Trasposto Attraverso Membrane PDF

biologia - Prof. Biasin - Lezione n. 02 TRASPORTO ATTRAVERSO LE MEMBRANE data 02/10/2024 | sbobinatori: Sara Maria Brambilla fino a pag , Ilaria Greco a seguire Diversi esperimenti hanno consentito di verificare come vengono regolati i trasporti attraverso...

biologia - Prof. Biasin - Lezione n. 02 TRASPORTO ATTRAVERSO LE MEMBRANE data 02/10/2024 | sbobinatori: Sara Maria Brambilla fino a pag , Ilaria Greco a seguire Diversi esperimenti hanno consentito di verificare come vengono regolati i trasporti attraverso le membrane plasmatiche. In particolare, costruendo membrane in laboratorio, e facendo assemblare la componente lipidica, cioè in assenza di proteine di membrana, si è verificato che le membrane non permettono il passaggio della maggior parte dei soluti. Al contrario, se nelle membrane ci sono proteine di trasporto, si osserva che molti soluti vengono aggiunti al sistema cellulare in vitro, cioè penetrano la membrana. Ciò conferma che le proteine garantiscono il trasporto transmembrana. Questo ci fa arrivare ad un’importante considerazione: il bilayer lipidico è praticamente impermeabile alle molecole idrofile. In realtà se si lascia qualsiasi sostanza a contatto con le membrane lipidiche, in un sistema in equilibrio, col passare del tempo, anche le sostanze idrofile riescono a penetrare, per via della fluidità della membrana. La cellula, tuttavia, ha bisogno di determinati soluti molto velocemente, per questo nel corso dell’evoluzione si sono integrate proteine in grado di accelerare il passaggio delle sostanze. Rispetto alla velocità di ingresso delle diverse sostanze nella membrana plasmatica, si distinguono diverse categorie, che in funzione delle loro proprietà chimiche e delle loro dimensioni possono diffondere più o meno velocemente. Transitano nel bilayer lipidico, in assenza di proteine di trasporto: GAS (O2 , CO2, N2) Piccole molecole non cariche (glicerolo, etanolo) Molecole lipofile (ormoni steroidei) NON transitano nel bilayer (se non con tempi di attesa lunghissimi) tutte le altre molecole, cioè: molecole polari non cariche grosse molecole polari cariche (amminoacidi, glucosio, nucleotidi) Ioni (H+, Na+ , HCO3- , K+ , Ca ++, Cl- , Mg ++ ) Proprio per questo sono necessarie una serie di proteine che coadiuvano questo transito. In funzione di questo si distinguono diversi tipi di trasporto: quello passivo e quello attivo. TRASPORTO PASSIVO Esso non richiede energia, fanno parte di esso la diffusione semplice e la diffusione facilitata.  DIFFUSIONE SEMPLICE: transizione di sostanze direttamente attraverso il bilayer fosfolipidico. Tipica di gas, acidi grassi, lipidi, alcuni ormoni. Essa dipende da: - Diametro - Temperatura - Solubilità dei lipidi - Concentrazione della sostanza (N.B. è il fattore più importante: ciascuna sostanza si muove seguendo il proprio gradiente di concentrazione) DIFFUSIONE FACILITATA Essa richiede la presenza di una proteina, che agevola il passaggio di una sostanza attraverso membrana plasmatica, ma NON energia. La sostanza sfrutta la proteina per passare attraverso il bilayer fosfolipidico, poiché da sola non riuscirebbe ad attraversare la barriera lipofila. la sostanza segue il gradiente elettrochimico. CLASSI DI PROTEINE DI TRASPORTO (nell’ambito della diffusione facilitata) 1. Canali ionici o permeasi 2. Trasportatori o Carrier CANALI IONICI Essi sono adibiti al trasporto di ioni (carichi positivamente o negativamente) vengono definiti canali ionici. I canali possono essere aperti o chiusi, la loro apertura è determinata da una serie di eventi. Gli ioni non prendono contatto con le proteine di trasporto, ma fluiscono (cioè entrano o escono). I canali ionici fungono, dunque, da “galleria”. Essi sono selettivi, pur non prendendo contatto con lo ione, infatti, esistono canali diversi per ioni diversi (Ca, Na, K) Una volta che il canale è aperto può transitare solo il soluto con le stesse dimensioni dello ione La sua apertura o chiusura è condizionata da diversi eventi: 1. Cambiamento voltaggio di membrana 2. Interazione con un altro ligando do che si lega alla struttura del canale (all’interno o all’esterno) e l’interazione fa cambiare la forma, sia a livello intra che extra cellulare 3. Sistema meccanico di trazione: dopo l’arrivo di uno stimolo, il citoscheletro tira il canale per far sbloccare la sua chiusura. I canali ionici sono molto conservati dal punto di vista filogenetico (una proteina si considera conservata dal punto di vista filogenetico se nel corso dell’evoluzione non ha cambiato forma, quindi, ad esempio, i canali ionici umani sono uguali a quelli di un verme). La natura non ha trovato spazio per cambiare in maniera evidente la struttura di questi canali ionici, perché i tentativi da essa svolti sono risultati incompatibili con la vita. Quando una proteina è fondamentale per il mantenimento della vita cellulare, infatti, anche piccolissime mutazioni (ad esempio l’aumento della sua portata) la renderebbero incompatibile con la vita. Il sistema dei canali ionici è rapidissimo: consentono il passaggio di oltre un milione di ioni al secondo, la cellula reagisce prontamente a un determinato stimolo.  TRASPORTATORI: sono adibiti al trasporto di soluti Al contrario dei canali, i trasportatori o carrier hanno un sito di legame per la sostanza da trasferire, non è semplicemente una molecola che garantisce un passaggio, (come per i canali ionici) La sostanza che dev’essere veicolata prende contatto con la proteina il carrier cambia conformazione, a causa del contatto con il soluto il cambiamento conformazionale consente alla sostanza trasportata di essere trasferita dall’ altra parte della cellula. Si tratta di un sistema simile a quello chiave-serratura È un trasporto molto più lento dei canali ionici. SPECIFICITA’ DELLE PROTEINE Ogni cellula ha un suo set di proteine di trasporto, alcune sono condivise da più cellule (come i canali del sodio, del cloro, del calcio) mentre altre proteine sono specifiche di un determinato tipo cellulare e un determinato organulo: ad esempio a livello dei lisosomi sono presenti dei canali che permettono il transito dello ione idrogeno dal citoplasma all’interno del lisosoma; oppure sulla membrana interna dei mitocondri ci sono proteine di trasporto che consentono l’accesso al piruvato. Esse sono proteine presenti in maniera specifica su alcune cellule o su alcuni organuli. Questa informazione viene sfruttata in ambito farmaceutico: se si vuole aumentare o inibire il trasporto di una determinata sostanza all’ interno di una cellula, si usano alcuni farmaci che mimano la struttura molecolare di quella sostanza per inibirne il trasporto, o al contrario esistono sostanze che agiscono da antagoniste. Il funzionamento di un recettore non è dettato soltanto dall’ interazione con la molecola, ma c’ è anche un meccanismo di regolazione. COME SI SPOSTANO GLI IONI Acquisiamo alcune informazioni fondamentali. Ovviamente gli ioni seguono il loro gradiente elettrochimico, ma questi spostamenti non sono per nulla casuali, in particolare ogni ione ha un procedimento stabilito: lo ione positivo che è più concentrato a livello extracellulare è il sodio, che ha una concentrazione di circa 145 millimolare, infatti nello spazio intracellulare la concentrazione è molto più bassa, 5-15 millimole. Al contrario, lo ione positivo, che è più concentrato a livello intracellulare è il potassio, che a differenza del cloro è meno concentrato nello spazio extracellulare. Ovviamente, la cellula per non essere sottoposta a cariche elettriche, cerca di bilanciare a livello extracellulare con la presenza di ioni cloro, che cercano di compensare gli ioni sodio, mentre a livello intracellulare sono presenti molecole, come alcuni amminoacidi che essendo carichi negativamente, controbilanciano le cariche positive del potassio. Ovviamente questi squilibri di carica generano un potenziale elettrico di membrana. A questi squilibri partecipano anche le proteine? Contribuiscono anche le proteine, perchè alimentano il trasporto di sostanze che a loro volta condiziona il trasferimento degli ion e le sostanze che sfruttano il gradiente di concentrazione delle cariche per garantirne l’equilibrio. EQUILIBRIO DINAMICO DELLA CELLULA Dunque la cellula cerca di mantenere un equilibrio, che però, non è perfettamente bilanciato, infatti si definisce equilibrio uno stato cellulare in assenza di stimoli. Nonostante ciò quando si parla di equilibrio cellulare si parla di equilibrio dinamico, non esiste nessuna cellula che sta ferma con le sue cariche ben disposte al di sopra e al di sotto della membrana plasmatica. Nell’equilibrio dinamico le cariche continuano a muoversi dall’ambiente interno all’ambiente esterno, infatti la cellula non è mai a riposo, ma lavora sempre per mantenere una stabilità e per assicurarsi che nulla sfugga al suo controllo. In assenza di stimoli specifici lo scambio è bilanciato e la differenza di voltaggio di membrana è stabile, ma non uguale a zero. Nello specifico nelle cellule animali è pari a -20 - -200mV, questo perchè c’è un leggero aumento delle cariche negative all’interno della membrana cellulare (a livello citoplasmatico). È questo mantenimento di questo leggero squilibrio è fondamentale per garantire alla celllula una risorsa per veicolare il trasporto delle sostanze attraverso la membrana plasmatica. Questo avviene perchè le sostanze seguono il gradiente elettrochimico, quindi si muovono dalla zona a maggior concentrazione fino a quella con minor concentrazione, ma nello stesso tempo il loro trasferimento è anche condizionato dalla presenza dei potenziali di membrana, ovvero dalla carica che queste sostanze possono avere. Quindi sono presenti due forze che agiscono contemporaneamente condizionando il trasferimento delle molecole attraverso la membrana plasmatica nella diffusione semplice: una è il gradiente di concentrazione, l’altra il potenziale membrana. Ci sono sostanze come il sodio in cui il gradiente elettrochimico e il voltaggio vanno nella stessa direzione: infatti il sodio per il suo gradiente di concentrazione, tende a fluire verso l’interno, la sua carica è positiva, quindi secondo il suo gradiente elettrochimico, si sposterà verso l’ambiente citoplasmatico. Proprio perchè le due forze vanno nella stessa direzione il flusso del sodio è molto veloce. Al contrario, il potassio, secondo il suo gradiente di concentrazione tende a muoversi all’esterno, ma dato che è carico positivamente deve andare contro il suo gradiente elettrochimico. Per questo, dato che le forse non vanno nella stessa direzione, hanno un flusso molto più debole rispetto a quello del sodio. In generale nella diffusione facilitata, queste sono le due forze che condizionano lo spostamento di una sostanza e la somma di queste due stabilisce la sua velocità. TRASPORTO DEL GLUCOSIO Oltre ai canali ionici, possono essere presenti dei trasformatori che possono coordinare il trasferimento di sostanza, che si muove seguendo il suo gradiente di concentrazione. Il caso più noto è quello del trasporto del glucosio: quando si assumono zuccheri, la concentrazione di zucchero nel sangue tende ad aumentare, questo determina il rilascio di insulina che lega il recettore a livello della membrana plasmatica e determina l’invio di segnali a livello intracellulare che agiscono su vescicole intracellulare, in cui sono accumulati i cosiddetti trasportatori del glucosio. In risposta a questa trasduzione del segnale le vescicole vanno a fondersi con la membrana plasmatica, i trasportatori del glucosio presenti sulle vescicole vengono esposti sulla membrana della celluala e questo garantisce l’interazione con le molecole di glucosio presenti nel sangue. Di conseguenza questi canali si aprono e il glucosio viene trasferito a livello citoplasmatico per poi essere metabolizzato. Il trasporto di glucosio è un sistema di diffusione facilitata. In assenza di zuccheri, invece, l’insulina non riesce ad inviare il segnale e I trasportatori del glucosio rimangono incastrati nelle vescicole che sono presenti all’interno del citoplasma cellulare. TRASPORTO ATTIVO Il trasporto attivo richiede al sistema una fonte di energia, perchè non tutte le sostanze seguono il proprio gradiente di concentrazione e la cellula per poterle assumere, deve spendere energia. In questo caso al sistema di trasporto, ai carrier viene associata una pompa in grado di fornire energia, che alimenta il movimento di una determinata sostanza contro il gradiente di concentrazione. Anche in questo caso il trasporto: Ha direzione unidirezionale La velocità presenta una cinetica di saturazione Il trasporto è specifico, per cui ogni sostanza è trasportata da una proteina diversa Risente di un sistema di inibizione competitiva da parte dei composti con analogia strutturale alla sostanza trasportata L’energia nel trasporto attivo può essere fornita in due modi fondamentali: Trasporto attivo diretto La pompa viene direttamente associata alla proteina che fornisce energia, quindi al carrier è associato un sistema che permette di legare adenosinatrifosfato (ATP) liberare il gruppo fosfato e sfruttare quell’energia per garantire il trasferimento della sostanza verso l’ambiente extracellulare. Il gruppo fosfato che libera energia viene liberato in un sito specifico del carrier, perchè il legame di unn gruppo fosfato ad una proteina comporta la sua polarizzazione che determina il suo cambiamento di formazione. La forma della proteina dipende dall’entità cariche presenti nella sequenza. In generale la struttura tridimensionale che qualsiasi proteina va ad assumere dipende dalla distribuzione delle cariche presenti nella sua sequenza. Quindi, in generale, quando la cellula sfrutta il trasferimento di cariche per regolare le modificazioni conformazionali delle proteine e scatenare una risposta. Ogni proteina ha una forma correlata allo svolgimento di una funzione, quindi nel momento in cui cambia forma cambia anche la sua funzione. In questo caso specifico, libero energia prendo il gruppo fosfato, lo lego alla proteina, questa cambia forma e il risultato finale è l’apertura del mio canale verso il lato opposto della membrana. Trasporto attivo indiretto Il sistema indiretto si basa su trasportatori accoppiati, perchè in questi viene collegato lo spostamento contro il gradiente di soluto al trasporto di una seconda sostanza che segue invece il gradiente di concentrazione. Nel momento in cui una sostanza si muove secondo gradiente di concentrazione questa fornisce energia che viene sfruttata indirettamente dalla sostanza che si muove contro gradiente di concentrazione. Nell’ambito dei trasportatori indiretti si distinguono: Sistemi a simporto, dove la sostanza che va contro il proprio gradiente di concentrazione e quell ache va secondo gradiente vanno nella stessa direzione Sistemi ad antiporto, nel caso in cui le due sostanze si muovono in direzioni opposte Sistema Uniporto, quando si considera una sola sostanza che passa verso I meccanismi di trasporto La pompa sodio potassio La pompa sodio potassio è un esempio di trasporto attivo e diretto. Questa pompa si comporta da antiporto, infatti, permette di trasportare contro gradiente di concentrazione tre ioni Na+ verso l’ambiente extracellulare e due ioni K+ verso l’ambiente intracellulare. Le sue funzioni principali sono: Elettrogenico, ovvero che mantiene il potenziale di membrana Mantenimento dell’equilibrio osmotico Correlazione al trasporto attivo indiretto di glucidi e amminoacidi Nello specifico, il sodio ha livello intracellulare riconosce questa pompa e si lega. La pompa è associata ad una ATPfosforilasi, quindi questo trasportatore è in grado di legare adenosinatrifosfato e liberare il gruppo fosfato che si lega a livello citoplasmatico. Questo determina un cambiamento conformazionale del trasportatore e il rilascio del sodio nell’ambiente extracellulare. C’è un dispendio energetico, perchè va contro gradiente di concentrazione. Mentre la pompa butta fuori sodio, contemporaneamente può legare dalla parte opposta ioni potassio, che si legano nell’ambiente extracellulare, provocano un cambiamento conformazionale che porta la dissociazione del gruppo fosfato dalla pompa. Il potassio segue il suo gradiente di concentrazione e si porta a livello intracellulare. In questo ciclo escono tre ioni sodio ed entrano due ioni potassio. Questa pompa funziona continuamente nelle nostre celluale, perchè fornisce indirettamente un sistema per alimentare energicamente il gradiente elettrochimico. IL CITOPLASMA (Sbobina 2023) Tutto ciò che è all’interno della membrana plasmatica viene definito citoplasma. Nel citoplasma si distinguono: il citosol: una parte fluida in cui sono sospesi gli enzimi e dove passano i filamenti del citoscheletro, nel quale sono sospese tutte le molecole solubili della nostra cellula tutti gli organuli cellulari, i quali sono strutture delimitate da membrana Per capire come sono fatti questi organuli cellulari, dal punto di vista morfologico e dal punto di vista funzionale, è stato necessario riuscire a isolarli, per poter capire cosa fanno, quali enzimi contengono, come lavorano, come interagiscono tra di loro, ed è stato necessario mettere a punto delle tecniche che consentissero di isolare gli organuli presenti all’interno della cellula. Oggigiorno in laboratorio adottiamo diverse tecniche che garantiscono il frazionamento cellulare. LA CENTRIFUGAZIONE La tecnica principale è quella della centrifugazione differenziale, che è stata messa a punto da Svedberg dal 1920 al 1940, il quale ha messo a punto la ultracentrifuga, una centrifuga che ha una superpotenza grazie alla quale si riesce ad avere un frazionamento cellulare. Si prende un tessuto di interesse; con un minipimer si frazionano le cellule, in questo modo le cellule rilasciano il loro contenuto e i loro organuli all’interno di una sospensione, e la provetta che contiene questa sospensione viene messa in una centrifuga. Si applica una forza centrifuga in un determinato periodo di tempo, e le diverse porzioni (i diversi organuli) della cellula si separano e precipitano all’interno della provetta in funzione della loro dimensione e della loro densità. Inizialmente precipiteranno le particelle più grosse, ovvero la porzione dei nuclei, dopodiché recupero il surnatante, applico una forza di centrifugazione superiore per un tempo superiore, e questo permette di far sedimentare le particelle che hanno dimensioni e densità leggermente ridotta, per esempio i mitocondri. Poi applico un’ulteriore forza centrifuga, e cresce sia la forza sia il tempo di centrifugazione, e questo permette di far sedimentare progressivamente tutti gli organuli presenti nelle cellule. A ogni organulo è stato assegnato un coefficiente di sedimentazione indicato dalla lettera S , in onore di Svedberg, colui che ha messo a punto questa tecnica. Una volta isolati i diversi organuli, questi possono essere studiati e vivisezionati per capire esattamente come sono fatti, cosa c’è dentro e come interagiscono con il resto della cellula. Un’alternativa alla centrifugazione differenziale è la centrifugazione in gradiente di densità: in questo caso si utilizza un gradiente in un solvente che è costituito da una concentrazione crescente di soluto dall’alto verso il basso. Al di sopra di questa soluzione si appoggia la miscela di cellule frazionate contenute nel minipimer e poi si applica una forza centrifuga. Quello che succede è che diverse particelle cellulari si dispongono all’interno di questo gradiente di densità in funzione della propria densità, e questo permette di separare le diverse frazioni isolando il surnatante. Questa tecnica è usata in laboratorio anche per isolare le cellule nel sangue. Il sangue si deposita al di sotto del gradiente di densità (in questo caso Ficoll), si applica una forza centrifuga, e le cellule che sono presenti nel sangue si dispongono in questo gradiente di densità. Per cui granulociti ed eritrociti precipitano sul fondo, linfociti, monociti e piastrine (ovvero le cellule che ci interessa studiare) si dispongono sopra il gradiente di densità; dopodichè si recuperano e si studiano. Quindi la centrifugazione in gradiente di densità serve sia nel microscopico per isolare organuli cellulari sia per separare diverse popolazioni cellulari, tutto sta nella forza centrifuga che viene applicata. IL NUCLEO Il nucleo è la centrale operativa della cellula ed è la struttura nella quale è presente il nostro genoma. Nella cellula eucariotica umana sono presenti 46 cromosomi, ovvero 46 molecole di DNA. Il nucleo ha la funzione di contenere il DNA: questo è un ruolo importantissimo, perchè se succede qualsiasi cosa al nostro patrimonio genetico, il rischio è di mandare la cellula in tilt, se non addirittura l’intero organismo. Il nucleo, per difendere adeguatamente il patrimonio genetico della cellula, è circondato da due membrane, una esterna e una interna. Lo spazio compreso tra le due membrane è definito spazio perinucleare (20-40 nm). PORI NUCLEARI La membrana nucleare presenta circa 3/4mila pori nucleari (circa 10-20 pori per micron quadrato di superficie). È un numero elevatissimo, questo perché ogni minuto attraverso ogni poro nucleare devono transitare circa: 60.000 molecole di proteine 20-250 molecole di mRNA 10-20 subunità ribosomiali 1000 tRNA 100 molecole di istoni Il flusso è bidirezionale (c’è chi entra, c’è chi esce) e tutto avviene in maniera ordinata. I pori nucleari hanno un’organizzazione molto precisa. Si parla di complesso del poro nucleare (NPC), il quale ha una struttura ad anello con simmetria ottagonale. Ogni complesso del poro nucleare è formato da circa 1000 molecole, le quali fanno parte di una famiglia di proteine che si chiama nucleoporine e sono complessivamente 30: più unità di nucleoporina si ripetono all’interno del canale. Una classe molto importante di nucleoporine sono le nucleoporine FG (fenilalanina-glicina), le quali sono molto ricche di questi due amminoacidi, e grazie a questi riescono a formare una struttura ramificata che sporge verso il citoplasma e all’interno del poro formando una sorte di griglia che filtra le sostanze che devono passare. Queste FG hanno la funzione di ancoraggio per le diverse molecole che transitano e di filtro, selezionando quello che può e non può passare. Isolando i nuclei tramite il sistema di centrifugazione visto prima e mettendo a contatto con questi nuclei delle molecole con pesi molecolari diversi (MW=molecular Weight, peso molecolare), si è visto che sostanze con peso molecolare diverso transitano con una diversa velocità. Le sostanze che hanno peso molecolare al di sotto dei 5000 Da diffondono liberamente; man mano che il peso molecolare aumenta, la velocità di diffusione si riduce e le molecole che hanno peso molecolare uguale o superiore a 60.000 Da non si possono muovere per diffusione; quindi, non possono transitare attraverso i pori nucleari. Questo rappresenta un grosso problema, perché ci sono molecole che devono entrare nel nucleo, come la DNA polimerasi. Tutte le proteine, infatti, vengono sintetizzate sui ribosomi che si trovano nel citoplasma, ma queste proteine devono andare in punti diversi della cellula, quindi la DNA polimerasi viene sintetizzata nel citoplasma, ma poi deve tornare nel nucleo. Essa ha un peso molecolare superiore a 60.000 Da, quindi se non può transitare per diffusione, deve guadagnarsi l’accesso adottando una strategia diversa (questo è un problema di molte proteine e molecole). Come fanno a passare nel poro nucleare? Tutte le proteine che devono passare attraverso questi pori hanno un sistema di localizzazione e sfruttano quello che si chiama segnale di localizzazione nucleare (NLS), ovvero una sequenza di amminoacidi che si trova nella proteina. Per esempio, la DNA polimerasi ha nella sua sequenza amminoacidica una parte che funge da NLS. Spesso questa sequenza si trova all'estremità amminoterminale, ma può trovarsi anche all’interno della proteina. La NLS non è uguale per tutte le proteine, ma proteine diverse (come la DNA polimerasi, gli istoni e le elicasi) hanno NLS diverse, nel senso che la sequenza che le costituisce non è identica per tutte, e hanno una sequenza variabile di 8-30 amminoacidi. Un motivo comune a tutte le NLS è la presenza di molti amminoacidi arginina e lisina. Sono stati fatti degli esperimenti in cui modificando uno di questi amminoacidi (sostituendo una lisina con una treonina) la sequenza non riusciva più a lavorare come NLS. Nelle proteine che devono transitare nei pori nucleari è presente una NLS. Può essere a livello terminale ma anche all’interno della proteina; gli amminoacidi che la costituiscono possono non essere in sequenza nella struttura primaria, ma avvicinarsi nella struttura tridimensionale della proteina, l’importante è che si avvicinino nella conformazione tridimensionale della proteina. La scoperta della NSL risale alla metà del secolo scorso, quando è stata identificata e si è visto attraverso diverse procedure sperimentali che effettivamente queste sequenze hanno la capacità di mediare il trasferimento delle proteine all’interno del nucleo o dall’interno verso l’esterno. Per capire qual è la funzione di una certa sequenza all’interno di una proteina, cosa posso fare? Posso: togliere la sequenza NLS e vedo se la proteina è ancora in grado di passare o meno prendere una proteina che non deve arrivare al nucleo (per esempio un anticorpo), aggiungo una sequenza di localizzazione nucleare e vedo cosa succede: la proteina passerà attraverso i pori nucleari indurre nella sequenza NLS delle mutazioni per capire quali degli amminoacidi che la costituiscono sono essenziali per garantire lo svolgimento della funzione A cosa serve la sequenza di localizzazione nucleare? La NLS è riconosciuta da proteine che hanno funzione di trasportare la proteina cargo (ovvero la proteina di interesse) all’interno o all’esterno del nucleo e che hanno la funzione di: importine, quando il transito avviene dal citoplasma all’interno del nucleo esportine, quando il transito avviene dall’interno del nucleo verso l’esterno La proteina cargo è la proteina che deve essere trasportata e ha una NLS. Diverse proteine cargo hanno diverse sequenze NLS che possono essere riconosciute da diverse importine. In alcuni casi, la proteina cargo non interagisce direttamente con l’importina ma interviene un adattatore. La proteina che deve essere trasportata viene riconosciuta da un adattatore (come le prese della corrente) che poi si attacca all’importina e le fa svolgere la sua funzione. Le esportine fanno esattamente la stessa cosa, e complessivamente importine ed esportine vengono definite carioferine. Le esportine riconoscono segnali di esportazione nucleare (NES) e sequenze di localizzazione nucleare PEPTIDI ANTIMICROBICI (AMP) (Non spiegato a lezione, ma lo chiede all’esame) Gli AMP sono brevi sequenze di amminoaci (10-50) presenti in tutti I domini della vita. Ad oggi sono noti più di 1200 AMP e oltre 20 sono prodotti dalla pelle umana. Possiedono determinate caratteristiche e funzioni: Svolgono un ruolo importante nell’immunità innata Possiedono un’applicabilità farmaceutica ad ampio spettro Gli AMPs carichi positivamente interagiscono con le membrane, microbiche, cariche negativamente (acidi tecnici nella parete cellulare Gram-positivi e lipopolisaccaridi nella membrana esterna dei Gram- negativi) Al contrario, lo strato esterno delle membrane eucarioti che è composto da fosfatidilcolina e sfigomielina, che hanno carica neutra a ph fisiologico.