Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR)
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Questions and Answers

¿Cuánto volumen de muestra se inyecta en total y cuánto de este volumen pasa finalmente a la columna cromatográfica?

Se inyectan 10 µL, de los cuales solo 3 µL pasan a la columna cromatográfica.

¿Qué sucede con el exceso de muestra que no pasa a la columna?

El exceso de muestra, en este caso 7 µL, es enviado a un recipiente de descarte.

¿Cuál es la función del loop en el sistema de inyección?

El loop se utiliza para cargar una cantidad fija de muestra, asegurando que esté libre de burbujas y completamente llena.

¿Por qué los picos se espera que sean más anchos en HPLC en comparación con GC?

<p>Los picos son más anchos en HPLC porque el sistema de inyección no introduce un paquete compacto de muestra.</p> Signup and view all the answers

¿Cómo afecta la sobrecarga a la precisión del análisis en HPLC?

<p>La sobrecarga aumenta la posibilidad de que los picos se ensanchen, afectando la precisión del análisis.</p> Signup and view all the answers

¿Por qué es importante no despresurizar el sistema al inyectar la muestra?

<p>Despresurizar el sistema puede causar problemas en la inyección de líquidos, afectando el flujo y la precisión.</p> Signup and view all the answers

¿Qué papel tiene la bomba en el sistema de inyección de HPLC?

<p>La bomba tiene que trabajar de manera constante y precisa, como un reloj suizo, para mantener el flujo adecuado.</p> Signup and view all the answers

¿Qué se debe considerar al inyectar los volúmenes de muestra en HPLC?

<p>Se deben inyectar volúmenes pequeños de muestra para evitar problemas de sobrecarga y mantener la reproducibilidad.</p> Signup and view all the answers

¿Cómo afecta un cambio en la presión y la velocidad de flujo a los tiempos de retención?

<p>Puede cambiar significativamente los tiempos de retención, complicando la identificación de los compuestos.</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es la capacidad de un inyector típico en cromatografía y por qué es relevante?

<p>El inyector puede alcanzar hasta 500 uL, lo que es relevante para la precisión en la inyección de muestras.</p> Signup and view all the answers

¿Qué diferencia hay entre los disolventes utilizados en UPLC y HPLC?

<p>El disolvente de HPLC no es adecuado para UPLC, ya que esta última utiliza flujos en microlitros por minuto.</p> Signup and view all the answers

¿Qué características se buscan en un disolvente para su uso en cromatografía?

<p>Se busca que el disolvente disuelva la muestra, sea miscible con otros disolventes y tenga baja viscosidad.</p> Signup and view all the answers

¿Por qué es importante filtrar las muestras antes de la análisis?

<p>Filtrar las muestras es crucial para evitar el daño en los equipos y asegurar la calidad de los resultados.</p> Signup and view all the answers

¿Qué problemas puede causar el uso de benceno como disolvente en UV?

<p>El benceno absorbe en la región UV, lo que impide la correcta detección de las muestras.</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es la duración típica de los productos utilizados en cromatografía?

<p>Los productos duran alrededor de 40 días, lo que requiere atención en su uso y almacenamiento.</p> Signup and view all the answers

¿Qué implica la miscibilidad en el contexto de disolventes?

<p>La miscibilidad se refiere a la capacidad de un disolvente para mezclarse con otros sin formar fases separadas.</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito principal de los filtros a la entrada de solvente en los equipos?

<p>Filtrar el solvente y desgasificarlo con un gas inerte.</p> Signup and view all the answers

¿Cómo funciona el método de burbujeo de helio para la desgasificación?

<p>El helio desplaza moléculas de CO2 y oxígeno, que son menos solubles, expulsándolas al ambiente.</p> Signup and view all the answers

¿Cuáles son los requisitos que deben cumplir las bombas de alta presión?

<p>Generar presiones superiores a 6000 lbs/pulg y producir un flujo sin pulsaciones.</p> Signup and view all the answers

¿Por qué las bombas recíprocas son preferidas en muchos sistemas?

<p>Porque permiten trabajar con volúmenes internos pequeños y son adaptables al trabajo con gradientes de solventes.</p> Signup and view all the answers

¿Qué características debe tener una bomba utilizada en sistemas de alta presión?

<p>Deben ser resistentes a la corrosión y capaces de mantener un flujo constante.</p> Signup and view all the answers

¿Qué se entiende por un sistema de desgasificación al vacío?

<p>Es un método que elimina gases disueltos creando un entorno de vacío en línea.</p> Signup and view all the answers

¿Cómo afecta una bomba sobre la retención de tiempo en el sistema?

<p>Una bomba bloqueada puede atrasar el flujo y afectar el tiempo de retención de las muestras.</p> Signup and view all the answers

¿Qué diferencia hay entre un sistema isocrático y uno no isocrático?

<p>El isocrático mantiene proporciones constantes de disolventes, mientras que el no isocrático varía estas proporciones durante la corrida.</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es la principal desventaja de las bombas neumáticas en HPLC?

<p>La principal desventaja es que hacer cambios de disolventes en una bomba de este tipo es muy difícil.</p> Signup and view all the answers

¿Qué tipo de elución se asemeja a isotérmico en GC y por qué?

<p>La elución isocrática se asemeja a isotérmico porque se mantiene estable la composición del disolvente.</p> Signup and view all the answers

¿Qué función tienen las precolumnas en el HPLC?

<p>Las precolumnas aumentan el tiempo de vida de la columna analítica y filtran sólidos no disueltos.</p> Signup and view all the answers

¿Cómo afectan las interacciones entre analitos y la fase móvil en HPLC?

<p>Las interacciones determinan la velocidad con que los analitos son eluidos y su afinidad con la fase móvil.</p> Signup and view all the answers

¿Por qué es complicado realizar elución en gradiente con bombas de desplazamiento?

<p>Es complicado porque estas bombas generan un flujo continuo sin pulsaciones, lo que dificulta cambios abruptos en la composición.</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es la característica de las bombas de desplazamiento en comparación con las neumáticas?

<p>Las bombas de desplazamiento empujan el líquido mediante un componente que rota, a diferencia de las neumáticas que utilizan aire.</p> Signup and view all the answers

¿Qué estrategia se puede emplear si los picos salen 'disparados' durante el análisis?

<p>Se puede bajar la polaridad del disolvente para que sea menos afín a esos compuestos.</p> Signup and view all the answers

¿Qué material suelen usar las columnas en HPLC y por qué?

<p>Las columnas son de acero inoxidable porque son duraderas y resistentes a la presión.</p> Signup and view all the answers

Flashcards

Volumen transferido a la columna

Sólo una parte (3 µL) del volumen inyectado (10 µL) llega a la columna cromatográfica.

Descarte de muestra

El exceso de muestra no empleada (7 µL) es enviada a un recipiente de descarte.

Inyección de muestra en HPLC

Se usa una jeringa para inyectar la muestra a un loop (tubo de volumen fijo).

Loop (HPLC)

Un tubo calibrado de volumen fijo usado para inyectar la muestra.

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Precisión de inyección de muestra

Está limitada por la reproducibilidad de la inyección de muestra en cada ensayo.

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Picos anchos (HPLC)

Picos más anchos en HPLC comparados con GC debido a que la inyección no introduce un paquete compacto.

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Sobrecarga en HPLC

Mayor volumen de muestra inyectado aumenta la posibilidad de picos ensanchados.

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Volumen de inyección (HPLC)

Deben ser pequeños, sin despresurizar el sistema, debido a la relación con los cambios de presión.

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Cambios en presión y flujo móvil

Alterar la presión y velocidad del fluido móvil (fase móvil) en HPLC/UPLC puede modificar los tiempos de retención de las sustancias en la muestra.

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Tiempo de retención variable

Cambios continuos en los tiempos de retención de las muestras en el mismo día, dificultan la identificación de las sustancias en la cromatografía.

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Capacidad del inyector UPLC

El inyector puede manejar hasta 500 microlitros de muestra.

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Diferencias entre HPLC y UPLC

HPLC y UPLC, métodos de cromatografía líquida, son diferentes en la presión y flujos de trabajo, que impactan en el análisis de la muestra.

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Filtración de muestras

Procesar las muestras antes analizarlas en HPLC/UPLC para eliminar partículas sólidas y mejorar la calidad de la separación

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Disolventes regulados

Algunos disolventes para HPLC/UPLC están regulados por entidades como el Instituto Costarricense de Drogas para asegurar la pureza y estabilidad.

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Compatibilidad disolvente-detector

El disolvente debe ser compatible con el detector utilizado en la cromatografía (ej: UV). Algunos disolventes absorben en la zona del UV.

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Miscibilidad de disolventes

La capacidad de dos o más disolventes para mezclarse completamente sin separarse en capas.

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Bombas Neumáticas en HPLC

Bombas que empujan la fase móvil usando aire comprimido. Son simples, baratas y producen flujo sin pulsaciones.

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Cambios de disolventes (bombas)

Cambiar de disolventes en bombas neumáticas es muy difícil.

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Bombas de desplazamiento

Bombas que empujan la fase móvil rotando un componente dentro de una manguera. Producen flujo sin pulsaciones y se usaron en absorción atómica.

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Elución Isocrática

Técnica de cromatografía donde la composición de la fase móvil es constante durante la separación.

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Elución en Gradiente

Técnica donde la composición de la fase móvil cambia durante la separación. Se utiliza para mejorar la resolución.

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Afinidad de analitos

Los analitos (compuestos a separar) interactúan más fuertemente con la fase móvil o estacionaria, dependiendo de su afinidad con cada una.

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Precolumnas (HPLC)

Columnas adicionales antes de la columna principal que filtran sólidos y prolongan la vida de la columna principal.

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Columnas Analíticas (HPLC)

Componentes de acero inoxidable que contienen la fase estacionaria para la separación de analitos.

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Desgasificación

Proceso para eliminar gases disueltos (como CO2 y oxígeno) de un líquido, crucial para HPLC.

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Desgasificación por sonicación

Método de desgasificación que utiliza un baño ultrasónico para remover gases disueltos.

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Desgasificación por burbujeo de Helio

Método de desgasificación que utiliza un flujo de helio para desplazar gases disueltos de la solución.

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Desgasificación al vacío

Técnica de desgasificación que utiliza vacío para remover gases disueltos de la fase móvil.

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Bombas de alta presión en HPLC

Bombas responsables de forzar la fase móvil a través del sistema HPLC, cruciales para el proceso.

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Bombas reciprocantes

Tipo de bomba que utiliza un pistón para mover la fase móvil a través del sistema, común en HPLC.

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Flujo isocrático

Técnica de HPLC en la que las proporciones de disolventes se mantienen constantes durante toda la corrida.

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Flujo no isocrático

Técnica de HPLC en la que las proporciones de disolventes cambian durante la corrida.

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Study Notes

Introducción a la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR)

  • La cromatografía es un método físico basado en la distribución de componentes de una mezcla (entre dos fases inmiscibles: estacionaria y móvil).
  • En CLAR, la fase móvil es líquida, que fluye a través de una columna con la fase fija.
  • Csaba Horváth desarrolló el primer HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia).

CLAR: Metodología y Aplicaciones

  • CLAR es ampliamente utilizada por su alta sensibilidad, adaptabilidad a la cuantificación y capacidad para separar especies termolábiles y no volátiles.
  • Las aplicaciones incluyen el análisis de aminoácidos, carbohidratos, terpenoides, plaguicidas, esteroides, hidrocarburos, drogas, proteínas y antibióticos.
  • CLAR es fundamental en la ciencia, industria y sociedad.

Cromatografía Líquida de Alta Resolución: Instrumentación

  • El proceso involucra un reservorio de fase móvil, bomba, inyector, columna, desgasificador ,y detector.
  • Se utilizan precolumnas para prolongar la vida útil de la columna analítica y eliminar contaminantes.

Sistemas de Inyección

  • Los volúmenes suelen ser pequeños, típicamente 10 µL.
  • Se inyecta con una jeringa y la muestra pasa a una sección de la columna.
  • El exceso de la muestra y las impurezas se envían a un recipiente separado.

Elución: Isocrática vs. Gradiente

  • La elución isocrática mantiene una composición constante de la fase móvil durante el experimento.
  • La elución con gradiente modifica la composición de la fase móvil a lo largo del tiempo para optimizar la separación de componentes.

Fase Móvil

  • Es el líquido que transporta la muestra a través de la columna.
  • La polaridad de la fase móvil afecta la separación, y se elige apropiadamente dependiendo de la muestra.

Filtración

  • Se utiliza la filtración para remover partículas sólidas, especialmente para HPLC.
  • Los métodos incluyen filtración al vacío, a la entrada del solvente y en línea.

Desgasificación de Solventes

  • Para eliminar las impurezas gaseosas como oxígeno o dióxido de carbono, se utilizan técnicas como sonicación, burbujeo de helio y desgasificación por vacío en línea.

Bombas de Alta Presión

  • Las bombas de alta presión son esenciales en CLAR para impulsar la fase móvil a través de la columna.
  • Se describen tres tipos principales: recíprocas, de desplazamiento y neumáticas; cada una con ventajas y desventajas en cuanto a precisión y costo.

Columnas: Clasificación y Caracterización

  • Las columnas en HPLC se clasifican por su material (acero inoxidable o vidrio), longitud, diámetro interno, y tipo de relleno (partícula porosa o pelicular).
  • Se mencionan las precolumnas, las cuales se utilizan para prolongar la vida útil de la columna.
  • El diámetro de la columna y la cantidad de relleno son variables clave en la resolución.

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Resumen de HPLC/UPLC (PDF)

Description

Este cuestionario cubre la introducción y metodología de la Cromatografía Líquida de Alta Resolución, también conocida como CLAR. Se abordarán sus aplicaciones en análisis químico y la instrumentación básica necesaria para llevar a cabo este método. Ideal para aquellos que buscan profundizar en la técnica y sus usos en la ciencia y la industria.

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