Basi di Citometria - Immunofluorescenza (4) PDF

Corso Integrato: Basi Fisiopatologiche delle Malattie Insegnamento: Basi di Medicina di Laboratorio 1. Introduzione alla medicina di laboratorio. Diagnosi medica – Indagini di laboratorio. 2. Immunofenotipo – Citometria a flusso. 3. Emocromo: parametri eritrocitari, paramet...

Corso Integrato: Basi Fisiopatologiche delle Malattie Insegnamento: Basi di Medicina di Laboratorio 1. Introduzione alla medicina di laboratorio. Diagnosi medica – Indagini di laboratorio. 2. Immunofenotipo – Citometria a flusso. 3. Emocromo: parametri eritrocitari, parametri piastrinici, parametri leucocitari. 4. Analisi delle Proteine Sieriche – Protidogramma. 5. Esame delle Urine.  - Citofluorimetria - Studio del fenotipo linfocitario CD4 CD3 - Immunofenotipizzazione enumerare le popolazioni linfocitarie Le diverse popolazioni linfocitarie si identificano per mezzo di anticorpi monoclonali specifici per antigeni di superficie linfocitari, citoplasmatici o nucleari, coniugati con fluorocoromi Tutte le cellule esprimono una varietà di antigeni (marcatori) dipendenti dal tipo cellulare e dallo stadio differenziativo CD: CD (sigla dell'ingl. Cluster of Differentiation) Molecola di differenziamento situata sulla superficie cellulare dei linfociti (o di altre cellule), con la funzione di tradurre i segnali cellulari o riconoscere gli antigeni (o altre funzioni). - Ha una struttura biochimica definita - Identifica un particolare tipo cellulare o stadio differenziativo - È riconosciuto da un gruppo di anticorpi monoclonali specifici CD3 CD4 Gli antigeni espressi in maniera esclusiva o in combinazioni caratterisiche consentono l’identificazione degli «Stipiti Cellulari» Ematopoietici e dei diversi stadi di differenziazione Cellule immunitarie nel sangue periferico  PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) Cell 2015 161, 387-403DOI: (10.1016/j.cell.2015.02.046) Copyright © 2015 Elsevier Inc. Terms and Conditions  Stipite linfoide: frequenze nel sangue dei CD19+ Linfociti T, B, NK 56+ T 55-84 % CD4+ 50% CD8+ 25% CD4+/CD8+ Ratio =/> 1 B 5-17 % NK 5-15 % La tipizzazione delle cellule ematopoietiche può essere eseguita su campioni biologici provenienti da vari compartimenti: Sangue periferico Midollo osseo Liquido cefalorachidiano Liquido pleurico Liquido pericardico Liquido ascitico Broncolavaggio alveolare Tessuto solido dopo allestimento di una sospensione cellulare monodispersa (milza, linfonodi, timo) Proporzioni delle popolazioni linfocitarie in alcuni tessuti linfoidi Immunofluorescenza = identificazione di un antigene (espresso da una cellula, tessuto) mediante un anticorpo specifico legato ad una sonda fluorescente – Immunofluorescenza Diretta: Le cellule vengono marcate con un anticorpo coniugato ad un fluorocromo – Immunofluorescenza Indiretta: Le cellule vengono marcate con un anticorpo non coniugato seguito da un anticorpo secondario coniugato con il fluorocromo  IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA a uno, due, N colori One antibody + Two antibodies  Immunofluorescenza Diretta + Indiretta + +  Fluorescenza E’ la caratteristica che hanno alcune sostanze che se sono colpite da una radiazione luminosa di definita lunghezza d’onda ne emetteno un’altra a lunghezza d’onda maggiore.  Fluorocromi o Fluorofori Sono sonde molecolari che, eccitate da una radiazione luminosa ad una lunghezza d’onda, emettono ad una lunghezza d’onda superiore. Ogni fluorocromo ha spettri di eccitazione e di emissione caratteristici. Utilizzando più fluorocromi per analisi multi-parametriche, le loro emissioni devono essere sufficientemente distanti tra loro per potere essere distinte. Gli spettri di eccitazione ed emissione di alcuni fluorocromi  Fluorescenza EMISSION EXCITATION Fluorochrome cell  Esecuzione del test di Immunofluorescenza indiretta Sospensione cellulare Lettura al microscopio a fluorescenza: Citometria statica Per misurare l’immunofluorescenza : MICROSCOPIO a Fluorescenza  Per misurare l’immunofluorescenza : La Citofluorimetria a flusso : Tecnologia che consente la misura multiparametrica di sospensioni cellulari monodisperse mentre fluiscono all’interno di un flusso che interseca una sorgente luminosa Qualunque sospensione corpuscolata può essere analizzata in cifluorimetria: le applicazioni vanno dall’immunologia, all’oncologia, alla citogenetica etc..  La sorgente luminosa, il laser, interseca le cellule colorate con fluorocromi L’emissione di fluorescenza viene rilevata da un sistema rilevatore Laser Il principio su cui si fonda l’analisi citofluorimetrica: CELLULA SEGNALE LUMINOSO SEGNALE ELETTRONICO SEGNALE DIGITALE Il citofluorimetro a flusso Il citofluorimetro a flusso (NEW)  IL Citofluorimetro a flusso Elettronica Light detectors FL3 PerCP Fluidica FL2 PE Computer FL1 FITC Sorgente SSC luminosa Laser FSC 488nm  Un citofluorimetro a flusso è costituito da: Sistema fluidico per il trasporto del campione e la sua focalizzazione idrodinamica Sistema di eccitazione sorgente di luce monocromatica (laser) Sistema di rilevazione dei segnali luminosi (lenti, filtri, specchi dicroici, fotomoltiplicatori) Sistema elettronico per la trasformazione del segnale luminoso in segnale elettronico e digitale Computer per elaborazione dei dati digitali  La focalizzazione idrodinamica: le cellule si allineano singolarmente al centro del flusso (stream) Le misure avvengono su cellula singola  Focalizzazione Idrodinamica Flusso della guaina Flusso Flusso della della guaina Flusso del guaina Flusso del campione campione Le cellule si dispongono in fila le une dietro le altre spinte verso la camera di conta  L’interazione del fascio di luce con la cellula dà luogo a fenomeni di: LIGHT SCATTERING  Light Scattering I due segnali che permettono di identificare le caratteristiche morfologiche delle popolazioni cellulari sono : FSC (Forward scatter o scatter diretto) misura un segnale legato alla diffrazione (scatter) ed è relativo al diametro cellulare (grandezza); SSC (Side scatter o scatter a 90°) misura un segnale legato alla riflessione ed alla rifrazione ed è relativo alla complessità e granularità cellulare.  Emissione del segnale luminoso: Light Scattering Laser FSC Sensor Scatter diretto SSC Sensor Scatter a 90° L’interazione del raggio laser con la cellula produce segnali di FLUORESCENZA : Granulocita Linfocita Monocita  Rappresentazione grafica dei segnali : Conversione elettronica dei segnali luminosi e generazione di istogrammi /citogrammi L’istogramma è la rappresentazione grafica di una singola distribuzione (un segnale di fluorescenza) Il citogramma di dispersione a puntini (dot plot) è la rappresentazione grafica di due distribuzioni (due segnali di fluorescenza).  Rappresentazioni grafiche in citofluorimetria: Istogramma ad un parametro e a due parametri One Parameter Histogram Two Parameter Histogram regione regione della Green Fluorescence Intensity della singola doppia fluorescenza fluorescenza Unstained cells verde verde e rossa Number of Cells FITC-labeled cells regione regione della singola regione negativa fluorescenza negativa rossa Green Fluorescence Intensity Red Fluorescence Intensity negativa Istogramma : rappresentazione di un parametro di fluorescenza Numero eventi positiva Intensità di fluorescenza Con cellule non fluorescenti negativa Numero eventi positiva Con cellule fluorescenti Intensità di fluorescenza  Citogrammi a due parametri di fluorescenza Green Fluorescence Intensity Green Fluorescence Intensity Regione Regione positiva per positiva per singola fluorescenza fluorescenza verde e rossa verde Regione positiva per singola Regione fluorescenza negativa rossa Red Fluorescence Intensity Red Fluorescence Intensity Green Fluorescence Intensity Green Fluorescence Intensity Red Fluorescence Intensity Red Fluorescence Intensity Density plot/histogram Dot plot  Rappresentazione dei segnali di fluorescenza a uno o due colori un anticorpo + Istogramma due anticorpi anticorpo 100 101 102 103 104 CD8 FITC anticorpo Tipi di citogrammi a due parametri (morfologici FSC e SSC) Dot plot Contour plot Pseudocolor plot si evidenziano gli si evidenziano gli si evidenziano gli “eventi” “eventi” come singoli “eventi” come linee come singoli punti e il punti concentriche colore cambia a seconda del numero di eventi con le stesse caratteristiche (densità) Dal prelievo all’analisi dei subsets linfocitari The blood as a window for global immune system  Gating immunologico con CD45 Leucociti identificati in base ai parametri morfologici granulociti Leucociti identificati in monociti base alla densità del CD45 linfociti e alla granularità (SSC) 0 200 400 600 800 1000 FSC-Height 1000 800 granulociti side scatter 600 SSC-H 400 monociti 200 17.3 linfociti 0 100 101 102 103 104 FL3-H: CD45-PerCP CD45 Analisi delle popolazioni e sottopopolazioni nell’ambito del gate linfocitario CD19 CD4 CD3 CD3 CD16/56 CD8 CD3 CD3  Analisi Citofluorimetrica dei LINFOCITI T CD4+ e CD8+ confronto tra soggetto normale e paziente con infezione da HIV CD4+ CD4+ CD8+ CD8+  Qualunque sospensione corpuscolata può essere analizzata in citofluorimetria le applicazioni in ambito biomedico: immunologia, oncologia, citogenetica etc.. L’immunofenotipizzazione e la citofluorimetria sono applicabili in differenti ambiti