Resumen de HPLC/UPLC (PDF)

Introducción domingo, 1 de diciembre de 2024 11:32 8-11 página 1 8-11 página 2  Sistema de inyección viernes, 8 de noviembre de 2024 07:33 Volumen transferido a la columna: Aunque se inyectan 10 µL, solo 3 µL de ese volumen pasan finalmente a la...

Introducción domingo, 1 de diciembre de 2024 11:32 8-11 página 1 8-11 página 2  Sistema de inyección viernes, 8 de noviembre de 2024 07:33 Volumen transferido a la columna: Aunque se inyectan 10 µL, solo 3 µL de ese volumen pasan finalmente a la columna cromatográfica. Esto se debe a que el sistema retiene parte de la muestra para asegurar una transferencia controlada y uniforme a la columna. Descartes: El exceso de muestra que no pasa a la columna (en este caso, 7 µL) es enviado a un recipiente de descarte, como el que se ve en la imagen. 8-11 página 3  Se usa una jeringa para inyectar la muestra al loop (un tubo calibrado de volumen fijo, como 10 µL). En esta posición, la válvula está configurada para que la bomba del sistema de HPLC no interfiera en el loop. El exceso de muestra, una vez que el loop está lleno, se dirige hacia el drenaje (esto asegura que el loop esté completamente cargado con la muestra y sin burbujas). Es como un cambio de vías. Lo que ocurre es que la muestra todavía no está siendo arrastrada por el flujo de fase móvil. Cuando se carga la muestra, se está llenando un loop. Cuando se hace el giro, y ahora lo que se hace es que lo que viene de la columna se aline y arrastre a la columna la muestrea. ¿Dónde se esperaría que sean los picos más anchos? En GC o en HPLC. En HPLC porque el sistema de inyección no introduce un paquete compacto. La precisión está limitada por la reproducibilidad de la inyección sobre la muestra. ○ En realidad, como el bucle es el mismo siempre, entonces se mantiene todo muy estable. La sobrecarga aumenta la posibilidad de que los picos se ensanchen. Los volúmenes deben ser pequeños, se deben inyectar sin despresurizar el sistema. ○ El volumen pequeño es relativo si se compara con GC. ○ Si se debe inyectar sin despresurizar el sistema, porque en líquidos, los cambios de presión son más problemáticos. La bomba tiene que trabajar como un reloj suizo. Si cambia un poco la presión y la velocidad de flujo de la fase móvil, pueden cambiar los tiempos de retención. ○ Y eso es un problema. Porque podría ir cambiando continuamente el tiempo de retención en un mismo día. Entonces no se sabría quien es quien. El inyector puede llegar hasta 500 uL. Algo así es separar y recuperar. Son equipos más delicados que los GC. Se tienen que filtrar las muestras. 8-11 página 4 Disolventes. viernes, 8 de noviembre de 2024 07:40 Ese de la izquierda no es para UPLC. Sirve para HPLC y espectroscopía. El de la derecha es de UHPLC. Aunque diga el de la derecha sea filtrado, igual tiene que filtrarse. UPLC usa uL/min. La botella de 1L dura bastante. Características deseadas. Muchos disolventes están regulados por el Instituto Costarricense de Drogas. Pureza y estabilidad. Eso lo determina el equipo. Algunas casas comerciales le dicen a uno que tiene que comprar los produictos de ellos. Pero uno podría comprar los de otras casas comerciales. ○ Los productos duran alrededor de 40 días. Se quiere que el disolvente disuelva la muestra, que sea miscible con otros solventes, que no disuelva la fase estacionaria, que tenga baja viscosidad (glicerol) para que la bomba no se sobrecargue. Ser compatible con el detector. No se puede usar benceno de disolvente en el UV porque el benceno absorbe en el UV. Típicos disolventes que se usan mucho. También hay buffers. 8-11 página 5  También se debe tener en cuenta la miscibilidad. 8-11 página 6 Filtración. viernes, noviembre 08, 2024 8:07 AM La forma más rudimentaria de fiiltración. Pero la mayoría de los equipos tienen ese filtro a la entrada de solvente. ○ Esos tienen un doble propósito. Además de filtrar, desgasifica también. Se mete un gas inerte. Otro método que se puede hacer es poner esos filtros de línea en las mangueras. Se pone en el flujo de la fase móvil. La muestra también debe filtrarse. Es más crítico que se disuelva la muestra. 8-11 página 7 Desgasificación domingo, 1 de diciembre de 2024 13:53 Se usa un baño ultrasónico para la sonicacion. La forma buena es usar sistemas de burbujeo de helio. ○ El fundamento del burbujeo de He en la solución es que desplaza moléculas gaseosas de CO2 y oxígeno. Y como es más insoluble, espontáneamente se libera al ambiente. ○ Es más automático. Se puede programar el flujo de helio. Otra posibilidad es hacer un vacío. Desgasificación al vacío en línea. 8-11 página 8 Bombas de alta presión. domingo, 1 de diciembre de 2024 13:58 Bombas de alta presión. La bomba es la que tiene más posibilidad de que hayan bloqueos u obstrucciones. Es la responsable de arrastrar los disolventes en todo el sistema. Puede afectar distintas partes del equipo y podría afectar el tiempo de retención. Requisitos de las bombas. Requisitos de las bombas. Deben generar presiones por encima de 6000 lbs/pulg Producir un flujo sin pulsaciones. ○ No siempre se logra. Mover la fase móvil. Usualmente se usa 1 mL por minuto. Materiales resistentes a la corrosión. Tipos de bombas. Bombas reciprocas. Tiene un motor que empuja el pistón. Si el espacio está lleno de un fluido, el líquido se mueve en un flujo. 8-11 página 9  ¿Por qué han dominado las bombas reciprocas? Permite trabajar con volúmenes internos pequeños. Eso permite que no haya un gasto excesivo del disolvente. Adaptable al trabajo con gradiente. Una bomba de estas es compatible con hacer una cámara de premezclado. Permite poner diferentes disolventes para hacer las mezclas. 20% de A, 20% de B y 60% de otro. ○ Puede ser isocratico. En donde se mantiene toda la corrida en las mismas proporción de disolvente. ○ O puede hacerse no Isocratico. Donde los primeros 3 minutos se hace con una proporción y después se cambia a otra proporción. La gran desventaja de las bombas es que si produce un flujo con pulsaciones. Bombas neumáticas. No se desarrollaron en el HPLC. Lo que usan es aire para empujar el flujo de la fase movil. Las neumaticas son simples, baratas y genera un flujo sin pulsaciones. Pero tiene algunos problemas: ○ Hacer cambios de disolventes en una bomba de este tipo es muy difícil. Bombas de desplazamiento. Se tiene una manguera de plástico y se tiene un componente que rota y empuja el líquido. Se usaba mucho 8-11 página 10 Bombas de desplazamiento. Se tiene una manguera de plástico y se tiene un componente que rota y empuja el líquido. Se usaba mucho en absorción atómica. También genera un flujo sin pulsaciones. Pero otra vez se complica la elución con gradiente. 8-11 página 11  Fase movil viernes, noviembre 08, 2024 8:22 AM Se puede trabajar con elución isocratica o elución en gradiente. En gradiente se permite una rampa con la composición. Isocratica es cuando es estable. Se asemeja a isotérmico en GC, donde no se cambia la temperatura del horno Eso permite ganar resolución. En la imagen de abajo, se tienen picos muy pegados (6, 7, 1, 2 y 3). Lo mejor es hacer un cambio de mezcla en donde se asemeje las condiciones para los últimos picos y se cambia con la fase móvil de los primeros picos. Hay que imaginar que esa columna es no polar. Los analitos que salen " muy disparados" es porque son afines a la fase móvil. En HPLC los analitos tienen interacciones con la fase móvil y estacionaria. ○ Los analitos van a ser afines a quien más les guste. ○ Como la columna es no polar. Si los primeros picos estan saliendo "disparados" (muy rápido), entonces la solución es bajarle la polaridad al disolvente. ○ Entonces, en la primera parte hay que usar un disolvente menos polar en donde se tendría una fase móvil menos afin a esos compuestos primeros. 8-11 página 12  Precolumnas y columnas. viernes, noviembre 08, 2024 8:28 AM Precolumnas. Aumenta el tiempo de vida de la columna analítica. Logra filtrar sólidos no disueltos. ¿Por qué se sacrifica la precolumna? Es del mismo material de la columna, pero con un tamaño de partícula mayor. Son más baratas. Cuando se contaminan se reemplazan. ○ Casi siempre vienen juntas la columna y la precolumna. Columnas. Son de acero inoxidable. Las más pequeñas son de UPLC (las de la izquierda pequeñas). La gorda y la primera de la derecha más larga son preparativas. Características generales de las columnas. Material de acero inoxidable. El vidrio ya no se usa tanto. Longitud de 3-30 cm. ○ Un truco es poner dos columnas en serie. Si es una separación muy difícil. Características de la columna que aparece en la imagen: Es una C18. 150 mm es el largo y 4,6 mm es el ancho. No dan información del tamaño de partícula. Otro detalle es el flujo. Ellas siempre tienen una dirección de flujo. Pero puede ser que se haga un truco para quitar obstrucciones haciendo cambios de flujo (montandola al revés). 8-11 página 13  Otro detalle es el flujo. Ellas siempre tienen una dirección de flujo. Pero puede ser que se haga un truco para quitar obstrucciones haciendo cambios de flujo (montandola al revés). Clasificaciones de las columnas. De acuerdo con la temperatura: Termostatizadas. Cajas (hornos) que permiten calentar la columna. No todas lo permiten. Sin termostatizar Casi no se usa. De acuerdo con el tipo de relleno: Películas Porosa. 8-11 página 14