Tema 14 Cromatografía Líquida en Columna PDF

ANÁLISIS QUÍMICO II BLOQUE III TEMA 14 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I Contenidos 14.1 Introducción a la Cromatografía Líquida (CL) en columna 14.2 Modalidad de la CL en columna: - Adsorción - Partición ó reparto...

ANÁLISIS QUÍMICO II BLOQUE III TEMA 14 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I Contenidos 14.1 Introducción a la Cromatografía Líquida (CL) en columna 14.2 Modalidad de la CL en columna: - Adsorción - Partición ó reparto - Exclusión - Afinidad - Iónica o de intercambio iónico 14.3 CL en columna clásica y de alta eficacia (HPLC) 14.4 Instrumentación HPLC. Tendencia a miniaturización 14.5 Aplicaciones analíticas. 14.6 Análisis cualitativo y cuantitativo TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.1 Introducción Cromatografía Líquida en Columna: Técnica de separación de los COMPONENTES DE UNA MEZCLA, los cuales se distribuyen entre dos fases, una FASE ESTACIONARIA (sólida o líquida) contenida en un soporte tipo columna y otra FASE MÓVIL líquida. La CL en columna tiene diversas clasificaciones:  SEGÚN LA FINALIDAD DEL ANÁLISIS:  Preparativa: Separación y purificación  Analítica: Separación, identificación y cuantificación  Fase móvil (FM) ¿Cómo se produce la separación?  Soluto o muestra (M)  Fase estacionaria (FES) Eluyente (FM) (Muestra: + + ) TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.2 Modalidades de la CL en columna …. Otra clasificación de la CL en columna:  NATURALEZA DE LAS INTERACCIONES DE LOS ANALITOS Y LA FASE ESTACIONARIA De acuerdo a estas interacciones tenemos: - Cromatografía de Adsorción - Cromatografía de Partición-reparto - CL fase normal - CL fase inversa - Cromatografía de Intercambio iónico - Cromatografía de Exclusión - Cromatografía de Afinidad TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.2 Modalidades de la CL en columna CL de Adsorción o líquido-sólido La fase estacionaria adsorbe a la mezcla y la fase móvil desorbe selectivamente los compuestos produciendo diferencias en las velocidades de migración. Esto provoca la separación de los mismos. Fase estacionaria sólida (adsorbentes comercialmente disponibles):  Carbón activado  Alúmina (Al2O3 – carácter básico)  Sílice o Sílica gel (SiO2H2O – carácter ácido) Silanoles (Si-OH): Dadores de puentes de hidrogeno Siloxanos (Si-O-Si):Aceptores de puentes de hidrogeno Muy buena matriz capaz de interaccionar con distintos analitos mediante dipolo-dipolo y también mediante donar y aceptar puentes de hidrogeno  TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.2 Modalidades de la CL en columna CL de Adsorción o líquido-sólido Fase estacionaria de Sílice: Adsorción superficial de los analitos de la muestra va a depender de:  Polaridad – polarizabilidad  Capacidad de formar puentes de H Los compuestos más polares se + adsorben más fácilmente: Ácidos y bases Alcoholes y tioles Polaridad Aldehídos y cetonas Halogenuros de alquilo, éteres y ésteres Polaridad no polar Hidrocarburos insaturados polar media Hidrocarburos saturados - «Lo semejante mezcla a lo semejante» TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.2 Modalidades de la CL en columna CL de Adsorción o líquido-sólido La desorción depende de la polaridad de la fase móvil:  Cuanto mayor sea la interacción solvente (fase móvil)-matriz (Fase estacionaria: sílice), mayor será la probabilidad de desorción del analito o viceversa.  Si el solvente es muy polar, el analito será fuertemente desorbido de la fase estacionaria y el desplazamiento será inmediato. SERIE ELUOTRÓPICA Índice de Fuerza del - polaridad disolvente - 0.1 Isooctano 0.01 2.7 Benceno 0.32 Desplazamiento 4.0 THF 0.82 Polaridad 4.1 Cloroformo 0.40 4.8 Dioxano 0.56 5.1 Acetona 0.56 5.1 Metanol 0.95 5.8 Acetonitrilo 0.65 + 10.2 Agua >>1 + TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.2 Modalidades de la CL en columna CL de Adsorción o líquido-sólido APLICACIONES 1. Compuestos orgánicos con POLARIDAD MEDIA o BAJA, isómeros estructurales 2. Los iónicos, ionizables o muy polares provocan retenciones irreversibles. La separación de compuestos muy polares mediante cromatografía de adsorción requiere, debido a la gran retención que ofrecen, la utilización de adsorbentes muy poco activos, o bien, tratamientos químicos previos para la preparación de la muestra, a fin de reducir su polaridad. Separación de Pirazolonas cis y trans por CL de adsorción Limitaciones: - Control estricto composición fase móvil (contenido en agua) - Retenciones semirreversibles o irreversibles TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.2 Modalidades de la CL en columna CL de Partición o reparto Fases estacionaria y móvil son líquidos inmiscibles. Reparto entre dos líquidos por diferencia de solubilidad. La fase estacionaria líquida se soporta sobre un sólido inerte que no participa en la separación (sílice, celulosa, tierras diatomeas…) Formas de fijar la fase estacionaria activa sobre el soporte sólido inerte:  CL fase estacionaria adsorbida sobre el soporte sólido. CL fase estacionaria ligada sobre el soporte sólido: Tipos (a) CL en fase normal, cuando la fase estacionaria es polar (-CN, -OH, -NH2) y la fase móvil no polar, el componente menos polar es el que eluye primero. (b) CL en fase inversa (reversa), fase estacionaria es no polar (-C18, -C8, -C4) la fase móvil polar, el componente más polar es el primero en eluír. CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN EN FASE INVERSA CON EMPLEO DE FASES LIGADAS MAYOR IMPORTANCIA TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.2 Modalidades de la CL en columna CL de Partición o reparto Fase estacionaria Adsorbida Soporte sólido  compuesto por SiO2 Fase estacionaria  Disolventes polares con puentes de H con el soporte silíceo: agua, 1,2-propanodiol, polietilenglicol *ANTIGUA Cromatografía de Partición: - soporte sólido se recubría con un disolvente orgánico (no enlazado). Se necesita un recubrimiento periódico de las partículas del soporte por perdida de la fase estacionaria. - fase móvil era agua y/o disolvente orgánico polar - auténtica extracción Líquido-Líquido CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN CON EMPLEO DE FASES ADSORBIDAS EN FASE NORMAL TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.2 Modalidades de la CL en columna CL de Partición o reparto Fase estacionaria Ligada La fase estacionaria se une químicamente a la superficie del soporte (Sílice), para mejorar su estabilidad. Síntesis: Si-OH + Cl2SO2 Si-Cl Sílice + Cloruro de sulfonilo Si-Cl Se transforma a Si-R, por reacción del tipo Grignard, Wurtz ó Friedel-Crafts Cuándo, R = radical orgánico apolar (alquilos: C18H37 (C18 o n-octadecil), C8H17 (C8 o n-octil)), o R = polar si tiene grupos funcionales OH, -COOH, etc. CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN CON EMPLEO DE FASES LIGADAS EN FASE NORMAL O INVERSA TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.2 Modalidades de la CL en columna CL de Partición o reparto CL de PARTICIÓN en FASES LIGADAS apolares FASE INVERSA Características: - Tiempos de retención cortos - Velocidad de muestreo alta - Exenta de reacciones irreversibles - No se deteriora la columna - Campo de aplicación muy amplio CL de PARTICIÓN en FASES LIGADAS polares FASE NORMAL Características: - Alternativa a la CL de adsorción con FE más estables y mejoradas y por menor retención de las fases polares - Fase móvil poco polar, aumentando la capacidad de elución con la polaridad - R-NH2 no sirve en contacto con oxidantes ni para aldehídos y cetonas (bases de Schiff) TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.2 Modalidades de la CL en columna PODER DESPLAZANTE DE LA FASE MOVIL  CL en fase normal: Fase estacionaria Polar (-CN, -OH, -NH2) no polar CL en fase normal F.M. Polaridad media no-polar polar con polaridad Muestra Polaridad no polar media polar  CL en fase inversa: Fase estacionaria no Polar (-C18, -C8, -C4) F.M. no polar Polar CL en fase inversa Polaridad Muestra no Polaridad polar polar media polar media con polaridad Uso de gradientes en fase móvil:  Mezcla de compuestos apolar y polares.  Reducción del tiempo de análisis sin influir en la correcta resolución entre los picos. TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.2 Modalidades de la CL en columna CL Iónica ó Intercambio iónico Permite separar iones y especies polares en función de su carga (ej. separación de proteínas y aminoácidos). Fase estacionaria: fase solida que contiene:  Grupos aniónicos (sulfónicos o carboxílicos – para la separación de cationes).  Grupos catiónicos (amino cuaternarias, ternarias o secundarias – para la separación de aniones). Resinas de intercambio iónico Eluyente Intercambio de catión Intercambio de anión R-CO2H + M+ R-CO2M + H+ M+ se eluye de la columna con un ácido fuerte. TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.2 Modalidades de la CL en columna CL Iónica ó Intercambio iónico Aplicaciones TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.2 Modalidades de la CL en columna CL de exclusión molecular La separación depende del tamaño de la molécula.  Fase estacionaria: partículas poliméricas o de sílice (red uniforme de poros), donde las moléculas se eluyen por su tamaño decreciente.  Útil para hacer fracciones previas en mezclas muy complejas que luego se vuelven a cromatografiar.  Si la fase móvil es un solvente acuoso: la técnica se denomina cromatografía de filtración en geles. Si la fase móvil es un solvente orgánico: la técnica se denomina cromatografía de permeación en geles. Técnica que se aplica fundamentalmente para la separación y caracterización de moléculas grandes tales como proteínas, polímeros, ect. TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.2 Modalidades de la CL en columna CL de exclusión molecular MECANISMO Del conjunto de moléculas: 1. Las de mayor tamaño no pueden entrar en los poros y son excluídas eluyendo con el frente. 2. Las pequeñas recorren mayor trayecto y tardan mas en eluir. TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.2 Modalidades de la CL en columna CL de exclusión molecular Características: - No existen interacciones químicas ni físico-químicas - Tipo de fase móvil no es decisiva (no gradientes) - La columna no se desactiva - La muestra no sufre alteraciones - Fuerzas de retención bajas (picos estrechos) - Solutos con amplio intervalo de pesos moleculares TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.2 Modalidades de la CL en columna CL de Afinidad Fase estacionaria: Sólido (agarosa) o lecho de vidrio poroso sobre el que se inmoviliza el ligando de afinidad. Ligandos de afinidad: - Anticuerpos Basado en el - Inhibidores enzimáticos,... acoplamiento LLAVE-CERRADURA Unión bioespecífica por la que los “ligandos de afinidad” enlazados químicamente en el soporte sólido retienen a los solutos de manera reversible y selectiva. Fase movil: 1) favorecer unión 2) debilitarla para eluir por cambio de pH, fuerza iónica, etc.. TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.2 Modalidades de la CL en columna CL de Afinidad Muy útil para compuestos de interés bioquímico. Características: 1. Alta selectividad en mecanismo de retención 2.Frecuente trabajar a baja presión 3.Separación de un solo soluto (preparativa) 4.Usa columnas cortas de baja eficacia 5.Campo de aplicación restringido TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.3 CL en columna clásica y HPLC Cromatografía Líquida Clásica - Columnas vidrio abiertas - Diámetro columna 1 – 5 cm - Longitud 50 – 500 cm - Diámetro partícula 150 – 200 m - Fase móvil fluye por gravedad - Flujo de fase móvil: < 2 mL/min INCONVENIENTES - Caudales bajos - Baja eficacia, por el elevado tamaño de partícula L = 10 – 30 cm < Diámetro partícula: 5 –10 m d.i : 4,6 – 10 mm Cromatografía Líquida Alta Resolución Elevadas presiones altas (CLAR ó HPLC) TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.4 Instrumentación HPLC: Componentes Cromatógrafo de líquidos o HPLC COMPONENTES: - Deposito para la fase móvil - Sistema bombeo para proporcionar presión a la fase móvil - Dispositivo introducción de muestra - Columna cromatográfica - Detector - Sistema tratamiento datos y registrador (Software y pc) TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.4 Instrumentación HPLC: Componentes Sistema de bombeo Características: - Estar construidos con materiales inertes - Suministrar flujo de eluyente libre de pulsaciones en el margen de: 0,1 a 10 mL min-1 - Generar presiones superiores a 6000 psi Fase movil Bomba recíproca Fase movil TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.4 Instrumentación HPLC: Componentes - Jeringa Sistema de Inyección de la Muestra - Zona de inyección - Bucle (loop) - Válvula 6 vías MODOS: Carga – Inyección TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.4 Instrumentación HPLC: Componentes Columnas CONVENCIONALES - Tubos de acero inoxidable capaces de soportar altas presiones - Longitud de 10 a 30 cm - Diámetro interno de 4,6 a 10 mm - Tamaño de partícula de 5 a 10 m - 40.000 - 60.000 platos/metro MICROCOLUMNAS (rápidas) - Longitud de 3 a 7,5 cm - Diámetro interno de 1 a 4,6 mm - Tamaño de partícula de 3 a 5 m - >100.000 platos/metro Ventajas: más rápidas y menor consumo de disolventes ¡MINIATURIZACIÓN! TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.4 Instrumentación HPLC: Componentes Material de relleno de las columnas El material de relleno de la columna de HPLC Depende del tipo de cromatografía que queremos practicar (cromatografía de Adsorción, partición-reparto, intercambio iónico, exclusión, o de afinidad) Generalmente se utilizan micropartículas de sílice modificadas: Ej. Modificación con cadenas hidrocarbonadas C8 y C18: cromatografía de reparto pH de trabajo: 2-8 TEMA 14: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA I 14.4 Instrumentación HPLC: Componentes Elución de solutos retenidos en la columna Eluyen primero los solutos que tienen menor afinidad con la fase estacionaria (