Biochemie Und Pathobiochemie VO Sommersemester 2024 - PDF

Biochemie und Pathobiochemie VO Nr. 550.036 Sommersemester 2024 BIOAB26V & BIOAB27B Maike Werning [email protected] Inhalte der Lehrveranstaltung Enzyme energetische Prinzipien der Enzymaktivität Mechanismen der Enzymakt...

Biochemie und Pathobiochemie VO Nr. 550.036 Sommersemester 2024 BIOAB26V & BIOAB27B Maike Werning [email protected] Inhalte der Lehrveranstaltung Enzyme energetische Prinzipien der Enzymaktivität Mechanismen der Enzymaktivität Coenzyme Enzymkinetik Regulierung der Enzymaktivität mit Pathobiochemie Beispielen Stoffwechsel Crashkurs: Vererbungslehre Reaktionsketten energetische Grundlagen des Stoffwechsels Glykolyse Zitratzyklus Atmung - oxidative Phosphorylierung Gluconeogenese Empfohlene Literatur Die Biochemie beschreibt die chemischen Vorgänge in Lebewesen und stellt die Überschneidung zwischen Chemie, Biologie und Physiologie dar. Biochemie beinhaltet z.B. Stoffwechselvorgänge in Organismen und Organen, Synthesen und Abbau von Zellbausteinen, Energiegewinnung in Zellen etc. Lehrbuch der Molekularen Zellbiologie Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA; Short Facts Zweck: Einführung in die Biochemie & Pathobiochemie Verbindung zur Molekularbiologie als auch Zellbiologie ist fließend => Grundlage für kommende Lehrveranstaltungen => Aufbau zu vorherigen Lehrveranstaltungen Beurteilung erfolgt durch eine „schriftliche“ Prüfung ca. 20 MC Fragen pro Teil ca. 1 offene Frage pro Teil eine Anwesenheitspflicht von mindestens 80 % Enzyme Metabolismus und Energie Ein konstanter Input an Energie ist notwendig um lebende Organismen aufrecht zu erhalten. In lebenden Systemen müssen Zellen Energie aufbringen um Strukturen und Moleküle durch Ordnung entstehen zu lassen. Der Energieaustausch eines Organismus mit seiner Umgebung lässt sich durch die Hauptsätze der Thermodynamik beschreiben. Thermodynamik beschreibt die Gesetzmäßigkeiten zur Erhaltung und Transformation von Energie. 1. Hauptsatz: Energie kann weder erzeugt noch vernichtet werden, nur in andere Energiearten umgewandelt werden. 2. Hauptsatz: Thermische Energie ist nicht in beliebigem Maße in andere Energiearten umwandelbar. Alberts, Lehrbuch der Molekularen Zellbiologie © 2012 Wiley-VCH, Abb 3.11 Enzyme (Enzym) Enzyme sind (fast immer) Proteine, die als Biokatalysator biochemische Reaktionen im Organismus steuern und beschleunigen, ohne dabei selbst verändert zu werden. Sie sind in allen Körperzellen enthalten und sind unerlässlich für alle Körperfunktionen. energetische Prinzipien der Enzymaktivität Enzyme setzen die Aktivierungsenergie herab Enzyme katalysieren biochemische Reaktionen indem sie die Aktivierungsenergie (EA) einer Reaktion herabsetzen erhöhen die Geschwindigkeit einer Reaktion verändert NICHT die Lage des chemischen Gleichgewichtes Alberts, Lehrbuch der Molekularen Zellbiologie © 2012 Wiley-VCH exergone / endergone Reaktion ΔG = Änderung der freien Enthalpie/ Gibbs-Energie ΔH = Änderung der Reaktionsenthalpie ΔS = Entropieänderung exergone Reaktionen, laufen spontan ab, ΔG nimmt ab => ein negatives Vorzeichen hat endergone Reaktionen laufen nicht freiwillig ab, ΔG hat => ein positives Vorzeichen energetische Kopplung von Reaktionen ATP u.a. koppelt exergone und endergone Reaktionen Reaktion kann nur dann realisiert werden, wenn sie an andere, exergone Prozesse gekoppelt wird Chemische Kopplung exergoner und endergoner Reaktionen unter der Beteiligung energiereicher Verbindungen in biologischen Systemen ist dies meist die Hydrolyse von ATP. Chemiosmotische Kopplung ist die Erzeugung eines Membranpotentials mit Hilfe exergoner Reaktionen, dessen Abbau eine endergone Reaktion ermöglicht. Stoffwechsel (Metabolismus) alle chemischen Umwandlungen von Stoffen im Körper von Lebewesen z.B. Umwandlung von Nahrungsmitteln in Zwischenprodukte (Metaboliten) und Endprodukte. dienen dem Aufbau, Abbau, Ersatz, Erhalt der Körpersubstanz (Baustoffwechsel) Energiegewinnung für energieverbrauchende Aktivitäten (Energiestoffwechsel) Aufrechterhaltung der Körperfunktionen essentiell für den Stoffwechsel sind Enzyme ca. 500 häufige Stoffwechselreaktionen dargestellt jeder Punkt ist symbolisiert ein Molekül Enzymkatalyse durch einen Verbindungsstrich dargestellt Enzyme erhöhen die Geschwindigkeit Enzyme erhöhen die Geschwindigkeit von Stoffwechselreaktionen um ein Vielfaches. Bsp.: die OMP-Decarboxylase ist als außerordentlich effizienter Katalysator bekannt, der die unkatalysierte Reaktionsgeschwindigkeit um den Faktor 1017 beschleunigen kann. Daher würde die Reaktion in Abwesenheit des Enzyms 78 Millionen Jahre dauern. Mit Enzym dagegen 18 Millisekunden. Orotidin-Monophosphat-Decarboxylase 1017 Triosephosphat Isomerase 109 Carboanhydrase 107 Alberts, Lehrbuch der Molekularen Zellbiologie © Wiley-VCH Enzymreaktion Alberts, Lehrbuch der Molekularen Zellbiologie © Wiley-VCH Energie, Enzyme und Stoffwechsel © Springer Verlag Enzyme: aktives Zentrum wasserfreier Reaktionsraum korrekte räumliche Anordnung des Substrats Aminosäurereste im aktiven Zentrum binden das Substrat in optimaler Orientierung – wird Aktivierungsenergie herabgesetzt. Im aktiven Zentrum können Aminosäurereste Ladungen des Substrats übernehmen oder umlagern. Durch die spezifische strukturelle Anpassung des aktiven Zentrums wird die Aktivierungsenergie einer Reaktion gesenkt Energie, Enzyme und Stoffwechsel © Springer Verlag Reaktionsprofil einer chemischen Reaktion Die freie Enthalpie des Systems wird gegen den Verlauf der Reaktion S→P aufgetragen. Übergangszustand Die freie Enthalpie des Endprodukts P ist geringer als die des Ausgangsstoffs S im Grundzustand, sodass ∆G° dieser Reaktion negativ ist und das Gleichgewicht die Seite P Freie Energie, bevorzugt. Den Energieunterschied zwischen dem Grundzustand und dem Übergangszustand nennt man Aktivierungsenergie (∆G‡). Grundzustand Je höher die Aktivierungsenergie, desto Grundzustand langsamer verläuft die Reaktion. Reaktionskoordinate ΔG° -> Maße für die freie Energieänderung einer Reaktion. Nelson & Cox, Lehninger Biochemie Springer Verlag Reaktionsprofil einer enzymkatalysierten Reaktion Reaktionsprofil einer enzymkatalysierten Reaktion (in blau): Übergangszustand Bei der enzymkatalysierten Reaktion von S zu P zeigen die Zwischenprodukte ES und EP Minima auf der Energiekurve. Die Vergleiche zwischen ∆G‡nichtkat und ∆G‡kat Freie Energie, zeigen, dass die Aktivierungsenergie deutlich niedriger ist, wenn ein Enzym die Reaktion katalysiert. Je höher die Aktivierungsenergie, desto langsamer verläuft die Reaktion. Katalysatoren beschleunigen Reaktionen, indem sie die Aktivierungsenergie senken. Die Lage und Richtung des Gleichgewichts Reaktionskoordinate werden durch den Katalysator nicht beeinflusst. Nelson & Cox, Lehninger Biochemie Springer Verlag Mechanismen des Enzym-Substratkomplexes 1. Schlüssel-Schloss-Prinzip: in das aktive Zentrum des Enzyms passen nur ganz bestimmte Substrate => substratspezifisch => da das Enzym nur eine bestimmte Reaktion katalysiert => wirkungsspezifisch (Emil Fischer, 1894) 2. induzierte Passform – ‚induced fit‘: sowohl das Substrat als auch das Enzym ändern dabei ihre Konformation => induzierte Anpassung; z.B. bei Kinasen ist das Prinzip zu beobachten; (Daniel Koshland, 1958) Alberts, Lehrbuch der Molekularen Zellbiologie © Wiley-VCH Aktive Zentrum und katalytische Zyklus eines Enzyms Mechanismen des Enzym-Substratkomplexes !! kein Enzym (b) Ein Enzym, das komplementär Enzym komplementär zum Substrat zum Substrat ist, stabilisiert den ES- Komplex, wobei dieser im Grundzustand eine geringere freie Enthalpie als das Substrat allein aufweist. Dies führt zu einem Anstieg der Aktivierungsenergie. Enzym komplementär zum Übergangszustand (c) Ein Enzym, das komplementär zum Übergangszustand ist, unterstützt dessen Stabilisierung, was zu einer effizienten Katalyse führt. Durch Stabilisierung des Übergangszustandes wird die Nelson & Cox, Lehninger Biochemie Aktivierungsenergie erniedrigt. Springer Verlag Einflussfaktoren der Enzymaktivität Enzymaktivität bezieht sich auf die Geschwindigkeit, mit der ein Enzym ein Substrat in ein Produkt umwandelt. Sie wird oft in Einheiten wie "Mikromol Substrat pro Minute" gemessen. Die Enzymaktivität hängt von verschiedenen Faktoren ab, darunter: Temperatur pH-Wert Substratkonzentration Vorhandensein von Co-Faktoren / Co-Substrate Konzentration des Enzyms Regulatoren des Stoffwechsels Aktivatoren und Inhibitoren können die Enzymaktivität regulieren. Temperatur & RGT-Regel zur Enzymaktivität Die Reaktionsgeschwindigkeit steigt in der Regel mit zunehmender Temperatur gemäß der RGT-Regel (Reaktions-Geschwindigkeits-Temperatur-Regel). Eine Erhöhung der Temperatur um etwa 10°C kann die Reaktionsgeschwindigkeit verdoppeln oder verdreifachen. Dies liegt daran, dass bei höheren Temperaturen die Bewegung der Moleküle in der Lösung zunimmt, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass Enzyme auf ihre passenden Substrate treffen. Enzyme haben eine Temperaturoptimum, bei der ihre Aktivität am höchsten ist. Diese Temperatur liegt oft nahe der Körpertemperatur von etwa 37°C beim Menschen. Bei Temperaturen über dem Optimum können Enzyme denaturieren, was bedeutet, dass ihre strukturelle Integrität irreversibel geschädigt wird. Hitzedenaturierung ist ein Prozess, bei dem die Proteine ihre dreidimensionale Struktur verlieren und somit ihre Funktion als Enzym verlieren können. Einfluss von pH-Wert auf die Enzymaktivität Die Enzymaktivität wird stark von pH-Wert beeinflusst, da die Ladungen der Aminosäuren in der aktiven Stelle des Enzyms durch den pH-Wert des umgebenden Milieus verändert werden. Dies wirkt sich direkt auf die Bindungsfähigkeit des Enzyms an sein Substrat aus und somit auf die Reaktionsrate. Pepsin, ein Enzym im Magen, ein pH-Optimum von 1 bis 2 aufweist. Trypsin, ein Enzym im Dünndarm, ein pH-Optimum von 7 bis 8. alkalische Phosphatase weist ein pH-Optimum von 8-10 auf. Die pH-Präferenz dieses Enzyms entspricht den pH-Bedingungen des cytoplasmatischen Milieus, in dem es tätig ist. Nelson & Cox, Lehninger Biochemie Springer Verlag  Cofaktor: Coenzym & Metall-Ion Cofaktor Ein Cofaktor ist eine anorganische oder organische Verbindung, die neben dem Proteinanteil eines Enzyms benötigt wird, um dessen katalytische Aktivität zu ermöglichen. Cofaktoren können in zwei Hauptkategorien eingeteilt werden: Anorganische Cofaktoren: meist Metallionen, die an das Enzym binden und seine Struktur und/oder Funktion beeinflussen. Beispiele sind Zink, Eisen, Magnesium und Kupfer. Organische Cofaktoren (Coenzyme): werden oft aus Vitaminen abgeleitet und binden an das aktive Zentrum des Enzyms und helfen, Substrate zu binden oder chemische Reaktionen zu katalysieren. Beispiele für Coenzyme sind NAD+, FAD, Coenzym A und Tetrahydrofolsäure. Metallionen als Cofaktoren Ein Cofaktor in Form eines Metallions ist ein anorganisches Ion, Beispiel: Eisen im Häm das eng an ein Enzym gebunden ist und eine wichtige Rolle bei seiner katalytischen Aktivität spielt. Co-Faktor Enzym Cu2+ Cytochrom-Oxidase Fe2+ oder Fe3+ Cytochromoxidase, Katalase, Peroxidase K+ Pyruvat-Kinase Mg2+ Hexokinase, Glucose-6-Phosphatase, Pyruvat-Kinase Mn2+ Arginase, Ribonukleotid-Reduktase Mo Dinitrogenase Ni2+ Urease Se Glutathion-Peroxidase Zn2+ Carboanhydrase, Alkohol-Dehydrogenase Metallionen als Cofaktoren 30% aller Enzyme benötigen Metallionen als Cofaktoren Funktion Katalytische Aktivität: Das Metallion kann direkt an der katalytischen Reaktion beteiligt sein, indem es an Substratmoleküle bindet und die chemische Reaktion erleichtert. Stabilisierung der Proteinstruktur: Das Metallion kann dazu beitragen, die Proteinstruktur des Enzyms zu stabilisieren, indem es spezifische Bindungen mit Aminosäuren im aktiven Zentrum oder anderen Teilen des Proteins eingeht. Elektronentransfer: Einige Metallionen fungieren als Elektronendonor oder -akzeptor, indem sie Elektronen zwischen dem Enzym und seinem Substrat übertragen. Coenzym: Apoenzym und Holoenzym Zusammen bilden das Enzym und der Cofaktor das sogenannte Holoenzym, das die voll funktionsfähige Form des Enzyms darstellt. Ein Enzym ohne seinen Cofaktor wird als Apoenzym bezeichnet und ist inaktiv. Der Cofaktor aktiviert das Apoenzym und ermöglicht seine katalytische Aktivität. Vitamine Vorläufermoleküle für Coenzyme Thiamin (B1) wird Thiaminpyrophosphat (TPP) Prosthetische Gruppe; TPP katalysiert vorrangig oxidative Decarboxylierungen als Teil des PDC; Riboflavin (B2) wird zu Flavinadenindinukleotid (FAD) &Flavinmononukleotid (FMN) Prosthetische Gruppe wichtige Rolle im Elektronentransport in der mitochondrialen Atmungskette; Niacin (B3) wird zu Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) & Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP) Cosubstrat; Carrier-Moleküle - enzymatischen Redoxreaktionen in verschiedenen Stoffwechselprozessen im Körper; Pantothensäure (B5) wird zu Coenzym A (CoA) Cosubstrat; Zellatmung und des Fettstoffwechsels; Folsäure (B9) wird zu Tetrahydrofolsäure (THF) Cosubstrat; wichtig für den Nukleinstoffwechsel ist; Prosthetische Gruppe als Beispiel (Coenzyme) Biotin ist an das Enzym gebunden und spielt eine wichtige Häm ist ein eisenhaltiges Porphyrinmolekül, das mit Rolle bei der Übertragung von Kohlendioxidgruppen in hoher Affinität an das Protein gebunden ist. Es spielt eine verschiedenen Stoffwechselwegen. Es bleibt fest an das entscheidende Rolle bei der Bindung und Freisetzung von Enzym gebunden und kehrt nach der Reaktion in seine Sauerstoff im Blut. Häm bleibt während des gesamten ursprüngliche Form zurück. Reaktionszyklus, in dem Sauerstoff gebunden und freigesetzt wird, an das Protein gebunden und geht verändert aus der Reaktion hervor. Beispiel: Häm im Hämoglobin https://doi.org/10.1016/j.str.2014.04.011 Cofaktor CoEnzym Ein organisches Molekül, das mit hoher Affinität oder kovalent an ein Enzym gebunden ist. Kann nicht mehr vom Enzym dissoziieren. Verlässt die Reaktion verändert und muss sich nach der Reaktion Regenerieren (am Enzym) Prosthetische Gruppe Beispiel: Häm in Hämoglobin und Myoglobin; Biotin in Enzymen wie Carboxylasen; Flavinmononukleotid (FMN) und Flavinadenindinukleotid (FAD); Thiaminpyrophosphat (TPP); Cosubstrat Ein niedermolekulares organisches Molekül, das nicht-kovalent an ein Enzym bindet. Löst sich nach der Katalyse wieder vom Enzym. Während der Reaktion nimmt es chemische Gruppen, Protonen oder Elektronen auf oder gibt diese ab, wodurch sich seine Reaktivität ändert. Verlässt die Reaktion verändert und muss wieder muss sich nach der Reaktion Regenerieren Beispiel: Acetyl-CoA; THF (Tetrahydrofolsäure); NAD+ (Nicotinamidadenindinukleotid) / NADP+ (Nicotinamidadenindinukleotidphosphat); Metall-Ion anorganisches Ion, das eng an ein Enzym gebunden ist für die Katalyse eines Metalloenzym notwendig – katalytische Aktivität, Stabilisierung der Proteinstruktur, Elektronentransfer; Mechanismen der Enzymaktivität Enzymklassifizierung Enzymklasse Reaktionstyp Beispiele (EC-Nummer) Lactat-Dehydrogenase (LDH, 1.1.1.27) 1.Oxidoreduktasen Redoxreaktionen (Elektronentransfer) Succinat-Dehydrogenase (EC 1.3.5.1) (EC 1): Ared + Box ⇌ Aox + Bred Cytochrom c-Oxidase (EC 1.9.3.1) Pyruvat-Dehydrogenase (EC 2.3.1.12) 2. Transferasen Gruppentransfer Hexokinase (2.7.1.1) (EC 2): A-B + C ⇌ A + B-C Glycogen-Phosphorylase (2.7.1.37) Hydrolytische Spaltung ATP-Synthase (EC 3.6.3.14) 3. Hydrolasen A-B + H2O ⇌ A-H + B-OH Phosphofructokinase (EC 3.1.3.11) (EC 3): Enolase (EC 3.2.2.11) Carboanhydrase (4.2.1.1) 4. Lyasen (Synthase) nicht hydrolytische Abspaltung von Gruppen Citrat-Synthase (EC 4.1.3.7) (EC 4): A-B ⇌ A + B Fumarase (EC 4.2.1.2) Glucose-6-phosphat-Isomerase (EC 5.3.1.9) 5. Isomerasen Isomerisierungen Triosephosphat-Isomerase (EC 5.3.1.1) (EC 5): A-B-C ⇌ C-A-B PEP-Carboxykinase (EC 5.4.2.2) Ligation zweier Substrate unter ATP-Verbrauch Acetyl-CoA-Synthetase (EC 6.2.1.1) 6. Ligasen (Synthetasen) A + B + ATP ⇌ A-B + ADP Citrat-Synthase (EC 6.2.1.4) (EC 6): Acetyl-CoA-Carboxylase (EC 6.4.1.2) Reaktionen von: J. Koolman und K‐H Röhm, Taschenatlas Biochemie des Menschen, Thieme Isoenzyme Isoenzyme katalysieren die gleiche Reaktion Unterscheiden sich in: Aminosäuresequenz Enzym-Aktivität Affinität zum Substrat (Km-Werte) ihrem Vorkommen in verschiedenen Organen oder Geweben Isoenzyme ermöglichen es, Enzymreaktionen an die jeweiligen Bedürfnisse verschiedener Gewebe anzupassen. Diese Unterschiede ermöglichen die diagnostische Verwendung, um Gewebeschäden oder spezifische Krankheiten zu identifizieren. Beispiel Creatin-Kinase (CK) => zwei verschiedene Untereinheiten (M: muscle / B: brain) CK-MM: Skelettmuskulatur CK-BB: Gehirn (& Lunge, Gastrointestinaltrakt, Uterus, Prostata) CK-MB: Herzmuskel ein Anstieg von CK-MB im Blut auf einen Myokardinfarkt hinweisen kann. Herzinfarktmarker im Blut Verlauf wichtiger "Herzmarker" bei einem Herzinfarkt. Quelle: National Academy of Clinical Biochemistry. Isoenzym, Bsp.: PANK (Pantothenat-Kinase) Isoform Anz. Zell- Gewebetyp (Gen) Unterformen kompartiment PANK1α, PANK1 Zytosol Hirn, Herz, Nieren, Leber. PANK1β Mitochondrien & besonders Basal Ganglia & PANK2 4 Erythrozyten Erythrozyten PANK3 1 Zytosol Leber PANK4 1 Zytosol Ubiquitär, bes. Muskeln Mutation in PANK2 (PANK2) => PKAN (Pantothenat-Kinase assoziierte Neurodegeneration) Welche Prozesse verringern ΔG des Übergangszustands? 1. Säure‐ und Basenkatalyse 2. Kovalente Katalyse 1) Bringen Substrate mit katalytischen Gruppen, oder mehrere Substrate miteinander in Kontakt 3. Metallionenkatalyse 2) Binden Substrate in der richtigen Orientierung 4. Nachbargruppen‐ und Orientierungseffekte 3) Geladene Gruppen könne dabei helfen den Übergangszustand der Reaktion zu stabilisieren 5. Stabilisierung des Übergangszustandskomplexes 4) schränken die Rotationsbewegungen ihrer Substrate und katalytischen Gruppen ein (wichtig für den Übergangszustand) Katalyse-Mechanismen Säure-Basen Katalyse Aminosäurereste von beispielsweise Histidin oder Glutaminsäure reagieren als Säure oder Base, indem sie während einer Reaktion H+-Ionen aufnehmen oder abgeben → Protonentransfer stabilisiert den Übergangszustand. Kovalente Katalyse wird durch einen nucleophilen Angriff (nukleophile Substitution) des Enzyms am Substrat eingeleitet → Aminosäurereste (häufig Lysin) oder Coenzyme (Pyridoxalphosphat) gehen kovalente Bindungen mit einem Substrat ein und bilden ein kurzlebiges Zwischenprodukt. Metallionenkatalyse Die Anwesenheit eines Metall-Ions dient der Polarisierung bzw. Stabilisierung von Bindungen. Bei einigen Redoxreaktionen dienen Metall-Ionen als Elektronenüberträger. Sind z.B. strukturstabilisierende Koordinations- zentren (Zn), Redox-Partner (Fe, Cu) oder als Lewis-Säuren (Zn) der Katalyse. AS der allgemeinen Säure-Base-Katalyse Viele organische Reaktionen werden durch Protonendonatoren (allgemeine Säuren) oder Protonenakzeptoren (allgemeine Basen) beschleunigt. Die aktiven Zentren einiger Enzyme enthalten als funktionelle Gruppen Aminosäuregruppen, wie die hier gezeigten, die die als Protonendonatoren oder Protonenakzeptoren am katalytischen Prozess teilnehmen können. Nelson & Cox, Lehninger Biochemie Springer Verlag Säure-Basen Katalyse: Beispiel Lysozym Katalysiert die hydrolytische Spaltung (Hydrolase) gegen grampositiven Bakterien, indem es deren Zellwand zerstört. für die Abwehr bakterieller Infektionen. Spaltung der β-1,4-glykosidischen Bindungen zwischen der N-Acetyl-D-Muraminsäure und dem N-Acetyl-D-Glucosamin Vorkommen: im Speichel, Schweiß, Nasensekret, Tränenflüssigkeit, Ohrenschmalz, … Säure-Basen Katalyse (Bsp. Lysozym) Säure-Basen Katalyse (Bsp. Lysozym) Säure-Basen Katalyse (Bsp. Lysozym) – Säurekatalyse – kovalente Katalyse – Basenkatalyse Lehrbuch der Biochemie, D.Voet, J.G. Voet und C.W. Pratt, Wiley‐VCH Kovalente Katalyse Die Reaktionsgeschwindigkeit wird durch die vorübergehende Bildung eines kovalent gebundenen Zwischenproduktes erhöht → meistens durch die nucleophile Reaktion zwischen Katalysator und Substrat (nucleophile Katalyse). Die kovalente Katalyse kann theoretisch in mehrere Schritte aufgeteilt werden: 1. Zwischen Katalysator und Substrat findet eine nucleophile Reaktion statt, die zur Ausbildung einer kovalenten Bindung führt. 2. Es folgt die Entfernung der Elektronen aus dem Reaktionszentrum. 3. Durch eine Spaltung der kovalenten Bindung wird der Katalysator freigesetzt. Lehrbuch der Biochemie, D.Voet, J.G. Voet und C.W. Pratt, Wiley‐VCH Kovalente Säure-Base Katalyse (Aldolase) Im aktiven Zentrum greift die Aminogruppe der Lysinseitenkette die Carbonylgruppe von F-1,6-bP nucleophil an => kovalente Katalyse Cystein nimmt Proton auf & Histidin gibt Proton ab => Säure-Base Katalyse Nach einer Umverteilung der Elektronen im Reaktionszentrum wird das Enzym freigesetzt. Kovalente Katalyse: Beispiel: Decarboxylierung von Acetoacetat: 1. Nicht katalysierte Reaktion 2. Katalysierte Reaktion Kovalente Säure-Base Katalyse (Bsp. Trypsin od. Chymotrypsin) Berg et. al, Stryer Biochemie Springer Verlag Metallionen-Katalyse: Beispiel Carboanhydrase (1) An das Zink(II) Ion kann ein Molekül Wasser anlagern → pKs Wert des Wassermoleküls gesenkt → ein Proton abgespalten. (2) lagert sich ein Molekül Kohlenstoffdioxid im aktiven Zentrum des Enzyms so an, dass es mit dem Hydroxidion reagieren kann. (3) freien Elektronenpaare am Sauerstoff der OH-Gruppe greifen nukleophil das Kohlenstoffdioxidmolekül an, so dass ein Hydrogencarbonation entsteht. (4) Wassermolekül kann an das aktive Zentrum gebunden werden → Hydrogencarbonation wird freigesetzt. Berg et. al, Stryer Biochemie Springer Verlag Enzymkinetik Enzymkinetik Die Enzymkinetik beschreibt, wie schnell enzymkatalysierte Reaktionen verlaufen. Michaelis-Menten-Gleichung beschreibt die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit einer Enzymreaktion von der Konzentration des Substrats. E E ES EP S P E = Enzym, S = Substrat, [ES] = Enzym-Substrat-Komplex, [EP] = Enzym-Produkt-Komplex, Alberts, Lehrbuch der Molekularen P = Produkt, k = Geschwindigkeitskonstanten Zellbiologie © Wiley-VCH Enzymaktivität im Serum bestimmen 1. Schritt: Man setzt dem Serum, welches Enzym beinhaltet, Substrat zu. 2. Schritt: Nach einer bestimmten Zeit misst man, wie Produkt sich gebildet hat. 3. Schritt: Je mehr Enzym im Serum, desto mehr Substrat wird zu Produkt umgesetzt? Was bedeutet das für die Enzymbestimmungen im Serum? Da man bei der Untersuchung auf die Enzymmenge rückschließen will, muss in den Testansätzen zur Bestimmung von Enzymen im Serum immer ein Überschuss von Substrat vorhanden sein. Dann hängt die Reaktionsgeschwindigkeit und damit die gemessene Enzymaktivität tatsächlich nur mehr von der Enzymmenge ab. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist proportional zur Enzymkonzentration. Daneben müssen natürlich die übrigen Reaktionsbedingungen (vor allem Temperatur, pH-Wert), konstant gehalten werden. Messung der Enzymaktivität Temperatur, pH, Ionenmilieu …. möglichst gut kontrolliert Substratkonzentration …. möglichst hoch (Preis, Störungen) Inkubationszeit …. > 5-15 min (Handling, Temperaturäquilibrierung) < 30-120 min (Inaktivierung, …) Enzymmenge (bzw. Enzymverdünnung) Ziel: gut meßbares Ergebnis, aber im „v0-Fenster bleiben“ (Linearität) Ermittlung der Enzymverdünnung Ziel: Ermittlung einer Enzymverdünnung, um im linearen Messbereich des Photometers zu arbeiten Es soll eine Absorption erreicht werden, wo gemessene Werte linear und damit einigermaßen verlässlich reproduzierbar sind. Dieses Experiment ist sozusagen ein „Vor-Experiment“. Ziel ist eine Absorption zwischen ca. 0.3 – 0.6 Durchführung: 1. Enzymverdünnungen herstellen (in Puffer!) 2. Aktivitätsassays lt. Angabe / Protokoll 3. Absorptionen bei angegebener Wellenlänge messen 4. Ergebnisse Blindwert für jede Enzymverdünnung herstellen Wenn Enzym und Substrat sofort zusammen pipettiert werden, dauert es eine gewisse Zeit, bis beide die Reaktionstemperatur erreicht haben = „Lag-Phase => vermeiden indem die Lösungen getrennt voneinander vorgewärmt werden. Zeitabhängigkeitsexperiment (Variieren der Inkubationszeit) Ermittlung einer Inkubationszeit, um im linearen Aktivitätsbereich des Enzyms zu liegen Eine Vorbedingung, um Kinetikmessungen durchzuführen, ist die Arbeit im linearen Aktivitätsbereich des Enzyms. Enzym und Substrat werden bei verschiedenen Temperaturen aufbewahrt (Enzym: Eis, Substrat: RT). auf die Lagphase achten! a. 5 Minuten b. 10 Minuten c. 15 Minuten d. 20 Minuten Äquilibrium Methode – Harnsäuregehalt bestimmen Äquilibrium-Methode Der Harnsäuregehalt lässt sich im Enzymtest durch Photometrie unter Verwendung der Uricase und einer Absorption im Bereich von 290 nm messen. Harnsäure wird zu 5-Hydroxyisoharnsäure oxidiert (hydroxyliert). Man misst die Extinktion 2 Mal: Einmal den Ausgangswert vor Zugabe des Enzyms und nach Erreichen des Endwertes. Die Differenz zwischen Ausgangswert und Endwert (multipliziert mit einem entsprechenden Faktor) entspricht der Harnsäurekonzentration. Vorteile: Enzymmenge, pH, Reaktionstemperatur und selbst das Zeitintervall müssen nicht so genau sein, solange man sichre am Endwert angelangt ist). Nachteile: benötigt relativ große Enzymmenge, damit die Erreichung der Endwertes nicht zu lange dauert. Kinetische Methode – Harnsäuregehalt bestimmen Der Harnsäuregehalt lässt sich im Enzymtest durch Photometrie unter Verwendung der Uratoxidase und einer Kinetische Methode Absorption im Bereich von 290 nm messen. Harnsäure wird zu 5-Hydroxyisoharnsäure oxidiert (hydroxyliert). Kinetische Grundlage: Unter geeigneten Bedingungen ist die Geschwindigkeit, mit der das Substrat (z.B. die Harnsäure) abgebaut wird, proportional zur Menge vorhandenen Substrats. Man kann damit aus der Geschwindigkeit des Abbaus, also aus der Steilheit des Abfalls der Kurve, auf die Substratkonzentration schließen. Vorteile: schnelle und genaue Messung, nur geringe Enzymmengen notwendig Nachteile: Reaktionsbedingungen müssen unbedingt konstant gehalten werden. Einfluss der Substratkonzentration auf die Anfangsgeschwindigkeit Einfluss der Substratkonzentration auf die Anfangsgeschwindigkeit einer enzymkatalysierten Reaktion. Die max. Geschwindigkeit Vmax nur errechnet werden, da V0 sich Vmax nähert, es aber nie ganz erreicht. Die Substratkonzentration, bei der V0 das halbe Maximum erreicht, ist Km, die Michaelis Konstante. Die Enzymkonzentration in einem Experiment wie diesem ist im Allgemeinen sehr niedrig, dass [S] >> [E]. die Kurve stellt einen Teil einer rechteckigen Hyperbel dar, mit Vmax als Asymptote. Nelson & Cox, Lehninger Biochemie Springer Verlag Michaelis-Menten-Kinetik ES ↔ EP kann man nicht messen, das Entstehen von P aber sehr wohl in der Zelle im Fließgleichgewicht ~ keine Rückreaktion P + E → EP im Reagenzglas am Anfang nur E + S, kein P, daher ist zu diesem Zeitpunkt die Reaktion P + E→EP unbedeutend Michaelis Menten Gleichung Einfluss der Substratkonzentration auf die Anfangsgeschwindigkeit Jedes Enzym hat seine eigene Maximalgeschwindigkeit (Vmax) → mathematisch über Vmax/2 ermittelt. Daher hat jedes Enzym einen eigenen Km-Wert (=> Stichwort Isoenzyme). Enzyme haben bei einer bestimmten Temperatur, pH ihr Aktivitätsmaximum (Optimum)…. …sind außerdem abhängig von Ionenkonzentration (Metalloenzyme / Hydrathülle), Produkte, Substrate und Inhibitoren / Aktivatoren (Effektoren) haben ebenfalls Einfluss auf die Enzymaktivität … Michaelis Menten Kinetik - Einheiten Konstante Einheit Maß für Konz.-abhängig KM mol/l Affinität eines Enyzmmoleküls zum Substrat Nein Vmax mol/s Aktivität einer Enzymlösung bei Substratsättigung von [E]; [S] ist im Sättigungsbereich kkat 1/s maximale Aktivität eines gesättigten Enzymmoleküls nein Bei maximaler Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) ist eine Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit nur durch Zugabe von Enzym möglich (bei Substratsättigung). Die Michaeliskonstante KM ist ein Maß für die Affinität eines Enzyms zu seinem Substrat. Je kleiner der KM -Wert, desto höher die Affinität. Die Affinität (auch Bindungsaffinität) ist in der Biochemie ein Maß für die Neigung von Molekülen, mit anderen Molekülen eine Bindung einzugehen Enzymkinetik => Welche Erkenntnisse erhielten Forscher Michaelis und Menten in dieser Richtung? Frage: Erläutern Sie bitte den Begriff Enzymkinetik! Enzymkinetik beschreibt die Substrat- und Produktkonzentration während einer enzymatisch katalysierten Reaktion in Abhängigkeit von der Zeit. Dadurch lassen sich verschiedene Enzymaktivitäten miteinander vergleichen. Frage: Welche Erkenntnisse erhielten Forscher Michaelis und Menten in dieser Richtung? Die Michaelis-Menten-Gleichung beschreibt die Veränderungen der Reaktionsgeschwindigkeit eines Enzyms mit zunehmender Substratkonzentration. Merke: 1. Die Reaktion darf nur von einem Reaktionspartner abhängig sein. 2. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist ES → E+P. 3. Vmax ist nur dann möglich, wenn alle Enzymmoleküle vom Substrat besetzt sind. 4. In vivo gibt es keine Enzyme, die im Sättigungsbereich arbeiten. Ausnahme: Die Glukokinase nach Nahrungsaufnahme! Was können Sie mir zu Lineweaver und Burk berichten? Verdeutlichen Sie Ihre Ausführungen anhand einer Skizze! Zur Abbildung: Punkt (1) ist die Konzentration des Substrates geringer als die des Enzyms. Hier existieren noch relativ wenig Enzym- Substrat-Komplexe, die Reaktionsgeschw. ist entsprechend gering. Punkt (2) liegt die Hälfte der Enzymmoleküle in gebundener Form vor. Ein Zustand, bei dem das Enzym mit halber Maximalgeschwindigkeit arbeitet. Die Substratkonzentration an dieser Stelle wird als Michaeliskonstante (Km) bezeichnet. Sie ist ein Maß für die Affinität des Enzyms zum Substrat. Ist der Wert klein, so ist die Affinität groß und umgekehrt. Punkt (3) sind alle Enzymmoleküle mit Substratgesättigt, die Lineweaver und Burk verarbeiteten diese Erkenntnisse in ihrer Maximalgeschwindigkeit ist erreicht. Vmax Darstellung. Durch doppelt reziproke Auftragung der Michaelis- ist demnach ein Maß für die Menten-Gleichung, erreichten sie eine genauere Ablesemöglichkeit Arbeitskapazität des Enzyms. von Vmax und Km (Schnittpunkte statt Annäherungen!). Isoenzym, Bsp.: PANK (Pantothenat-Kinase) Isoform Anz. Zell- Gewebetyp (Gen) Unterformen kompartiment PANK1α, PANK1 Zytosol Hirn, Herz, Nieren, Leber. PANK1β Mitochondrien & besonders Basal Ganglia & PANK2 4 Erythrozyten Erythrozyten!! PANK3 1 Zytosol Leber PANK4 1 Zytosol Ubiquitär, bes. Muskeln Mutation in PANK2 (PANK2) => PKAN (Pantothenat-Kinase assoziierte Neurodegeneration) PKAN (Pantothenatkinase assoziierte Neurodegeneration) Mutationen des Pantothenatkinase (PANK2) kodierenden Gens auf dem Chromosom 20 Genort p13-p12.3 => autosomal rezessiv vererbt A – Acanthocyte B – Disocyte zwei Formen unterscheiden: Klassische Form, 75 %, Beginn meist vor dem 6. Lebensjahr und rasche Verschlechterung Atypische Form, 25 %, Beginn meist zwischen dem 13. und 14. Lebensjahr und langsamere Verschlechterung sehr seltene Erkrankung: 1-3 in einer Million (Dunkelziffer wohl höher) A – normales MRI B - Eisenablagerung PANK2 Aktivitäts Bestimmung bei PKAN Patienten PANK Aktivität-> lysierte Erythrozyten -> zytosolisches Protein radioaktiv gelabeltes 14C Phosphopantothenat wurde im Photometer bei 280nm gemessen 250 µg of extract were mixed with 11.25 µmol/L 14C labeled D-pantothenic acid, 2.5 mmol/L ATP, 10 mmol/L MgCl2 and 0.1 mol/L Tris/Cl pH = 7.5 at 37°C Regulierung der Enzymaktivität Hemmung der Enzymaktivität Bedeutung in der Medizin: Wirkung vieler Pharmaka – z.B. Aspirin als kompetitiver Hemmer Irreversible Hemmung ↔ Reversible Hemmung Produkthemmung ↔ Rückkopplung Drei charakteristische reversible Hemmtypen  kompetitive Hemmung  nicht-kompetitive Hemmung  Mischformen, z.B. unkompetitive Hemmung Irreversible Hemmung:  binden kovalent an die funktionelle Gruppe eines Enzyms oder zerstören diese. Regulatorischen Zentren am Enzym Umformungen der Michaelis-Menten-Gleichung: Der doppelt-reziproke Plot Die Michaelis-Menten-Gleichung können algebraisch in Gleichungen umgewandelt werden, die Gleichungen umgewandelt werden, die bei der Darstellung von Versuchsdaten nützlicher sind. Eine gängige Umformung wird einfach abgeleitet, indem man den Kehrwert der beiden Seiten der Michaelis-Menten-Gleichung Trennt man die Komponenten des Zählers auf der rechten Seite der Gleichung ergibt was sich vereinfacht zu Diese Form der Michaelis-Menten-Gleichung ist die Lineweaver-Burk-Gleichung Kompetitive Hemmung bei der Kompetitiven Hemmung bindet der kompetitive Inhibitor an das aktive Zentrum des Enzyms. Kompetitive Inhibitoren sind Substanzen, die mit dem Substrat um die Bindungsstelle im aktiven Zentrum des Enzyms konkurrieren. Sie werden nicht umgesetzt und können dadurch vom Substrat wieder verdrängt werden. Nelson & Cox, Lehninger Biochemie Springer Verlag Kompetitive Inhibitoren haben oft hohe Ähnlichkeit mit dem Substrat. KI ist die Gleichgewichtskonstante der Inhibitorbindung Kompetitive Hemmung – Lineweaver Burk Im Michaelis-Menten-Diagramm steigt die Hyperbel weniger stark an als bei der Reaktion ohne Inhibitor. Dieselbe Vmax kann erreicht werden, jedoch erst bei höherer Substratkonzentration, wenn die Substratmoleküle alle Inhibitormoleküle vom aktiven Zentrum verdrängt haben. Im Lineweaver-Burk-Diagramm bleibt 1/ Vmax – im Vergleich zur ungehemmten Reaktion unverändert. Der -1/ KM Wert – hat einen kleineren Betrag. KM ist somit größer als bei der ungehemmten Reaktion. Man spricht von der scheinbaren -1/KM -Erhöhung („scheinbar“, da KM für das Enzym an sich unverändert ist). Kompetitive Hemmung Kompetitive Hemmung: Maximalgeschwindigkeit bleibt gleich und der Km-Wert steigt! Nicht-kompetitive Hemmung Der Inhibitor bindet an einer Stelle des Enzyms, die nicht die Substrat-Bindungsstelle ist (→ Konformationsänderung) Inhibitor bindet an freies Enzym (EI) und an den ES-Komplex (EIS). Die nicht-kompetitive Hemmung betrifft Enzyme, welche neben dem aktiven Zentrum noch ein weiteres, allosterisches Zentrum besitzen. An dieses können nun, unabhängig davon, ob bereits Substrat Nelson & Cox, Lehninger Biochemie am aktiven Zentrum gebunden ist, reversible Bindungen von Springer Verlag Inhibitoren erfolgen. Die Affinität vom Enzym zum Substrat bleibt dabei unverändert. Durch die Hemmung der Reaktion ES → EP wird jedoch die maximale Reaktionsgeschwindigkeit negativ beeinflusst. Nicht-kompetitive Hemmung – Lineweaver Burk Im Michaelis-Menten-Diagramm ist Vmax erniedrigt: Auch eine noch so hohe Substratkonzentration kann die Wirkung des Inhibitors nicht ausschalten, da dieser nicht im aktiven Zentrum bindet und daher nicht verdrängt werden kann. KM bleibt unverändert. Im Lineweaver-Burk-Diagramm 1/ V max ist erhöht. -1/KM ist unverändert. Nicht-kompetitive Hemmung  PANK 2 – allosterische Regulation durch Acetyl-CoA & Palmitoylcarnitin Allosteric Regulation of Mammalian Pantothenate Kinase, Subramanian et al. , DOI 10.1074/jbc.M116.748061 Nicht-kompetitive Hemmung Aktivatoren oder Inhibitoren am allosterischen Zentrum von Enzymen werden in sog. K-Typ- und V-Typ-Effektoren eingeteilt. Dabei bezieht sich die Wirkung des K-Typs auf die Affinität des Enzyms zum Substrat (Km). Der V-Typ hingegen beeinflusst die maximale Reaktionsgeschwindigkeit. Unkompetitive Hemmung Inhibitor wird nur vom Enzym-Substrat-Komplex gebunden, nicht jedoch vom freien Enzym (→Konformationsänderung) Der Enzym-Produkt-Komplex wird verlangsamt gebildet. Nelson & Cox, Lehninger Biochemie Springer Verlag die Reaktion kann nur noch schwer umgesetzt werden kann. Unkompetitive Hemmung – Lineweaver Burk Michaelis-Menten-Diagramm: sowohl KM als auch Vmax werden verändert. Lineweaver Burk-Diagramm: sowohl KM als auch Vmax werden verändert. Reversible Hemmung Kompetitive Hemmung: Maximalgeschwindigkeit bleibt gleich, Km-Wert steigt! Nicht-kompetitive Hemmung: Maximalgeschwindigkeit sinkt, Km-Wert bleibt gleich! Unkompetitive Hemmung: sowohl KM als auch Vmax werden verändert. Reversible Enzymhemmung & pharmazeutische Wirkstoffe Bei zahlreichen pharmazeutischen Wirkstoffe handelt es sich um Enzyminhibitoren, unter anderem auch bei den nicht steroidalen Entzündungshemmern (NSAR) Beispiel reversibel: Ibuprofen, Diclofenac, Paracetamol; reversible Enzymhemmung & pharmazeutische Wirkstoffe einige Wirkstoffe unter den HIV-Medikamente CCR5-Antagonisten CCR5-Antagonisten haben antivirale gegen HI-Viren. Es handelt Fusionsinhibitoren sich um selektive Antagonisten der Interaktion zwischen gp120-Antagonisten humanem CCR5 und HIV-1 gp120. Dadurch wird der Eintritt der Reverse-Transkriptase-Inhibitoren Viren die Zellen verhindert. Integrase-Inhibitoren HIV-Proteasehemmer Irreversible Hemmung & pharmazeutische Wirkstoffe Acetysalicyl-Säure als Ausnahme der COX- Hemmung als irreversible Hemmung! Irreversible Hemmung Beispiel: „Vergiftung“ einer Esterase (z.B. Acetylcholinesterase) Organophosphor-Inhibitoren wirken auf Proteasen u. Esterasen: Insektizide (E605) Giftgase (DFP, Sarin, Tabun, VX* und Co.) Natürliche Inhibitoren (alfa1-Trypsininhibitor auf Elastase in Lunge) [COPD] Diisopropylfluorophosphat (DFP) wurde erstmals im zweiten Weltkrieg als Nervengift verwendet DFP - medizinische Verwendung in der Augenmedizin zur Therapie des Glaukoms (Grüner Star) als Inhibitor der Acetylcholinesterase bei biochemischen Tests Energie, Enzyme und Stoffwechsel © Springer Verlag irreversible Enzymhemmung & pharmazeutische Wirkstoffe Antibiotikum Penicillin behindert den Aufbau der Zellwand der Peptidoglykan Peptidoglykan Bakterienzellen→ Inhibierung des Enzyms D-Alanin-Transpeptidase hemmen bakterielle Zellwandsynthese durch Bindung an die sogenannten Penicillin-bindenden Proteine (PBP)→ D-Ala-D-Ala-Transpeptidase muss aufgrund der kurzen Halbwertszeit mehrmals täglich oder als Infusion verabreicht werden. Regulationsmechanismen von Enzymen Mechanismus Signal Ansprechzeit Selbstregulation Substratkonzentration Millisekunden Allosterische Hemmung Reaktionsprodukt Millisekunden Endprodukt (feed back) oder anderer Allosterische Hemmung Metabolit (crosstalk zwischen Millisekunden Stoffwechselwegen) Allosterische Aktivierung Ausgangsstoff (feed forward) Millisekunden Allosterische Modifikation (±) Regulator als Stoffwechselsignal Millisekunden Allosterische Modifikation (±) Interaktion zwischen Enzymen Millisekunden Interkonversion, Proteolyse Proteolytische Kaskade Sekunden bis Minuten Interkonversion, Phosphorylierung/ Phosphorylierungskaskade, allosterische Sekunden bis Minuten Dephosphorylierung Modifikation Aktivierung/Deaktivierung von Kontrolle der Genexpression Stunden Transkription oder Translation Totalabbau von Enzym Aktivierung der Ubiquitinierung Stunden  Allosterische Regulation: Endprodukthemmung Allosterische Regulation einer Endprodukthemmung: Hierbei entsteht mit dem Endprodukt (P)ein spezifischer Hemmstoff, der an das allosterische Zentrum des Enzyms ankoppelt. Sinnbildlich ragt er mit seiner „Spitze“ in das aktive Zentrum hinein und verhindert so über den Stopp einer weiteren Substratanlagerung die Umsetzung zu noch mehr Produkt. Energie, Enzyme und Stoffwechsel © Springer Verlag Die allosterische Hemmung ist eine reversible, nicht-kompetitive Enzymhemmung. Allosterische Regulation Allosterische Regulation: Endprodukthemmung Veränderungen der Michaelis-Menten- Gleichung: Allosterisch regulierte Enzyme weisen bei dieser Darstellung eine sigmoidale Kurve auf. Die Km-Werte sind für allosterisch regulierte Enzyme normalerweise signifikant höher. Allosterische Inhibitoren verschieben die Reaktion auf die rechte Seite der Kurve. Allosterische Aktivatoren verschieben die Reaktion auf die linke Seite der Kurve. Crashkurs: Vererbungslehre – autosomal (Stichwort PKAN) https://de.wikipedia.org/wiki Isoenzym, Bsp.: PANK (Pantothenat-Kinase) Isoform Anz. Zell- Gewebetyp (Gen) Unterformen kompartiment PANK1α, PANK1 Zytosol Hirn, Herz, Nieren, Leber. PANK1β Mitochondrien & besonders Basal Ganglia & PANK2 4 Erythrozyten Erythrozyten!! PANK3 1 Zytosol Leber PANK4 1 Zytosol Ubiquitär, bes. Muskeln Mutation in PANK2 (PANK2) => PKAN (Pantothenat-Kinase assoziierte Neurodegeneration) PANK2 Aktivitäts Bestimmung bei PKAN Patienten PANK Aktivität-> lysierte Erythrozyten -> zytosolisches Protein radioaktiv gelabeltes 14C Phosphopantothenat wurde im Photometer bei 280nm gemessen 250 µg of extract were mixed with 11.25 µmol/L 14C labeled D-pantothenic acid, 2.5 mmol/L ATP, 10 mmol/L MgCl2 and 0.1 mol/L Tris/Cl pH = 7.5 at 37°C  PANK 2 – allosterische Regulation durch Acetyl-CoA Werning, Maike et al. “PKAN neurodegeneration and residual PANK2 activities in patient erythrocytes.” Annals of clinical and translational neurology vol. 7,8 (2020): 1340-1351. doi:10.1002/acn3.51127 Allosterische Regulation: PANK2 Pantothenat (Vitamin B5) Mitochondriale Acy-CoA CoA Acyl-CoA / Acetyl-CoA Synthese Phospho-Lipide Myelin Synthese Membran Remodelling Neuron Leonardi R, Rock CO, Jackowski S, Zhang YM. Activation of human mitochondrial Figure modified from: Csanyi, Barbara & Papandreou, Apostolos & Whaler, Sam & Rahim, Ahad & Chong, pantothenate kinase 2 by palmitoylcarnitine. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; Kling & Kurian, Manju. (2015). Update in Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation: Advances in 104(5):1494-1499. doi:10.1073/pnas.0607621104 Molecular Diagnosis and Treatment Strategies. Journal of Pediatric Neurology. Kinetik allosterischer Enzyme in Anwesenheit positiver oder negativer Effektoren Die sinnvollste Einteilung der Effekte, die Aktivatoren oder Inhibitoren am allosterischen Zentrum von Enzymen auslösen können, erhält man bei der Betrachtung von sog. K-Typ- und V-Typ-Effektoren.  die Wirkung des K-Typs auf die Affinität des Enzyms zum Substrat (Km).  Der V-Typ hingegen beeinflusst die maximale Reaktionsgeschwindigkeit.  positiven Kooperativität Die Bindung von Substrat an eine Enzymuntereinheit führt zur Veränderung der Konformation einer benachbarten Untereinheit. => Freigabe einer vorher versteckten Substratbindungsstelle. Die Untereinheiten gehen von der t(tense)-Form in die r(relaxed)- Form über. Die Affinität des Enzyms zum Substrat wird also mit zunehmender Substratbindung größer. Energie, Enzyme und Stoffwechsel © Springer Verlag Positive Kooperativität am Beispiel des Hämoglobins Allosterische Effektoren (Aktivatoren und Inhibitoren) Energie, Enzyme und Stoffwechsel © Springer Verlag Regulation im Stoffwechsel Alberts, Lehrbuch der Molekularen Zellbiologie © Wiley-VCH Regulatorischen Zentren am Enzym Aktivitätsänderung von Proteinen durch Phosphorylierung Proteinphosphorylierung Ist ein häufig verwendetes Mittel zur Regulierung der Enzymaktivität. (A) Übertragung einer Phosphatgruppe von ATP auf eine Aminosäure·Seitenkette des Zielproteins → Proteinkinase. Dephosphorylierung katalysiert→ Proteinphosphatase. (B) Die Phosphorylierung eines Proteins durch eine Proteinkinase führt entweder zu einer Zunahme oder zu einer Abnahme der Proteinaktivltät. Der Effekt ist abhängig von der Phosphorylierungsstelle und von der Struktur des Proteins → Konformationsänderung Alberts, Lehrbuch der Molekularen Zellbiologie © Wiley-VCH Modifikationen, Beispiel Phosphorylierung Proteinphosphorylierung Ist ein häufig verwendetes Mittel zur Regulierung der Enzymaktivität. Beispiel: Pyruvatkinase sowie Pyruvatdehydrogenasekomplex (PDC) sind werden u.a. durch Phosphorylierung reguliert. https://med.libretexts.org/Bookshelves/Basic_Science/Cell_Bi Biochemie © Stryer ology_Genetics_and_Biochemistry_for_Pre-Clinical_Students Proteolytische Aktivierung von Proteinen Die Verdauungsenzyme Trypsin und Chymotrypsin werden als inaktive Vorläuferpeptide synthetisiert, die erst durch proteolytische Abspaltung eines Teils des Peptids aktiviert werden. Die proteolytische Aktivierung von Chymotrypsinogen erfolgt in zwei Schritten: 1. Spaltung des Chymotrypsinogens zwischen Arg15 und Ile16 (= π-Chymotrypsin) 2. Entfernen der Dipeptide Ser14-Arg15 und Thr147- Asn148 (= α-Chymotrypsin) Die drei Peptidketten, die das reife Chymotrypsin werden über zwei Disulfid-Brücken zusammengehalten (drei weitere Disulfid-Brücken sind intramolekular). Modifikationen, Beispiel Ubiquitinierung Totalabbau von Enzym → Signal durch die Aktivierung der Ubiquitinierung Nicht mehr benötigte, beschädigte oder in der Zelle fehlplatzierte Proteine werden modifiziert → Ubiquitin angehängt, um sie für den Abbau zu markieren Drei Enzyme katalysieren die Protein-Ubiquitinierung: Ubiquitin-aktivierenden Enzym (E1), Ubiquitin-konjugierenden Enzym (E2) und Ubiquitin-Ligase (E3). Das menschliche Genom kodiert zwei E1-Enzyme, etwa fünfzig E2-Enzyme und hunderte E3-Enzyme. Die Diversität dieser Enzyme und möglicher Kombinationen repräsentiert die große Bandbreite von Zielproteinen und regulierenden Mechanismen, an denen Ubiquitinierungsenzyme beteiligt sind. Die ubiquitinierten Proteine werden vom Proteasom erkannt und abgebaut. © Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie/Wiesner Modifikationen, Beispiel Ubiquitinierung Die Inaktivierung von E3-Enzymen durch Ubiquitinierung Erst wenn das richtige Zielprotein erkannt wird, schaltet das Enzym E3 von einer „Aus“ auf eine aktive „An“-Konformation um und stellt so sicher, dass Zielproteine nicht unkontrolliert ubiquitiniert und abgebaut werden. Die C2-Domäne verhindert die Ubiquitin-Übertragung vom E2- auf das E3-Enzym. Gleichzeitig beeinträchtigt die C2-Domäne die Bindung des ubiquitinierten Zielproteins an die HECT-Domäne und unterdrückt damit die Prozessivität der Ubiquitinierungsreaktion © Mari, S et. al, Structural and functional framework for the autoinhibition of Nedd4-family ubiquitin ligases Inhalte der Lehrveranstaltung Enzyme energetische Prinzipien der Enzymaktivität Mechanismen der Enzymaktivität Coenzyme Enzymkinetik Regulierung der Enzymaktivität mit Pathobiochemie Beispielen Stoffwechsel Crashkurs: Vererbungslehre Reaktionsketten energetische Grundlagen des Stoffwechsels Glykolyse Zitratzyklus Atmung - oxidative Phosphorylierung Gluconeogenese