecuada ciertos componen- tes estructurales de los cortes histológicos tales como elastina, Composición química de las muestras fibras reticulares, membranas basales y lípidos. Cuando se histológicas desea estudiar estos componentes, se pueden utilizar otros procedimientos de tinción, en su mayoría selectivos. Estos La composición química de un tejido listo para una tinción procedimientos incluyen el uso de orceína y fucsina- resor- de rutina difiere de la del tejido vivo. cina para el material elástico y la impregnación argéntica para Los componentes que perduran después de la fijación son prin- fibras reticulares y las membranas basales. Pese a que no siem- cipalmente moléculas grandes que no se disuelven con facili- pre se comprende el fundamento químico de muchas técnicas dad, en especial después de aplicar el fijador. Estas moléculas, de tinción, estos procedimientos sirven. Es más importante en particular las que reaccionan con otras moléculas semejantes Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas CH001.indd 3 07/09/2015 01:17:19 p.m.  4 CUADRO 1-1 Correlación clínica: biopsias por congelación A veces, el patólogo necesita valorar de inmediato el tejido lograrse en una cámara refrigeradora muy eficiente. La HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA obtenido durante la cirugía, sobre todo cuando el diagnóstico congelación endurece el tejido y permite el corte con un patológico instantáneo puede determinar el paso siguiente micrótomo. en la cirugía. Hay varias indicaciones para realizar dicha valo- Corte del tejido congelado. El corte suele realizarse dentro ración, que se conoce como biopsia por congelación. Por de un criostato, una cámara refrigerada que contiene un lo general, un cirujano en el quirófano solicita una biopsia por micrótomo. Dado que el tejido está congelado, se puede congelación cuando se carece de un diagnóstico preopera- cortar en rebanadas muy finas (5 nm a 10 mm). Después torio o cuando hay que identificar hallazgos intraoperatorios los cortes se montan sobre portaobjetos de vidrio. inesperados. Además, el cirujano puede querer saber si se Tinción de los cortes. La tinción se realiza para diferenciar ha extirpado toda la masa patológica dentro del límite de los los núcleos celulares del resto del tejido. Las tinciones de tejidos sanos y si el borde de la resección quirúrgica está libre uso más frecuente para las biopsias por congelación son de tejido enfermo. Las biopsias por congelación también se H&E, el azul de metileno (fig. C1-1.1) y tinción de PAS. realizan en combinación con otros procedimientos como la endoscopia o la biopsia con aguja fina para confirmar si el ma- Todo el proceso de preparación y valoración de las biopsias terial obtenido se podrá utilizar en otros estudios patológicos. por congelación puede tardar en completarse en un mínimo Para realizar una biopsia por congelación se siguen tres de 10 m. El tiempo total para obtener resultados depende en pasos principales: gran medida del tiempo de transporte del tejido desde el qui- Congelación del tejido. Se congelan muestras de tejido de rófano hasta el laboratorio de patología, de la técnica patoló- tamaño pequeño mediante el uso de dióxido de carbono gica utilizada y de la experiencia del patólogo. Los resultados Técnicas sólido o mediante inmersión en un líquido frío (isopen- se comunican directamente al cirujano que está esperando en tano) a una temperatura de –50 °C. El enfriamiento puede el quirófano. CAPÍTULO 1 FIGURA F1-1.1 ▲ Valoración de una muestra obtenida durante la cirugía y preparada mediante la técnica de congelación. a. En esta fo- tomicrografía se ve una muestra obtenida del intestino grueso que se preparó me- diante la técnica de congelación y se tiñó con azul de metileno. 160 Χ. b. Parte de la muestra se fijó en formalina y se procesó con una técnica de rutina que comprende la coloración con H&E. El examen de la Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas biopsia por congelación permitió com- probar que el tejido era normal. El diag- nóstico se confirmó más tarde mediante el examen del preparado de rutina teñido a b con H&E. 180 Χ. (Gentileza del Dr. Daniel W. Visscher). para formar complejos macromoleculares, son las que suelen Estas moléculas constituyen la estructura de las células y los conservarse en un corte histológico. Los siguientes son ejem- tejidos; es decir, son los elementos morfógenos hísticos. Son plos de complejos macromoleculares grandes: la base de la organización del tejido que se observa con el microscopio. nucleoproteínas, formadas a partir de ácidos nucleicos En muchos casos, un elemento estructural es al mismo unidos a proteínas; proteínas intracelulares del citoesqueleto, en complejo tiempo una unidad funcional. Por ejemplo, en el caso de las proteínas que forman los filamentos contráctiles de las células con proteínas asociadas; proteínas extracelulares en grandes aglomeraciones inso- musculares, ellos son los componentes estructurales visibles y además participan en el proceso de contracción. El ARN del lubles, unidas a moléculas similares mediante enlaces cru- zados de moléculas vecinas, como ocurre en las formación citoplasma aparece como parte de un componente estructural de las fibras de colágeno; (p. ej., el ergastoplasma de las células secretoras, sustancia de complejos de fosfolípidos y proteínas (o hidratos de Nissl de las neuronas) y es también el participante activo en carbono) en las membranas. las síntesis de proteínas. Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas CH001.indd 4 07/09/2015 01:17:19 p.m.  Muchos de los componentes de los tejidos se pierden du- y otros procesos vitales de las células. El agua, una molécula rante la preparación de rutina de los cortes teñidos con muy versátil, participa en estas reacciones y procesos y con- H&E. tribuye a estabilizar la estructura macromolecular a través de 5 A pesar de que los ácidos nucleicos, proteínas y fosfolípidos enlaces de hidrógeno. en su mayoría se conservan en los cortes de tejidos, también CAPÍTULO 1 muchos se pierden. Las proteínas pequeñas y los ácidos nu- Fundamentos químicos de la tinción cleicos pequeños, como los ARN de transferencia, en general Colorantes ácidos y básicos se pierden durante la preparación del tejido. Como se men- La hematoxilina y la eosina (H&E) son los colorantes de uso cionó antes, los lípidos neutros suelen disolverse mediante más frecuente en la histología. el uso de solventes orgánicos utilizados en la preparación de tejidos. También pueden perderse otras moléculas grandes, Un colorante ácido, como la eosina, tiene una carga neta por ejemplo, al ser hidrolizadas como consecuencia del pH negativa en su parte coloreada y se la describe con la fórmula Técnicas desfavorable de las soluciones fijadoras. Algunos ejemplos de general [Na+ anilina–]. moléculas que se pierden durante la fijación de rutina en fija- Un colorante básico tiene una carga neta positiva en dores acuosos son: su parte coloreada y se lo describe con la fórmula general [anilina+Cl–]. glucógeno (hidrato de carbono intracelular común en el La hematoxilina no es exactamente un colorante básico hígado y las células musculares) pero tiene propiedades muy semejantes a las de los coloran- proteoglucanos y glucosaminoglucanos (hidratos de tes básicos. El color de una anilina no está relacionado con H I S T O Q U Í MI C A Y C I T O Q U Í MI C A carbono complejos extracelulares que se encuentran en el el hecho de que sea ácida o básica, como lo demuestran los tejido conjuntivo). ejemplos de colorantes ácidos o básico que se presentan en la Sin embargo, estas moléculas pueden conservarse utili- tabla 1-2. zando fijadores no acuosos para el glucógeno o añadiendo Los colorantes básicos reaccionan con los componentes agentes ligadores especiales a la solución fijadora que preser- aniónicos de las células y de los tejidos (componentes que ven las moléculas extracelulares que contienen hidratos de tienen una carga neta negativa). carbono. Los componentes aniónicos incluyen los grupos fosfato de Los componentes solubles, iones y moléculas pequeñas los ácidos nucleicos, los grupos sulfato de los glucosamino- también se pierden durante la preparación de muestras de glucanos y los grupos carboxilo de las proteínas. La capaci- parafina. dad de estos grupos aniónicos de reaccionar con una anilina Metabolitos intermedios, glucosa, sodio, cloro y sustancias o colorante básico se denomina basofilia [gr., afinidad por similares se pierden durante la preparación de muestras de ru- lo básico]. Los componentes del tejido que se tiñen con la tina en parafina teñidas con H&E. Muchas de estas sustancias hematoxilina también exhiben basofilia. pueden estudiarse en preparados especiales, en ocasiones con La reacción de los grupos aniónicos varía según el pH. Así: una pérdida considerable de la integridad estructural. Estos iones y pequeñas moléculas solubles no constituyen los ele- Con un pH alto (cerca de 10) los tres grupos se ionizan y mentos morfógenos de un tejido; participan en procesos de quedan disponibles para la reacción con el colorante bá- síntesis o reacciones celulares. Cuando pueden conservarse y sico mediante uniones electroestáticas. detectarse mediante técnicas específicas, aportan información Con un pH ligeramente ácido a neutro (5 a 7) se ionizan los grupos fosfato y sulfato y quedan disponibles para reac- Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas muy valiosa sobre el metabolismo celular, transporte activo cionar con la anilina básica a través de uniones electroes- táticas. Con un pH bajo (inferior a 4) solo se mantienen ionizados los grupos sulfato y reaccionan con colorantes básicos. TABLA 1- 2 Algunos colorantes ácidos y básicos En consecuencia, la tinción con colorantes básicos en un pH determinado se puede utilizar para centrar el estudio en Colorante Color grupos aniónicos específicos; debido a que estos grupos pre- Colorantes básicos dominan en ciertas macromoléculas, la tinción sirve, enton- Verde de metilo Verde ces, como un indicador de estas macromoléculas. Azul de metileno Azul Como ya se mencionó, la hematoxilina no es un colorante básico en sentido estricto. Se usa con un mordiente (es decir, Pironina G Rojo un intermediario entre el componente del tejido y la anilina). Azul de toluidina Azul El mordiente hace que la tinción se parezca a un colorante Colorantes ácidos básico. La unión en el complejo tejido-mordiente-hematoxi- lina no es un simple enlace electrostático; cuando los cortes se Fuscina ácida Rojo colocan en agua, la hematoxilina no se disocia del tejido. La Azul de anilina Azul hematoxilina se presta para aquellos procedimientos tintoria- Eosina Rojo les en los que a ella le siguen soluciones acuosas de coloran- Naranja G Naranja tes ácidos. Los colorantes básicos verdaderos, a diferencia de la hematoxilina, no suelen usarse en secuencias en las que la Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas CH001.indd 5 07/09/2015 01:17:20 p.m.  anilina básica es seguida por una anilina ácida. Entonces, la T C T anilina básica tiende a disociarse del tejido durante los lavados 6 en soluciones acuosas entre las dos soluciones de anilina. T BC Los colorantes ácidos reaccionan con los grupos catiónicos HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA en las células y los tejidos; en particular, con los grupos amino ionizados de las proteínas. La reacción de los grupos catiónicos con un colorante ácido recibe el nombre de acidofilia [gr., afinidad por lo ácido]. Las reacciones de los componentes celulares y tisulares con los colorantes acídicos no son tan específicas ni tan precisas como BC T las reacciones con los colorantes básicos. T T C T Si bien el enlace electrostático es el factor principal en la unión primaria de un colorante ácido con el tejido, no es el FIGURA 1-2 ▲ Fotomicrografía de tejido renal teñido con único; debido a ello, los colorantes ácidos a veces se utilizan la técnica de PAS. Esta técnica histoquímica sirve para demostrar y lo- combinados para teñir selectivamente distintos componentes calizar hidratos de carbono y macromoléculas ricas en hidratos de car- bono. Las membranas basales son PAS positivas como lo demuestra la de los teñidos. Por ejemplo, en la técnica de teñido de Ma- tinción púrpura de estos sitios. Los túbulos renales (T) se encuentran bien llory, se utilizan tres colorantes ácidos: anilina azul, fuscina delineados por la membrana basal teñida que los rodea. Los capilares glo- ácida y naranja G. Estos colorantes tiñen en forma selectiva el merulares (C) y el epitelio de la cápsula de Bowman (BC) también poseen colágeno, el citoplasma en general y los eritrocitos, respectiva- membranas basales de PAS positivas. La muestra se contratiñó con hema- toxilina para visualizar los núcleos celulares. 320 X. mente. La fuscina ácida también tiñe los núcleos. Técnicas En otras técnicas con anilinas ácidas múltiples, la hema- toxilina se utiliza para teñir primero los núcleos y luego se aplican los colorantes ácidos para teñir selectivamente el ci- Metacromasia toplasma y las fibras extracelulares. La tinción selectiva de los Ciertos colorantes básicos reaccionan con los componen- componentes del tejido por los colorantes ácidos es atribui- tes del tejido que cambian su color normal de azul a rojo ble a factores relativos, como el tamaño y el grado de acu- o púrpura; este cambio de la absorbancia se llama meta- CAPÍTULO 1 mulación de las moléculas del colorante y la permeabilidad y cromasia. “densidad” del tejido. Los colorantes básicos también se pueden utilizar en com- El mecanismo subyacente para la metacromasia es la pre- binación o secuencialmente (p. ej., verde de metilo y pironina sencia de polianiones en el tejido. Cuando estos tejidos se para estudiar la síntesis y secreción de proteínas), pero estas tiñen con una solución colorante básica concentrada, como combinaciones no son de uso tan difundido como las de los el azul de toluidina, las moléculas de colorante están lo sufi- colorantes ácidos. cientemente cerca como para formar aglomerados diméricos y poliméricos. Las propiedades de absorción de estas aglome- Una cantidad limitada de sustancias dentro de las células y raciones difieren de las de las moléculas de colorante indivi- en la matriz extracelular presenta basofilia. duales no aglomeradas. Entre estas sustancias se incluyen: Las estructuras celulares y tisulares que tienen altas con- centraciones de grupos sulfato y fosfato ionizados, como la Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas heterocromatina y nucléolos del núcleo (principalmente por los grupos fosfato ionizados en los ácidos nucleicos de sustancia fundamental del cartílago ionizado, los gránulos de heparina de los mastocitos y el retículo endoplasmático ambos), rugoso de los plasmocitos, exhiben metacromasia. Por tanto, componentes citoplasmáticos como el ergastoplasma el azul de toluidina aparecerá de púrpura a rojo cuando tiña (también por los grupos fosfato ionizados en el ARN ri- estos componentes. bosómico) y materiales extracelulares como los hidratos de carbono Grupos aldehído y el reactivo de Schiff complejos de la matriz del cartílago (por los grupos sulfato La capacidad de la fucsina básica decolorada (reactivo de ionizados). Schiff) para reaccionar con los grupos aldehído trae como La tinción con colorantes ácidos es menos específica, pero resultado la aparición de un color rojo distintivo y es la base más sustancias dentro de las células y en la matriz extrace- de las reacciones de ácido peryódico-reactivo de Schiff y de lular presentan acidofilia. Feulgen. Entre estas sustancias se incluyen:: La reacción de ácido peryódico-reactivo de Schiff (PAS) tiñe hidratos de carbono y macromoléculas con abundancia de la mayor parte de los filamentos citoplasmáticos, en es- ellos. Se utiliza para demostrar glucógeno en las células, moco pecial los de las células musculares, en diversas células y tejidos, la membrana basal subyacente la mayoría de los componentes membranosos intrace- epitelios y fibras reticulares en el tejido conjuntivo. El reactivo lulares y la mayor parte del citoplasma no especializado, y de Schiff también se utiliza en la reacción de Feulgen, que se la mayor parte de las fibras extracelulares (principal- basa en una hidrólisis débil con ácido clorhídrico para teñir mente a causa de grupos amino ionizados). el ADN. Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas CH001.indd 6 07/09/2015 01:17:20 p.m.  CUADRO 1-2 Consideraciones funcionales: microespectrofotometría de Feulgen 7 La microespectrofotometría de Feulgen es una técnica En la actualidad, la microespectrofotometría de Feulgen se CAPÍTULO 1 ideada para el estudio de los aumentos del ADN en las células utiliza para estudiar cambios en el contenido del ADN de las en desarrollo y para analizar la ploidía, es decir, la cantidad de células en división que se están diferenciando. También se uti- veces que está multiplicado el contenido normal del ADN en liza en clínica para analizar la cantidad cromosómica anómala una célula (se dice que una célula somática normal que no se (es decir, patrones de ploidía) en las células malignas. Se dice está dividiendo, es diploide; en cambio, los espermatozoides que algunas células malignas que tienen un patrón mayorita- o los óvulos son haploides). Dos técnicas, citometría está- riamente diploide, están bien diferenciadas; los tumores con tica para cortes de tejidos y citometría de flujo para células este tipo de células tienen un pronóstico mejor que los tumo- aisladas, se utilizan para cuantificar el ADN nuclear. La técnica res aneuploides (con múltiplos no enteros de la cantidad ha- Técnicas de citometría estática de cortes de tumores teñidos con el ploide de ADN) o tetraploides. La microespectrofotometría de método de Feulgen se vale de la microespectrofotometría Feulgen ha sido de particular utilidad en los estudios de ade- acoplada a un sistema de visualización digital para cuantificar nocarcinomas (cánceres epiteliales), cáncer de mama, cáncer la absorción de la luz con una longitud de onda de 560 nm de riñón, cáncer de colon y de otras partes del tubo digestivo, por parte de las células y de las aglomeraciones celulares. En cáncer de endometrio (mucosa del útero) y cáncer ovárico. cambio, la técnica de citometría de flujo utiliza instrumentos Es una de las herramientas más valiosas que los patólogos capaces de rastrear sólo células individuales que fluyen ante utilizan para valorar el potencial metastásico de estos tumo- H I S T O Q U Í MI C A Y C I T O Q U Í MI C A un detector en un medio líquido. Esta técnica permite el aná- res y para tomar decisiones de pronóstico o terapéuticas. lisis cuantitativo rápido de una célula individual sobre la base de la medición de la luz fluorescente emitida. La reacción de PAS tiene como fundamento lo siguiente: El material intracelular que se tiñe con la reacción de PAS se puede identificar como glucógeno por el tratamiento previo Los anillos hexosa de hidratos de carbono contienen car- de los cortes con diastasa o amilasa. La falta de tinción des- bonos contiguos, cada uno de los cuales lleva un grupo pués de este tratamiento identifica positivamente el material hidroxilo (–OH). teñido como glucógeno. Las hexosaminas de glucosaminoglucanos contienen car- Del mismo modo, el pretratamiento de los cortes histo- bonos contiguos, uno de las cuales lleva un grupo –OH, lógicos con desoxirribonucleasa (ADNasa) evitará la tinción mientras que el otro lleva un grupo amino (–NH2). de Feulgen en esos cortes y el tratamiento de las muestras El ácido peryódico escinde la unión entre estos átomos de de epitelios secretores de proteínas con ribonucleasa (RNasa) carbono contiguos y forma grupos aldehído. suprimirá la tinción del ergastoplasma con colorantes básicos Estos grupos aldehído reaccionan con el reactivo de Schiff para dar un color púrpura distintivo. Histoquímica enzimática La tinción PAS de la membrana basal (fig. 1-2) y las fibras Las técnicas histoquímicas también se utilizan para identi- reticulares se basa en el contenido o asociación de proteo- ficar y localizar enzimas en células y tejidos. glucanos (hidratos de carbono complejos asociados con un Para localizar las enzimas en los cortes histológicos, debe te- Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas núcleo de proteína). Esta tinción es una alternativa a los mé- todos de impregnación argéntica, que también se basan en la nerse un cuidado especial en la fijación para preservar la ac- tividad enzimática. Por lo general, la fijación aldehídica leve reacción con las moléculas de sacáridos en los proteoglucanos. es el método preferido. En estos procedimientos se detecta La reacción de Feulgen se basa en la separación de purinas el producto de reacción de la actividad enzimática y no la de la desoxirribosa del ADN mediante una hidrólisis ácida enzima propiamente dicha. En general, se usa un reactivo de débil; el anillo de los sacáridos se abre a continuación y se captura, ya sea un colorante o un metal pesado, para atrapar forman grupos aldehído. Una vez más, los grupos aldehído o fijar el producto de reacción de la enzima mediante preci- recién formados reaccionan con el reactivo de Schiff para dar pitación en el sitio de reacción. En una reacción típica para el color púrpura característico. La reacción del reactivo de detectar una enzima hidrolítica, el corte histológico se coloca Schiff con el ADN es estequiométrica, lo que significa que en una solución que contiene un sustrato (AB) y un agente el producto de esta reacción es medible y es proporcional a la de captura (T) que precipitará uno de los productos de la cantidad de ADN. Por consiguiente, se puede utilizar en los siguiente manera: métodos espectrofotométricos para cuantificar la cantidad de enzima ADN en el núcleo de una célula. El ARN no se tiñe con el AB 1 T AT 1 B reactivo de Schiff porque carece de desoxirribosa. donde AT es el producto final capturado y B es el sustrato hidrolizado. Digestión enzimática Mediante el uso de tales técnicas, se pudo correlacionar el La digestión enzimática para un componente específico lisosoma, identificado por primera vez en estudios celulares (como glucógeno, ADN o ARN), se puede utilizar para con- de centrifugación diferencial, con un componente vacuolar firmar la identidad del material que se tiñe. visible en fotomicrografías electrónicas. En los tejidos some- Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas CH001.indd 7 07/09/2015 01:17:20 p.m.  8 HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA a b FIGURA 1-3 ▲ Técnicas histoquímicas ópticas y electrónicas a. Esta micrografía electrónica muestra la ubicación de ATPasa en la membrana de las células epiteliales de la vesícula biliar de un conejo. Las áreas oscuras visibles en la micrografía electrónica corresponden a la ubicación de la enzima ATPasa. Esta enzima se detecta en la membrana plasmática en los dominios laterales de las células epiteliales, que corresponden a la ubicación de las bombas de sodio. Estas células epiteliales están involucradas en el transporte activo de moléculas a lo largo de la membrana plasmática. 26 000 X. b. Esta fotomicrografía muestra macrófagos teñidos con una técnica histoquímica utilizando anticuerpos marcados con peroxidasa y reactivo DAB. Un corte en parafina de un riñón de ratón con hipertensión vascular renal se tiñó para detectar la presencia del marcador proteico específico F4/80+ expresada sólo en la superficie de los macrófagos. Primera- mente, las secciones fueron incubadas con los anticuerpos primarios de rata contra F4/80+ seguido de la incubación con anticuerpos secundarios de cabra anti- IgG de rata marcados con peroxidasa de rábano. La muestra se lavó y se trató con un amortiguador (buffer) que contenía DAB. Se observa un precipitado de color Técnicas pardo (producto de la oxidación DAB por peroxidasa de rábano) en las áreas donde los macrófagos están presentes. Se hizo tinción de contraste a esta muestra con hematoxilina para visualizar los núcleos celulares. 400 X. (Gentileza del Dr. Joseph P. Grande). tidos a una fijación débil, las hidrolasas ácidas y las esterasas de la fosfatasa ácida). Entonces, el producto reactivo precipi- contenidas en los lisosomas reaccionan con un sustrato ade- tado puede observarse tanto con un microscopio óptico como cuado. La mezcla reactiva también contiene iones de plomo electrónico. Se han desarrollado procedimientos histoquími- para precipitar (p. ej., fosfato de plomo derivado de la acción cos similares para demostrar la fosfatasa alcalina, la adenosina CAPÍTULO 1 trifosfatasa (ATPasa) de varios tipos (incluyendo el Na+ / K+ ATPasa que es la base enzimática de la bomba de sodio en células y tejidos), diversas esterasas y muchas enzimas respira- torias (fig. 1-3a). Uno de los métodos histoquímicos más comunes (a me- nudo utilizado en combinación con la inmunocitoquímica) emplea peroxidasa de rábano para la detección de antígenos mediada por enzimas. Un sustrato ampliamente utilizado para la peroxidasa de rábano es la 3,3’ diaminobenzidina (DAB), un compuesto orgánico incoloro que genera un pro- ducto insoluble de color pardo en el sitio de la reacción enzi- Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas mática (fig. 1-3b). El producto de esta reacción enzimática se puede localizar en las células de forma simple, produciendo imágenes de alta resolución, tanto en un microscopio óptico como electrónico. Inmunocitoquímica La especificidad de la reacción entre el antígeno y el anticu- FIGURA 1-4 ▲ Imagen de microscopía confocal de una erpo es el fundamento de la inmunocitoquímica célula muscular cardíaca de rata. Esta imagen se obtuvo con el mi- Los anticuerpos, también llamados inmunoglobulinas, son croscopio confocal mediante el uso de la técnica de inmunofluorescen- cia indirecta. Se utilizaron dos anticuerpos primarios. El primer anticuerpo glucoproteínas que se producen por las células específicas del primario reconoce un transportador específico de lactato (MCT1) y se sistema inmunitario en respuesta a una proteína extraña o detecta con un anticuerpo secundario conjugado con rodamina (rojo). antígeno. En el laboratorio, los anticuerpos pueden purifi- El segundo anticuerpo primario está dirigido contra la proteína trans- carse de la sangre y conjugarse (asociarse) con un colorante membrana CD147, que está estrechamente asociada con MCT1. Este anticuerpo se detectó mediante un anticuerpo secundario marcado con fluorescente. En general, los colorantes fluorescentes (fluo- fluoresceína (verde). El color amarillo aparece en el sitio en el que los dos rocromos) son productos químicos que absorben la luz de anticuerpos secundarios marcados tienen exactamente la misma locali- longitudes de onda diferente (p. ej., luz ultravioleta) y luego zación (colocalizan) dentro de la célula muscular cardíaca. Esta imagen emiten luz visible de una longitud de onda específica (p. tridimensional muestra que ambas proteínas están distribuidas en la su- perficie de la célula muscular, mientras que el transportador de lactato ej., verde, amarillo, rojo). La fluoresceína, el colorante más solo, aparece profundo con respecto a la membrana plasmática. (Genti- utilizado, absorbe la luz ultravioleta y emite luz verde. Los leza de los Dres. Andrew P. Halestrap y Catherine Heddle). anticuerpos conjugados con fluoresceína se pueden aplicar a Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas CH001.indd 8 07/09/2015 01:17:22 p.m.  CUADRO1-3 Correlación clínica: anticuerpos monoclonales en medicina 9 En la actualidad, los anticuerpos monoclonales son de dades infecciosas para identificar microorganismos en la CAPÍTULO 1 uso muy difundido en técnicas inmunocitoquímicas y tam- sangre y en los líquidos de los tejidos. En estudios clínicos bién tienen muchas aplicaciones clínicas. Los anticuerpos recientes, se han usado los anticuerpos monoclonales con- monoclonales conjugados con compuestos radiactivos se jugados con inmunotoxinas, fármacos de quimioterapia o utilizan para detectar y diagnosticar metástasis tumorales radioisótopos para administrar agentes terapéuticos a las en patología, diferenciar los subtipos de tumores y sus células tumorales específicas en el cuerpo. etapas de su diferenciación y en el diagnóstico de enferme- Técnicas cortes de tejidos congelados o fijados levemente en portaobje- junto, estos anticuerpos policlonales representan mezclas tos de vidrio para localizar un antígeno en células y tejidos. La de diferentes anticuerpos producidos por muchos clones de reacción del anticuerpo con el antígeno puede entonces exa- linfocitos B donde cada clon reconoce diferentes regiones de minarse y fotografiarse con un microscopio de fluorescencia la molécula de actina. Los anticuerpos se retiran de la san- o un microscopio confocal que produce una reconstrucción gre, se purifican y conjugan con un colorante fluorescente. tridimensional de los tejidos examinados (fig. 1-4). Éstos ahora sí se pueden utilizar para localizar moléculas de H I S T O Q U Í MI C A Y C I T O Q U Í MI C A En la inmunocitoquímica se utilizan dos tipos de anticu- actina en tejidos o células de rata. Si la actina está presente erpos: anticuerpos policlonales producidos por animales en una célula o tejido, como un fibroblasto en el tejido con- inmunizados y anticuerpos monoclonales producidos por juntivo, el anticuerpo marcado con fluoresceína se une a líneas celulares inmortalizadas (duplicación continua). la misma y la reacción puede verse con el microscopio de En un procedimiento típico, una proteína específica, como fluorescencia. la actina, se aísla a partir de una célula muscular de una Los anticuerpos monoclonales (cuadro 1-3) son los pro- especie, p. ej. una rata, y se inyecta en la circulación de otra ducidos por una línea celular productora de anticuerpos especie, p. ej. un conejo. En el conejo inmunizado, el sis- que se derivó de un solo clon de linfocitos B. Para producir tema inmunitario reconoce las moléculas de actina de la rata anticuerpos monoclonales contra un antígeno específico, se como un antígeno extraño. Este reconocimiento desenca- inmuniza un ratón o rata con ese antígeno. Los linfocitos B dena una cascada de reacciones inmunitarias que activan las activados, que son de diferentes clonas, son aislados del tejido células inmunitarias llamadas linfocitos B. Diferentes clones linfático (bazo o ganglios linfáticos) del animal y se fusionan de linfocitos B se activan y eventualmente conducen a la con células de mieloma (células tumorales inmortales) para producción y secreción de anticuerpos anti-actina. En con- generar hibridomas. Esta fusión produce diferentes hibrido- INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA Anticuerpo Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas a Antígeno Anticuerpo secundario fluorescente INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA Anticuerpo primario b FIGURA 1-5 ▲ Inmunofluorescencia directa e indirecta. a. En la inmunofluorescencia directa, un anticuerpo primario marcado con fluoro- cromo reacciona con un antígeno específico dentro de la muestra de tejido. A continuación, las estructuras marcadas, se examinan con el microscopio de fluorescencia en el que una longitud de onda excitadora (por lo general luz ultravioleta) desencadena la emisión de otra longitud de onda. La longitud de esta emisión depende de la índole del fluorocromo utilizado para marcar el anticuerpo. b. El método indirecto comprende dos procesos. Primero, los anticuerpos primarios específicos reaccionan con el antígeno de interés. Segundo, los anticuerpos secundarios, que están marcados con fluorocromo, reaccionan con los anticuerpos primarios. La apariencia de las estructuras marcadas dentro del tejido es la misma en ambos métodos y para verlas se necesita un microscopio de fluorescencia. Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas CH001.indd 9 07/09/2015 01:17:23 p.m.  se conjuga con un anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo primario de rata (es decir, p. ej., anticuerpo de 10 cabra dirigido contra el anticuerpo de rata; fig. 1-5b). Por lo tanto, cuando la fluoresceína se conjuga directamente con el anticuerpo primario específico, el método es directo; cuando HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA la fluoresceína se conjuga con un anticuerpo secundario, el método es indirecto. El método indirecto aumenta en forma considerable la emisión de la señal de fluorescencia del tejido. Una ventaja adicional del método de marcaje indirecto Es que un solo anticuerpo secundario se puede utilizar para localizar la unión específica de tejido de diferentes anti- cuerpos primarios (fig. 1-6). Para los estudios microscópicos, el anticuerpo secundario puede conjugarse con diferentes co- lorantes fluorescentes de modo que se vean múltiples marcas FIGURA 1-6  Microtúbulos vistos con técnicas inmunoci- en el mismo corte de tejido (v. fig. 1-4). Las desventajas de la toquímicas. El comportamiento de los microtúbulos (elementos del inmunofluorescencia indirecta son que es cara, requiere de citoesqueleto) obtenidos de células de tumores de mamarios humanos mucho trabajo y no se adapta con facilidad a los procedimien- puede estudiarse in vitro mediante la cuantificación de su actividad de tos automatizados. nucleación, que es iniciada por el centrosoma. Esta imagen se obtuvo con el microscopio de fluorescencia. Mediante el uso de técnicas de inmuno- También es posible conjugar anticuerpos policlonales o fluorescencia indirecta, los microtúbulos se marcaron con una mezcla de monoclonales con otras sustancias, como enzimas (p. ej., pe- anticuerpos monoclonales antitubulina a y antitubulina b (anticuerpos roxidasa de rábano), que convierten sustratos incoloros (p. ej., DAB) en un producto insoluble de un color específico Técnicas primarios) y éstos se visualizaron con anticuerpos secundarios conjuga- dos con fluoresceína (inmunoglobulina G de cabra anti-ratón unida a que precipita en el sitio de la reacción enzimática. La tin- isotiocianato de fluoresceína). La reacción antígeno-anticuerpo, realizada directamente sobre el cubreobjetos de vidrio, permitió ver las moléculas ción que resulta de este método de inmunoperoxidasa se de tubulina responsables de la formación de más de 120 microtúbulos puede observar en el microscopio óptico (v. fig. 1-3b), ya sea que aparecen en esta imagen. Estos se originan en el centriolo y se ex- con técnicas inmunocitoquímicas directas o indirectas. En tienden desde él unos 20 a 25 mm para adquirir una distribución radial otra variante, el oro coloidal o ferritina (una molécula que uniforme. 1 400 X. (Fotomicrografía gentileza de las Dras. Wilma L. Lingle contiene hierro) se pueden unir a la molécula de anticuerpo. CAPÍTULO 1 y Vivian A. Negron). Estos marcadores densos en electrones pueden verse directa- mente con el microscopio electrónico. mas, uno por cada clon de linfocito B activado fusionado a la célula del mieloma, que conserva su capacidad de secretar un Técnicas de hibridación solo tipo de anticuerpo (monoclonal) y que al mismo tiempo La hibridación es un método de localización de ARN men- es una célula inmortal. Por ejemplo, para obtener anticuerpos sajero (ARNm) o ADN mediante la hibridación de la secuen- monoclonales contra moléculas de actina humana, los linfo- cia de interés con una sonda de nucleótidos de secuencia citos B de los órganos linfáticos de conejos inmunizados con complementaria. esta actina deben fusionarse con células de mieloma, y pos- teriormente identificar los hibridomas que secreten un anti- cuerpo monoclonal que reconozca a dicha actina. Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas Para localizar un antígeno diana (o blanco) en células y teji- dos, se utilizan técnicas inmunocitoquímicas tanto directas como indirectas. La técnica de inmunocitoquímica más antigua utilizada para la identificación de la distribución de un antígeno dentro de las células y tejidos se conoce como inmunofluorescen- cia directa. Esta técnica utiliza un anticuerpo primario (ya sea policlonal o monoclonal) marcado con fluorocromo que reacciona con el antígeno dentro de la muestra (fig. 1-5a). Como procedimiento de un solo paso, este método involucra un único anticuerpo marcado. La visualización de las estruc- turas no es ideal debido a la baja intensidad de la emisión de FIGURA 1-7 ▲ Ejemplo de la técnica FISH utilizada en una la señal. Debido a la sensibilidad subóptima, los métodos de prueba de detección prenatal. Núcleos en interfase de células obte- nidas de muestras de líquido amniótico se hibridaron con dos sondas de inmunofluorescencia directa están siendo reemplazados cada ADN específicas. La sonda naranja (LSI 21) es específica para un locus del vez más por los métodos indirectos. cromosoma 21, y la sonda verde (LSI 13) es específica para un locus del La inmunofluorescencia indirecta proporciona una sen- cromosoma 13. El núcleo a la derecha proviene de una muestra de líquido sibilidad mucho mayor que los métodos directos y a menudo amniótico normal y exhibe dos señales verdes y dos naranjas, lo que in- recibe el nombre de “técnica del emparedado” o “de la capa dica que hay dos copias de los cromosomas 13 y 21, respectivamente. El núcleo de la izquierda tiene tres señales naranjas, que indican una triso- doble”. En lugar de conjugar un fluorocromo con un anti- mía del cromosoma 21 (síndrome de Down). El ADN se ha teñido de azul cuerpo (primario) específico dirigido contra el antígeno de con un colorante de contraste no específico (DAPI) para tornar visible el interés (p. ej., una molécula de actina de rata), el fluorocromo núcleo. 1 250 X. (Gentileza del Dr. Robert B. Jenkins). Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas CH001.indd 10 07/09/2015 01:17:23 p.m.  En general, el término hibridación describe la capacidad de fica del ARNm, se utilizan sondas de ARN complementarias. las moléculas monocatenarias de ARN o ADN para interac- Estas sondas se marcan con isótopos radioactivos (p. ej., 32P, tuar (hibridar) con secuencias complementarias. En el labora- 35S, 3H), un nucleótido modificado específicamente (digoxi- 11 torio, la hibridación requiere el aislamiento del ADN o ARN, genina), o biotina (un marcador multipropósito covalente que se mezcla a continuación con una secuencia de nucleó- utilizado con frecuencia). Las sondas radioactivas se pueden CAPÍTULO 1 tidos complementaria (denominada sonda de nucleótidos). detectar y visualizar mediante la autorradiografía. La digoxi- Los híbridos se detectan más a menudo usando un marcador genina y la biotina se detectan por métodos inmunocitoquí- radiactivo unido a un componente del híbrido. micos y citoquímicos, respectivamente. La unión de la sonda y la secuencia puede tener lugar en La fuerza de los enlaces entre la sonda y la secuencia com- una solución o en una membrana de nitrocelulosa. En la plementaria depende del tipo de ácido nucleico en las dos hibridación in situ, la localización del ARNm o ADN es- cadenas. Un enlace más fuerte se forma entre una sonda de pecífico (p.ej., ARNm para insulina) se realiza directamente ADN y una cadena de ADN complementaria y el más débil Técnicas dentro de las células o tejidos, como células de cultivo o em- briones enteros, adicionando la sonda de nucléotidos mar- lo hace entre una sonda de ARN y cadena de ARN comple- cada radiactivamente. Esta técnica permite la localización de mentaria. Si se espera que una muestra de tejido contenga secuencias de nucleótidos específicas tan pequeñas como 10 o una cantidad muy pequeña de ARNm o un transcrito vírico, 20 copias de ARNm o ADN por célula. puede utilizarse la amplificación de la reacción en cadena de En la hibridación in situ se utilizan diversas sondas de la polimerasa (PCR) para el ADN o la PCR con transcriptasa nucleótidos. Las sondas de oligonucleótidos pueden conte- inversa (RT-PCR) para el ARN. Las transcripciones amplifica- H I S T O Q U Í MI C A Y C I T O Q U Í MI C A ner un mínimo de 20 a 40 nucleótidos. Las sondas de ADN das obtenidas durante estos procedimientos suelen detectarse monocatenario o bicatenario son mucho más largas y pueden mediante el uso de sondas de nucleótidos complementarias contener hasta 1 000 nucleótidos. Para la localización especí- marcadas en técnicas de hibridación in situ estándares. Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas inv tub a b FIGURA 1-8 ▲ Ejemplos de autorradiografía óptica y electrónica. a. Fotomicrografía de un corte de ganglio linfático de un animal al que se le administró timidina tritiada [3H]. Algunas de las células exhiben aglomeraciones de gránulos de plata metálica con el aspecto de pequeñas partículas negras (flechas). Estas células han sintetizado ADN en preparación para la división celular y han incorporado la [3H] timidina en el ADN recién formado. Con el tiempo, las partículas radiactivas de baja energía emitidas por la [3H] timidina chocan contra los cristales de haluro de plata de una emulsión fotográfica que cubre la muestra (exposición) y crea una imagen latente (como hace la luz al incidir sobre la película de una cámara de fotos). Durante el revelado del portaobjetos cubierto con la emulsión, la imagen latente, en realidad el haluro de plata activado, se reduce a plata metálica, que aparece como gránulos negros en el microscopio. 1 200 X. (Preparado original gentileza del Dr. Ernst Kallenbach). b. Autorradiografía microscópica electrónica de la región apical de una célula absortiva intestinal. Se le inyectó a un animal 125I unido a factor de crecimiento nervioso (NGF) y la muestra de tejido se retiró 1 hora más tarde. Después se preparó de una manera similar a la de la microscopía óptica. El tamaño relativamente pequeño de los gránulos de plata contribuye a la localización precisa de los complejos 125I -NGF. Debe observarse que los gránulos de plata se concentran en la de invaginaciones apicales (inv) y en las siluetas tubulares endosómicas tempranas (tub). 32 000 X. (Fotomicrografía electrónica gentileza de la Dra. Marian R. Neutra). Centro de Estudiantes de Ciencias Médicas CH001.indd 11 07/09/2015 01:17:23 p.m.  cuada en una cámara oscura, por lo general durante días a TABLA 1- 3 Resolución del ojo en comparación semanas, la emulsión expuesta se revela con las técnicas fo- 12 con la de los microscopios tográficas comunes y el portaobjetos con la muestra se man- tiene siempre sellado con un cubreobjetos. Los preparados se Distancia entre los puntos que se resuelven pueden teñir antes o después de la exposición y revelado. Por MICROSCOPÍA Ojo humano 0,2 mm medio de este procedimiento, se exponen y se revelan los grá- Microscopio óptico de campo claro 0,2 mm nulos de plata en la emulsión sobre las moléculas marcadas ra- MEB 2,5 nm diactivamente y aparecen como puntos oscuros que recubren el sitio de la emisión radiactiva cuando la muestra se examina MET En la teoría 0,05 nm con el microscopio óptico (fig. 1-8a). En la práctica 1,0 nm Estos gránulos pueden utilizarse simplemente para indicar la ubicación de una sustancia o pueden contarse para propor- Microscopio de fuerza atómica 50,0 pm cionar información semicuantitativa sobre la cantidad de una sustancia dada en un sitio específico. Por ejemplo, después Técnicas MEB, microscopio electrónico de barrido; MET, microscopio electrónico de transmisión. de inyectar timidina tritiada a un animal, las células que han incorporado este nucleótido en su ADN antes de dividirse Recientemente, los colorantes fluorescentes se han com- tendrán aproximadamente el doble de gránulos de plata sobre binado con sondas de nucleótidos, por lo que es posible vi- sus núcleos que las células que se han dividido después de la sualizar múltiples sondas al mismo tiempo (fig. 1-7). Esta incorporación del nucleótido marcado. CAPÍTULO 1 técnica, llamada técnica de hibridación in situ con fluores- La autorradiografía también puede practicarse sobre cortes cencia (FISH), tiene un uso muy difundido en clínica para delgados de material incluido en plástico para su observación las pruebas genéticas. Por ejemplo, una sonda hibridada con con el ME. En esencia, se utilizan los mismos procedimien- cromosomas en metafas