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Cromatografía líquida de alta eficiencia HPLC Dra. Martha E. López  HPLC High Performance Liquid Chromatography HPLC es una técnica analítica utilizada para separar componentes de...

Cromatografía líquida de alta eficiencia HPLC Dra. Martha E. López  HPLC High Performance Liquid Chromatography HPLC es una técnica analítica utilizada para separar componentes de una mezcla por medio de la afinidad diferencial del analito por dos fases Sistema cromatográfico Fase Alto rendimiento estacionaria Fase móvil Sólido, líquido o una mezcla sólido/liquido Líquido la cual es inmovilizada fluye a través de la fase estacionaria No polar (columna) Portador de la muestra Interacciones no covalentes de los componentes con la columna Dra. Martha E. López  HPLC High Pressure Liquid Chromatography Es una extención de la cromatografía líquida convencional (automatizada). Es una herramienta poderosa en las técnicas analíticas ◉ Una forma de la columan cromatográfica para o Presenta mayor separación en menor separar, identificar y cuantificar compuestos tiempo de duración ◉ Se desarrolló en 1970s al mejorar la o Técnica cromatográfica que puede cromatografía en columna abierta separar amplio rango de moléculas en tipo y tamaño ◉ Es la más extensa técnica de separación o Separa compuestos no volátiles o analitica utilizada termolábiles ◉ Fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas Dra. Martha E. López  ¿Como se originó HPLC ? A partir de la ecuación de van Deemter pueden deducirse las condiciones experimentales que minimicen el valor de H y aumenten N (eficiencia): ▪ A velocidades inferiores a la óptima aumenta la difusión longitudinal (B) con incremento H. ▪ H disminuye con el tamaño de partícula y con un empaquetamiento uniforme. ▪ Al disminuir el tamaño de partícula y el diámetro de las columnas se requirieron mayores presiones para acelerar el paso de la fase móvil por la columna. Dra. Martha E. López  HPLC Permite el análisis El eluente es de partículas muy forzado a pazar a pequeñas tendrán través de una Columnas mayor interacción columna a alta herméticamente con áreas presión (arriba de empaquetada superficiales entre 5,000 psi) por la fase medio de una estacionaria y el bomba flujo de moléculas Dra. Dra. Martha Martha E. E. López López  Técnica HPLC Dra. Dra. Martha Martha E. E. López López  Técnica HPLC La fase movil es líquida para separar la mezcla Los analitos son disueltos primero en un solvente que pasa a través de la columna a alta presión (400 atm) La mezcla se separa en sus componentes en la columna de 5 a 10 min hasta horas o incluso días son los tiempos de separación Dra. Martha E. López  Técnica de separación Masa molecular >2000 Soluble en Soluble en agua solventes orgánicos Tamaño molecular Tamaño molecular < 30 nm 30-400 nm Apariado no-iónico íonico Cromatografía de fase reversa ligada Cromatografía de Tamaño molecular < tamaño molecular Cromatografía de exclusión molecular 30nm 30-400 nm intercambio íonico Cromatografía fase reversa ligada o cromatografía de interacción exclisión molecular hidrofóbica Dra. Martha E. López  Componentes del HPLC Dra. Martha E. López  Componentes de HPLC Sistema de Sistema de solventes Bombeo Sistema de Inyección de Columna muestra Sistema de Detector datos Dra. Martha E. López  Sistema de HPLC Manipulador Circulación del fluido Muestra fraccionada Inyector de muestra Válvula de encendido Solventes Bomba del solvente B Bomba del solvente A Columna separadora Colector de fracciones Desechos Viales que contienen las fracciones Mezclador Válvula Desgasificador Bomba de alta presión Bomba de purga Dra. Martha E. López  Sistema de HPLC Dra. Dra. Martha Martha E. E. López López  Sistema de solventes Bomba de vacío Burbujeo Desgasifica Burbuja dor fiina del Depósitos gas (He) Eliminar el gas de fase disuelto móvil Diversos depósitos Dra. Martha E. López  Sistema de solventes Elución isocrática Diferente sistema de solventes durante la Filtros elución miliporos bajo Cambio continuo o paso a paso Eliminador de vacío Válvula de proporción de polvo disolvente El polvo interfiere con la detección Daña el sistema de bombas Dra. Martha E. López  Sistema de solventes Depósitos de fase móvil Diversos depósitos Dra. Martha E. López  Sistema de solventes Desgasificador Dra. Martha E. López  Sistema de solventes Bomba de HPLC Composición exacta de la FM Flujo y velocidad constante Sistema de amortiguación Dra. Martha E. López  Sistema de bombas Alta presión Tipos de Arriba de bomba HPLC 6000 psi Sin Bomba Más comunmente utilizada vibración Desventajas: pulsos de un solo reciprocante pistón Control de flujo Bomba de Genera pulsos de salida libre jeringa Desventajas: limita la capacidad de 0.1 a 10 la fase móvil mL/min Dra. Martha E. López  Bomba ◉ Fuerza a la fase móvil a través de la columna a una mayor velocidad que el flujo por gravedad de la columna ◉ La bomba neumática es usada para fines preoperatorios Neumáticas Tipo de jeringa Amplifiador hidraulico ◉ La más extensamente utilizada es la bomba multicabezal con dos o más pistones alternativos Dra. Martha E. López  Sistema de inyectores Dra. Dra. Martha Martha E. E. López López  Inyectores Inyecta la muestra líquida con un rango de 0.1 a 100 𝝻L de volumen bajo presión alta Produce un mínimo de ampliación de banda Produce posibles alteraciones del flujo El volumen debe ser pequeño No interfiere con la presión Automuestreo: inyección continua Dra. Martha E. López  Automuestreador Sistema automatizado Reducir la diferencia entre inyección de muestras Permite la inyección de los estándar bien dosificadas Dra. Martha E. López  Partes de la columna Dra. Martha E. López  Columna Tubos de vidrio de paredes gruesas o acero inoxidable de ánima lisa Varían en tamaño y empaquetamiento El material más común usado en las columnas empaquetadas es sílica gel Dra. Martha E. López Tipos de FE enlazadas usadas en HPLC ▪ Fase enlazada inversa. El recubrimiento unido químicamente tiene un carácter no polar, el grupo R del siloxano es una cadena C8 (n-octilo) o una cadena C18 (n-octadecilo) ▪ Fase enlazada normal. El recubrimiento contiene grupos funcionales polares, R en la estructura del siloxano es un grupo funcional polar como es el caso de los grupos ciano (-C2H4CN), diol (-C3H6OCH2CHOHCH20H), amino (-C3H6NH2) y los dimetilamino (-C3H6N(CH3)2 ▪ El tipo ciano es el menos polar y el tipo amino es el más polar y los dioles son de una polaridad intermedia Dra. Martha E. López  Columna Entrada Columna analítica Columna Microcolumna guarda Poros de titanio Columna de guardia Proteje a la columna analítica Chaqueta de aluminio anodizada Control de temperatura 0.1 ºC a 150 ºC Columna principal Sílica, alumina, poliestireno- empaquetamiento de la columna divinilbenceno Poros de titanio Original, perlas no porosas, partícula pelicular separación de biomoléculas proteícas Poro de la partícula 3 a 10 𝛍m Dra. Martha E. López  Principales tipos de HPLC HPLC en fase normal Utilizar suficiente adsorbente polar y eluyente no polar Dependiendo de la polaridad relativa del Sustancia polar en la solvente y la fase mezcla se adiere al adsorbente polar estacionaria ocurren dos variantes en el uso del HPLC Los No-polares pasarán más rápido a través de la columna Dra. Martha E. López  Principales tipos de HPLC HPLC en fase reversa Las moléculas polares pueden viajar a través de la columna más rápidamente por la Utiliza una superficie atracción entre el solvente polar adsorbente no-polar y y la molécula polar eluente polar Atracción entre HPLC en fase reversa compuestos no-polares es la más comunmente en la mezcla y utilizada adsorbente no polar Dra. Martha E. López  HPLC de fase normal Solventes fase móvil Adsorbentes fase estacionaria Hexano Dietil eter Heptano Enlazadas Tolueno Ciclohexano Tetracloruro Benzeno de carbono Dra. Martha E. López  HPLC de fase inversa Solventes fase móvil (polares) Fases enlazadas apolares: Acetonitrilo Etanol Agua Ácido Metanol acético Ácido Acetona fórmico Dra. Martha E. López  Formas de elución Dra. Martha E. López  Formas de elución Elución Separación en la que se utiliza solamente un disolvente o mezcla durante toda la corrida Isocrática cromatográfica. Se cambia la composición de la fase móvil a Elución en medida que pasa el tiempo. Se utilizan dos y gradiente a veces más disolventes que difieren significativamente en su polaridad. Dra. Martha E. López  Las bombas binarias permiten mezclar dos tipos solventes durante elución en gradiente Dra. Martha E. López  Las bombas cuaternarias permiten mezclar más de dos tipos solventes durante la elución en gradiente Los disolventes se mezclan en una cámara antes de llegar a la bomba Dra. Martha E. López  Métodos de programación de Solvente en HPLC Influencia de mezcla de disolventes La proporción de la mezcla de disolventes puede hacer que los analitos salgan más rápido y con resolución. Se prueba la mejor mezcla para la elución isocrática. Buffer/acetonitrilo 77:23 Buffer/acetonitrilo 84:16 Dra. Martha E. López  Métodos de programación de Solvente en HPLC La elución en gradiente permite tener componentes mejor resueltos en menor tiempo que una elución isocrática Dra. Martha E. López  Métodos de programación de Solvente en HPLC A=acetonitrilo B=100mM de TFA Elución en gradiente Dra. Martha E. López  Detector Dra. Martha E. López  Detector Crucial en Los detectores de HPLC Alta análisis de sensibilidad monitorean el eluido cuando trazas sale de la columna Respuesta Simplifica la rápida cuantificación Produce una señal electrónica proporcional a la concentración de cada componente separado Insensible al cambio en el tipo de solvente, flujo y temperatura Dra. Martha E. López  Detector Universal Absorbancia Fluoerescencia No-destructivo Insensible a la tempertura o fase móvil Índice de Disperción de la refracción luz operación continua Electroquímicos Seguro y fácil de usar Dra. Martha E. López  Detector Nombre Ventajas Desventajas UV-Vis DAD (detecetor de red diodos) Fluorescencia IR Indice refracción Dispersión Espectrometría de masas Electroquímica Dra. Martha E. López  Métodos de detección Basados en la medida de una propiedad del eluyente (índice de refracción, constante dieléctrica, densidad) Basados en la medida de una propiedad del soluto (absorbancia, fluorescencia, correinte límite) Absorbancia ultravioleta Índice de Propiedades del refracción Fluorescencia Propiedades soluto de la disolución Conductividad Electroquímicos Dra. Martha E. López  Detector de índice de refracción El índice de refracción (IR) de la fase móvil cambia por la presencia de cualquier soluto Una celda de vidrio se divide en dos cámaras separadas por una placa de vidrio montada a un ángulo de modo que si las dos disoluciones difieren en el IR se produce una desviación de un haz de luz incidente Responden a casi todos los solutos (universales) No resultan adecuados para trabajar en elución por gradiente donde la FM cambia (esto cambia el IR) Sensibles a milésimas de grado centígrado Dra. Martha E. López  Detector de UV-vis con arreglo de diodos (DAD) El detector de arreglo de diodos fue introducido a mediados de los años 70, es una variación de los detectores de la región ultravioleta-visible. El haz de radiación que atraviesa la muestra, es dispersado por medio de una red de difracción fija, siendo recogidas simultáneamente todas las longitudes de onda dispersadas mediante una matriz de fotodiodos, que generan una señal eléctrica que se procesa para dar datos de absorbancias. Se uso se limita a especies que absorben en el rango UV-VIS Dra. Martha E. López  Detector de UV-vis con arreglo de diodos (DAD) Al medir radiaciones con diferente longitud de onda, el DAD forma un patrón de absorción llamado espectro de absorción que es característico para cada tipo de analito ayudando a su identificación Dra. Martha E. López  Detectores electroquímicos Cualquier especie capaz de ser oxidada o reducida sobre un electrodo es susceptible de detección por vía electroquímica Fenoles, aminas, peróxidos y mercaptanos pueden detectarse por oxidación, mientras que hidrocarburos no saturados, cetonas, aldehídos y nitrocompuestos aromáticos pueden ponerse de manifiesto mediante procesos de reducción Especificidad, sensibilidad y amplia aplicabilidad para compuestos orgánicos Se requieren disolventes polares con electrolitos disueltos, y, además, en ocasiones, deben estar rigurosamente exentos de oxígeno Dra. Martha E. López  Detectores de conductividad Los detectores de conductividad son los más utilizados cuando los solutos eluidos son iónicos. La medida de la conductividad de los líquidos se lleva a cabo normalmente aplicando un potencial eléctrico entre dos electrodos, lo cual origina un movimiento de los aniones y cationes presentes en el seno de la disolución La resistencia (o la conductividad) de la disolución contenida entre los dos electrodos. Dra. Martha E. López  Detectores de fluorescencia Se basan en la capacidad de algunos solutos capaces de emitir fluorescencia, o de aquellos que no lo son pero pueden hacerlo tras un tratamiento adecuado (derivatización). Los compuestos fluorescentes absorben radiación y emiten radiación fluorescente a longitud de onda más larga (hidrocarburos cíclicos con dobles enlaces conjugados: quinoleínas, esteroides, alcaloides, ), son sensibles, pero responden a un limitado tipo de analitos Los detectores más sencillos utilizan una fuente de excitación de mercurio, y uno o más filtros para aislar la radiación fluorescente Dra. Martha E. López  DETECTOR DE DISPERSIÓN DE LUZ Se registra en continuo la luz dispersada por las partículas sólidas residuales después de la evaporación de la fase móvil del eluyente de la columna cromatográfica. Es considerado como un detector prácticamente universal ya que permite el registro de cualquier analito que sea menos volátil que la fase móvil y su límite de detección se encuentra entre 0.1 y 1 ng. La nube de partículas de analito pasa a través de un haz de láser y la dispersión producida es detectada por un fotodiodo de silicio. Este detector responde a todos los solutos menos volátiles que la fase móvil Dra. Martha E. López  Espectrómetro de masas Para acoplar el HPLC a un EM se usa una interface que permite eliminar el exceso de disolvente del eluato y vaporizar e ionizar el analito, hay diversas interfaces: Termovaporizador : se vaporiza el eluato y se ioniza químicamente, los iones son conducidos hacia el espectrómetro y el disolvente es expulsado. Interfase de ionización química a presión atmosférica (APCI): utiliza calefacción y nitrógeno para convertir el eluato en aerosol, del que se evapora el disolvente. Interfase de ionización por electronebulización : el eluato pasa a través de un capilar metálico, en cuya salida se aplica un fuerte campo eléctrico y una corriente de nitrógeno para formar un fino aerosol de partículas cargadas. Dra. Martha E. López  HPLC-Espectrómetro de masas Dra. Martha E. López  Comparación de detectores usados en HPLC Dra. Martha E. López  El Análisis Cuantitativo y cualitativo en HPLC Dra. Martha E. López  Curva de calibración Mediante HPLC se estudiaron varias A partir de la ecuación que relacIona la disoluciones de ibuorifeno de diferentes concentración con el área deL pico en las concentraciones, observandose los disoluciones patrón, podemos determinar las siguientes resultados concentraciones de ibuprofeno en las muestras de plasma de rata: Dra. Martha E. López  Cálculo de concentración de analitos Calcule la concentración de ibuprofeno en las diferentes muestras de sangre tomadas a diferentes tiempos Dra. Martha E. López  Aplicación de cromatografía HPLC quantification of doxorubicin in plasma and tissues of rats treated with doxorubicin loaded poly(alkylcyanoacrylate) nanoparticles Journal of Chromatography B, 887–888 (2012) 128–132 Cromatogramas de muestras de tejido (hígado, bazo, corazón y plasma,) recogidas de ratas tratadas, 24 h después de la administración de Dox-RREP. La Dox se eluyó a los 4.4 min y se separó bien de sus principales metabolitos doxorubicinol (Doxl) y doxorubicinon (Doxon) e idarubicina (Ida) utilizados como patrón interno (IS). Dra. Martha E. López  Aplicación de cromatografía Cromatograma de plasma de: (1) Ratas sin tratar (2) rata no tratada enriquecida con una mezcla de doxorrubicina (Dox) y sus metabolitos Dra. Martha E. López  Aplicación de cromatografía No hay metabolitos, sólo estándar Sin interno (IS) interferencia A) Cromatograma de: B) Cromatogramas de: 1) Tejido hepático de rata sin tratar 1) Plasma 2) tejido hepático no tratado enriquecido 2) Hígado 3) Bazo con Dox. 4) Tejido cardiac Dra. Martha E. López después de 24 h de administración de Dox  Simultaneous detection of seven phenolic acids in Danshen injection using HPLC with ultraviolet detector Xu et 728 al. / J Zhejiang Univ Sci B 2008 9(9):728-733 Danshensu (DSS) aldehído protocatecuico Ácido cafeico (CA) (PA) Ácido salvianólico B (SaB) Ácido salvianólico A (SaA) Ácido salvianólico D (SaD) Ácido rosmarinico (RA) Dra. Martha E. López  Simultaneous detection of seven phenolic acids in Danshen injection using HPLC with ultraviolet detector Xu et 728 al. / J Zhejiang Univ Sci B 2008 9(9):728-733 Se utilizó un sistema disolvente de acetonitrilo acuoso. (Agua (0.5% (v/v) ácido fórmico y acetonitrilo (0.5% (v/v)) fueron seleccionados como fase móvil en el experiment. A partir de los espectros UV des estos siete ácidos fenólicos (Fig.2), 280 nm para DSS y PA, 326 nm para CA, RA y SaD, y 286 nm para SaB y SaA, fueron seleccionadas como longitudes de onda Dra. Martha E. López  Simultaneous detection of seven phenolic acids in Danshen injection using HPLC with ultraviolet detector Xu et 728 al. / J Zhejiang Univ Sci B 2008 9(9):728-733 Dra. Martha E. López  Aplicación de HPLC Dra. Dra. Martha Martha E. E. López López  Aplicaciones Industria Control y estabilización farmaceútica de drogas Separación Control de de calidad en las moléculas farmaceúticas complejas Dra. Martha E. López  Aplicaciones Detección Ambiental de fenoles Biomonitor Detección de de la mercurio en contamina agua para ción beber Dra. Martha E. López  Aplicaciones Pruebas Determinación de esteroides forenses en sangre Orina Sudor Dra. Martha E. López  Aplicaciones Pruebas Análisis Clínicas de orina Detección de Análisis de neuropéptidos endógenos en antibiótico en fluido de sangre cerebro Dra. Martha E. López  Aplicaciones Medición Alimentos y de la calidad de sabores agua y bebidas Análisis de azúcar en jugos de frutas análisis de conservadores Dra. Martha E. López  Usos del HPLC Investigación en química y bioquímica Monitorear materiales de mezclas complejas para la salud Purificación de Análisis de pesticidas y uso compuestos químicos uso drogas Control de calidad Identificación de narcóticos Análisis de aire y agua Identificar la cantidad de contaminada compuestos en nuevos medicamentos o drogas Dra. Martha E. López  Usos del HPLC Hidrocarburos Aminoácidos Ácido fólico poliaromáticos Rango de trabajo para muestras líquidas 𝛍g L-1 mg L-1 Herbicidas Vitaminas formaldehído Rango de trabajo para muestras sólidas 𝛍g kg-1 𝛍g g-1 especies esteroides fármacos organometálicas Dra. Martha E. López