69.142-12.12.2019_Методи_контролю.pdf

17. Порівняйте явища флуоресценції і люмінесценції. 18. Зазначте основні компоненти та охарактеризуйте принцип дії флуориметра. 19. На якому явищі заснований такий метод аналізу як інфрачервона спектроскопія? 20. Охарактеризуйте галузі застосування інфрачервоної спектроскопії....

17. Порівняйте явища флуоресценції і люмінесценції. 18. Зазначте основні компоненти та охарактеризуйте принцип дії флуориметра. 19. На якому явищі заснований такий метод аналізу як інфрачервона спектроскопія? 20. Охарактеризуйте галузі застосування інфрачервоної спектроскопії. 4. ХРОМАТОГРАФІЧНІ МЕТОДИ АНАЛІЗУ 4.1. Суть хроматографічного методу Хроматографія поєднує в собі як способи концентрування і розділення, так і способи ідентифікації та кількісного визначення різноманітних речовин. Розділення компонентів суміші у хроматографічній системі зумовлене їх різним утримуванням у нерухливій фазі. Якщо як нерухливу фазу взяти подрібнений сорбент – речовину, яка поглинає компоненти суміші, і наповнити ним скляну чи металеву трубку, а просування рухливої фази (рідини чи газу) здійснювати за рахунок різниці тиску на кінцях цієї трубки, то ця трубка буде представляти собою хроматографічну колонку. Нерухлива фаза – це твердий адсорбент із розвиненою поверхнею або плівка рідини, адсорбційно закріплена на твердому носії; рухлива фаза – потік газу або рідини, який проходить (фільтрується) крізь шар сорбенту. Хроматографія – процес, заснований на багаторазовому повторенні процесів сорбції й десорбції речовини при переміщенні її в потоці рухливої фази уздовж нерухливого сорбенту. Розділення складних сумішей хроматографічним способом засноване, в основному, на різній здатності до сорбції компонентів суміші. У процесі хроматографування рухлива фаза (елюент), що містить аналізовану пробу, переміщається через нерухливу фазу. При цьому відбувається багаторазове повторення актів сорбції - десорбції, що є характерною рисою хроматографічного процесу й обумовлює ефективність хроматографічного розділення. Будь-яка хроматографічна система базується на розподілі компонентів між двома фазами, з яких одна нерухлива (стаціонарна) з великою поверхнею, а друга переміщується відносно першої (рухлива). Як нерухлива фаза використовується тверда речовина або рідина, що наноситься на твердий носій. Компоненти, що розділяються, разом з рухливою фазою (рідиною або газом), проходять крізь нерухливу. Розділення речовин пов'язане з сорбційно-десорбційним процесами і можливе тільки у випадку, якщо стаціонарна фаза — сорбент (поглинач — тіло або рідина, які застосовуються для поглинання будь-яких речовин з розчинів або газів) — характеризується різною сорбційною здатністю щодо кожної з речовин, що розділяються. При цьому під сорбцією розуміють будь-який процес, пов'язаний з накопиченням того чи іншого компонента в нерухливій фазі або на межі розділу фаз. 48  Простота, ефективність й універсальність хроматографічних методів дали можливість широко використовувати їх в різних галузях науки, промисловості й техніки. За допомогою хроматографічних методів можливо:  розділяти складні суміші органічних і неорганічних речовин на окремі компоненти;  розділяти і виділяти рослинні, тваринні й мікробні пігменти та інші речовини;  очищати речовини від домішок;  концентрувати речовини із сильно розведених розчинів;  визначати молекулярну структуру деяких сполук шляхом установлення зв'язку між здатністю до сорбції й будовою даної речовини;  визначати якісний і кількісний склад досліджуваної речовини. 4.2. Класифікація хроматографічних методів аналізу У сучасній хроматографії для розділення речовин крім молекулярної адсорбції використовують й інші фізико-хімічні явища. Є кілька класифікацій, заснованих на різних принципах. Методи хроматографії розподіляють за метою проведення, агрегатним станом фаз та за технікою виконання: за метою проведення (аналітична, препаративна, промислова): аналітична хроматографія призначена для очистки та ідентифікації компонентів досліджуваних сумішей; препаративна хроматографія – метод очистки невеликих кількостей індивідуальних компонентів суміші в лабораторних умовах; промислова хроматографія – використовується для очистки речовин у промисловості. за технікою виконання (площинна, колонкова, капілярна): площинна хроматографія - нерухлива фаза у вигляді спеціального паперу або тонкого шару сорбента нанесеного на пластинку; колонкова хроматографія - розділення проводиться в спеціальних колонках де знаходиться нерухлива фаза; капілярна хроматографія - розподіл проходить в плівці рідини або шару сорбента, що знаходиться на внутрішній стінці капіляра. за агрегатним станом рухливої і нерухливої фаз: рідинна хроматографія РХ (якщо рухлива фаза рідка) газова хроматографія ГХ (якщо рухлива фаза газоподібна). Рідинну хроматографію у свою чергу можна розділити залежно від агрегатного стану нерухливої фази на твердо- рідиннофазну хроматографію (ТРХ) – нерухлива фаза тверда й рідинно-рідиннофазну хроматографію (РРХ) – нерухлива фаза рідка. РРХ часто називають розподільною хроматографією. Газову хроматографію залежно від агрегатного стану нерухливої фази ділять на 49 газоадсорбційну (ГТХ, ГАХ) і газорідинну (ГРХ) або газорозподільну. Отже, перше слово в цій класифікації характеризує агрегатний стан рухливої фази. За механізмами розділення, тобто за характером взаємодії між сорбентом і сорбатом. За цією класифікацією хроматографію підрозділяють на наступні види: адсорбційна хроматографія – розділення засноване на відмінності в адсорбованості речовин, що підлягають розділенню, твердим адсорбентом; розподільна хроматографія – розділення засноване на відмінності в розчинності речовин, що підлягають розділенню, у нерухливій фазі (газова хроматографія) і на відмінності в розчинності речовин, що підлягають розділенню, у рухливій і нерухливій рідких фазах (рідинна хроматографія); іонообмінна хроматографія – розділення засноване на відмінності в здатності речовин, що підлягають розділенню, до іонного обміну; проникаюча хроматографія – розділення засноване на відмінності в розмірах або формах молекул речовин, що підлягають розділенню, наприклад, при застосуванні молекулярних сит (цеолітів); осадова хроматографія – розділення засноване на утворенні різних за розчинністю осадів із сорбентом речовин, що підлягають розділенню; адсорбційно-комплексоутворювальна хроматографія – розділення засноване на утворенні координаційних сполук різної міцності у фазі або на поверхні адсорбенту; афінна хроматографія – заснована на біоспецифічній взаємодії компонентів з афінним лігандом; ексклюзійна хроматографія – розділення засноване на відмінності у проникності молекул речовин, що підлягають розділенню, у нерухливу фазу. Компоненти елюються в порядку зменшення їх молекулярної маси. Слід мати на увазі, що дуже часто процес розділення протікає за декількома механізмами. За технікою застосовування:  колонкова хроматографія - розділення речовин проводиться в спеціальних колонках;  площинна хроматографія: o паперова - розділення речовин проводиться на спеціальному папері; o тонкошарова - розділення речовин проводиться в тонкому шарі сорбенту.  капілярна хроматографія - розділення відбувається в плівці рідини або шарі сорбенту, розміщеному на внутрішній стінці трубки. 50  У колонковій і тонкошаровій хроматографії можна використовувати кожний з наведених вище механізмів розділення, у паперовій хроматографії найчастіше застосовують розподільний і іонообмінний механізми. За способом відносного переміщення фаз розрізняють фронтальну, або елюентну, і витискову хроматографію. За фронтального аналізу досліджуваний розчин суміші речовин безупинно подають у верхні частини колонки й збирають окремі фракції фільтрату. У процесі аналізу системи, що містить компоненти А і Б, першим з колонки випливає чистий розчинник; потім після насичення сорбенту речовиною з меншою сорбційною здатністю, наприклад Б, з колонки випливає розчин, що містить компонент Б; коли ж сорбент насичується компонентом А, у приймач надходять одночасно два компоненти А і Б. Зазначеним способом може бути отримане в чистому виді тільки речовина з найменшою сорбційною здатністю (у нашому прикладі – речовина Б). Повного розділення досліджуваної суміші на компоненти не досягається. За витискового аналізу в колонку уводять порцію розчину суміші, що містить компоненти А і Б, або багатокомпонентну суміш і за допомогою речовини В, що має більшу сорбційну здатність, витісняють раніше сорбовані компоненти А і Б. Уведена речовина В витісняє компонент А, який витісняє компонент Б з меншою сорбційною здатністю. Відбувається переміщення речовин А і Б уздовж шару сорбенту зі швидкістю, рівною швидкості руху витискувача В. З колонки послідовно виходять компоненти Б і А відповідно до їхньої вибіркової сорбованості на сорбенті. Між зоною першого й наступного компонента утворюється проміжна зона, що містить суміш цих компонентів. Повнота розділення речовин залежить від умов проведення аналізу. За елюентного аналізу в колонку вводять порцію досліджуваної суміші компонентів, наприклад А, Б, В. Компоненти суміші розташовуються уздовж колонки зверху вниз у зонах, що перекриваються, відповідно до сорбційної здатності, наприклад, нижня зона хроматограми в колонці містить чисту речовину В. У процесі промивання сорбенту розчинником уздовж колонки відбувається пересування компонентів суміші внаслідок взаємного витиснення відповідно до сорбційності. У фільтраті збирають компоненти в порядку підвищення їх сорбційності, тобто спочатку компонент В, потім Б і А. Загалом речовини в суміші можуть розділятися за рахунок встановлення:  рівноважного розподілу між нерухливою рідкою і рухливою рідкою фазами (протиточний розподіл та паперова хроматографія) або між нерухливою рідкою і рухливою газовою фазами (газорідинна хроматографія);  адсорбційної рівноваги між нерухливою твердою і рухливою рідкою фазами (адсорбційна хроматографія);  іонообмінної рівноваги між іонообмінною смолою (нерухлива фаза) та електролітом (рухливою фазою) (іонообмінна хроматографія); 51   рівноважного зв'язування біомакромолекули з малою молекулою (лігандом) відносно якої вона виявляє специфічну спорідненість (афінна хроматографія);  рівноваги між рідкою фазою на внутрішній та зовнішній поверхні пористої структури (гель) (молекулярна-ситова, або проникаюча, хроматографія). На перший погляд іноді не просто зорієнтуватись в різноманітності методів хроматографії та їхніх назв, і часом важко надати переваги тому чи іншому методу або його модифікації. У табл. 4.1 наведено основні критерії та види методів хроматографії, що дозволяють скласти уявлення про їхню класифікацію, наведену на рис. 4.1. Таблиця 4.1. Класифікація методів хроматографії за різними ознаками № п/п Критерії Види методу Варіанти методу На колонці Адсорбційна Тонкошарова Газорідинна Розподільна На папері За принципом (адсорбційна) В тонкому шарі фракціонування та Гель-проникаюча (молекулярно- 1 фізико- хімічної ситова) взаємодії адсорбента На колонці та речовини Іонообмінна На папері Гель-фільтрація Проникаюча Гель-фільтрація в тонкому шарі Афінна На колонці На папері За природою та На колонці 2 розташуванням На плівці нерухливої фази В тонкому шарі В товстому шарі Рідинна Залежно від 3 Газова агрегатного стану фаз Газорідинна Проявна На колонці 4 За способом елюції (елюентна) На колонці Фронтальна На колонці Вигискувальна За апаратним На колонці 5 оформленням або На папері розміщенням Площинна В тонкому шарі 6 За напрямком руху Низхідна елюента Висхідна 52 Рис. 4.1. Класифікація хроматографічних методів аналізу 53  4.3. Хроматограма та її характеристики У сучасній хроматографії хроматограма – це графік залежності величини аналітичного сигналу (чи концентрації речовини/речовин) від часу проведення аналізу або об’єму рухомої фази. Хроматограма може містити одну і більше кривих елюювання окремих компонентів (залежно від складу суміші). Криві елюювання ще називають хроматографічними піками. Хроматограма є аналітичним сигналом у хроматографічних елюентних методах аналізу. Розглянемо на прикладі газової хроматографії. Газові хроматографи дають можливість фіксувати сигнал на виході з колонки на рухомій паперовій стрічці (діаграмі). На рис.4.2. зображено криву елюювання одного компонента. За відсутності проби через колонку проходить тільки газ-носій і реєстратор настроюється таким чином, що перо самописця виписує пряму лінію АВ, паралельну краю діаграми. Ця пряма називається базовою лінією. Після введення в деякий момент часу A у колонку за допомогою дозатора порції аналізованої суміші, вона проходить крізь шар нерухомої фази. Якщо компоненти суміші мають різні сорбційні властивості, вони просуваються вздовж колонки з різними швидкостями і через деякий час з колонки будуть виходити бінарні суміші газу-носія з розділеними компонентами суміші. Зміна складу газу зумовлює відхилення пера самописця від базової лінії, і вихід компонентів буде зафіксовано у вигляді хроматографічних піків (рис. 4.2). Рис. 4.2. Вигляд хроматограми та її характеристики Основні параметри хроматограми (елююційні характеристики) – об’єм утримування і час утримування, є якісними характеристиками речовин, що хроматографуються, і використовуються для ідентифікації компонентів в складній суміші. Якісний аналіз оснований на вимірюванні цих величин, окільки параметри утримування хроматографічних піків не залежать від концентрації компонентів. 54  Оскільки колонка має незаповнений адсорбентом простір, то для точного визначення часу і об’єму утримування компонента суміші необхідно враховувати час і об’єм утримування газу-носія. Для цього в пробу спеціально додається речовина, яка не має здатності сорбуватися в нерухливу фазу – інертний компонент, наприклад, коли газом-носієм є азот, то додають гелій. Характеристики хроматограми 1. Параметри утримування інертного компонента. а) час утримування інертного компонента t0 – час, який інертний компонент проходить від моменту введення проби до виходу; б) об'єм утримування інертного компонента V0: 2. Параметри утримування компонента суміші. а) час утримування компонента tr – час, який проходить від моменту введення проби до виходу на хроматограмі максимуму концентрації компонента. В цьому випадку речовина повинна пройти не тільки вільний об'єм колонки, але і частину об'єму нерухомої фази, в якій вона сорбується; б) об'єм утримування компонента Vr – об'єм газу-носія, який проходить через колонку від моменту введення проби до виходу на хроматограмі максимуму концентрації компонента; в) питомий виправлений об'єм утримування Vпит – виправлений об'єм утримування, приведений до 0 ºС і віднесений до одиниці маси сорбенту для виключення впливу на величину виправленого об'єму утримування геометричних розмірів колонки. 3. Розмір хроматографічного піка. Для кількісного хроматографічного аналізу важливо знайти площу хроматографічних піків компонентів суміші, так як площа під піками пропорційна масі компонента в суміші (при використанні концентраційного детектора, тип детектора дуже важливий). S – площа хроматографічного піка (площа фігури, обмеженої лінією піку і продовженням базової лінії, визначається як добуток висоти піка на його ширину, виміряну на половині висоти). Якісний хроматографічний аналіз, тобто ідентифікація речовини за його хроматограмою, може бути виконаний порівнянням хроматографічних характеристик, знайдених за певних умов для компонентів аналізованої суміші і для еталону. Найчастіше варіантом таких характеристик є утримуваний об’єм – об’єм рухливої фази, пропущеної через колонку від початку введення суміші до появи даного компонента на виході з колонки. Кількісний хроматографічний аналіз проводять зазвичай на спеціальному приладі – хроматографі. Метод заснований на вимірюванні різних параметрів хроматографічного піка, що залежать від концентрації речовин, що піддаються хроматографії – висоти, ширини, площі й утримуваного об’єму або добутку утримуваного об'єму на висоту піка. 55  4.4. Рідинна хроматографія Рідинна хроматографія – це метод розділення, в якому рухливою фазою є рідина, а нерухливою фазою – тонкодисперсна тверда речовина або рідина, нанесена на твердий носій. Рухлива фаза (розчинник) постійно надходить в колонку протягом всього часу роботи рідинного хроматографа. Нерухлива фаза (адсорбент) вноситься в колонку перед початком проведення хроматографії. Рідинна хроматографія заснована на механізмах адсорбції, розподілу, іонного обміну або розподілу за розмірами молекул. Будова рідинного хроматографа представлена на рис.4.3. Рис. 4.3. Блок-схема рідинного хроматографа: 1 – ємність з елюентом; 2 – насос; 3 – дозатор; 4 – колонка; 5 – термостат; 6 – детектор; 7 – реєстратор. Ємність (1) - призначена для елюента, який надходить в колонку протягом всього часу хроматографічного розділення. Насос (2) призначений для створення постійного потоку елюента, що міститься у ємності (1). Дозатор (3) забезпечує введення проби у колонку. За допомогою насоса (2) розділювана суміш в потоці елюента прокачується через колонку (4), де проходить її розділення на окремі компоненти. Елюат на виході з колонки містить окремі компоненти суміші, які подаються на детектор. Термостат (5) забезпечує важливий контрольований параметр – температуру хроматографічної колонки. У рідинній хроматографії найчастіше застосовують повітряні термостати. Звичайний діапазон температур становить 35…90° С. Детектори (6) для рідинної хроматографії мають проточну кювету, в якій відбувається безперервне вимірювання певної властивості елюента. Електричний сигнал від детектора через підсилювач, подається на реєстратор (7), що розраховує площу одержуваних піків та визначає концентрацію компонента. У сучасних хроматографічних системах використовується блок, що з'єднує хроматограф з персональним комп'ютером, який здійснює збір та обробку інформації. Параметри, які лписують режим роботи рідинного хроматографа:  швидкість потоку елюента (рухлива фаза) – 0,05… 20 мл / хв  тиск – 40 МПа 56   об'єм проби  характеристика детектора (принцип роботи, об'єм кювети та ін.)  характеристика термостата (діапазон температур та ін.) 4.4.1. Колонки для рідинної хроматографії. Типова колонка (рис.4.4) складається з скляного циліндра діаметром від 1 см до 0,5 м і довжиною від 10 см до кількох метрів, в залежності від її призначення для аналітичного, препаративного або промислового розділення суміші речовин. Матеріалом для виготовлення колонок служить скло, нержавіюча сталь, мідь, іноді фторопласт. На колонках різного діаметру та довжини можна розділити як мікрограми, так і кілограми речовини. У промисловості використовують колонки діаметром до 0,5 м, на яких можна проводити розділення кількох тон речовини, лабораторні колонки можуть розділити від 100 мг до 10 г речовини. Колонка має внизу кран для регуляції швидкості процесу та резервуар у верхній частині колонки для елюента. Принцип роботи колонки. Резервуар у верхній частині колонки заповнюється рідким елюентом, а на поверхню нерухливої фази наносять пробу. Через колонку проходить суміш для розділення, що знаходиться у розчині. В результаті взаємодії з сорбентом молекули компонентів суміші проходять через колонку з різною швидкістю і поступово розділяються. Однорідні компоненти збираються у різних частинах колонки у вигляді зон. Після того, як Рис. 4.4. кожна зона досягне дна колонки, їх збирають окремими Хроматографічна фракціями. При цьому в даних фракціях визначають колонка концентрацію очікуваних речовин. Для збору окремих компонентів використовують лабораторних посуд або колектор фракцій. Основні параметри колонки це її внутрішній діаметр та довжина, матеріал, з якого вона виготовлена. Розміри колонок залежать від кількості поділюваних речовин і виду хроматографії. Можуть бути високі і вузькі колонки, в деяких видах хроматографії (іонообмінна) висота колонки наближаєтся до її діаметра (табл. 4.2). 4.4.2. Нерухлива фаза. Нерухливі фази або сорбенти можна розділити на дві групи: 1. Жорсткі сорбенти, стійкі до високих тисків, на основі модифікованих або немодифікованих силікагелей і синтетичних сополімерів з великою кількістю поперечних зв’язків (силікагель, оксид алюмінію, мікрокристалічна целлюлоза, агароза та інші матеріали, виготовлені шляхом спеціальної обробки). 2. М'які сильно драглисті гелі, чутливі до тиску, на основі природних і синтетичних полімерів з малою кількістю поперечних зв’язків. 57  Таблиця 4.2. Характеристика колонок для рідинної хроматографії Призначення Матеріал Розміри колонок колонки Аналітичне Нержавіюча сталь Внутрішній розмір розділення частіше всього 4 × 125 мм або 4 × 250 мм Препаративне Сталь (для розділення за Діаметр 205 мм, 306 мм; розділення високого тиску), скло, довжина: 300, 500, 750, пластмаса (для розділення за 1000 і 1500 мм. середнього і низького тиску) Для хроматографічних систем низького тиску Промислове Скло, нержавіюча сталь, мідь, Діаметр біля 0,5 м розділення іноді фторопласт. Довжина 30-60 м На сьогодні дуже поширені капілярні колонки, виготовлені з плавленого кварцу. 4.4.3. Рухлива фаза. Використовують суміш розчинників або чисті розчинники (дихлорметан, етилацетат, ацетон). Використовують легкі вуглеводні (гексан, гептан, ізооктан, циклогексан) з додаванням невеликих кількостей хлороформу (СНСl3), ізопропанолу, ефіру. Суміш компонентів, що розділяються, рухається у потоці елюенту під тиском або під дією сили тяжіння. Вимоги до елюентів: повинні мати низьку в’язкість, забезпечувати необхідний рівень селективності, бути дешевими, нетоксичними, інертними. 4.4.4. Системи термостатування колонки. Температура хроматографічної колонки є дуже важливим контрольованим параметром у хроматографії. Більшість розділень здійснюються за температури довкілля. Стабілізація температури також підвищує точність кількісних визначень, тому використання термостатів бажане, а іноді обов’язково. Використання підвищених температур в ізотермічному режимі аналізу змінює селективність розділення, сприяє зниженню в’язкості розчинника (знижуючи тим самим робочий тиск у хроматографічній системі), дозволяє збільшити ефективність колонки. У рідинній хроматографії найчастіше застосовують повітряні термостати з інтенсивною циркуляцією повітря, в яких розташовані теплообмінник для підігрівання розчинника, дозатор і колонки. Звичайний діапазон температур складає від 35…90° С. У сучасних приладах 58 температурний контроль повністю автоматизований і здійснюється за допомогою мікропроцесора. 4.4.5. Детектори для рідинної хроматографії. Детектор – це прилад, який реагує на зміну фізичних або фізико-хімічних властивостей елюата на виході з колонки і передає ці дані реєстратору. Під час проходження елюата через детектор на стрічці реєстратора записується горизонтальна (базова) лінія. Якщо в елюаті міститься компонент досліджуваної суміші реєстратор записує пік, час виходу якого є індивідуальною характеристикою кожного компонента, а площа піка пропорційна кількості даного компонента в досліджуваній суміші. Для визначення вмісту компонентів аналізованої суміші детектори калібрують розчинами відомого складу та концентрації. Принцип дії детекторів для рідинної хроматографії заснований на такій властивості речовини, якої не має рухлива фаза. Єдиного універсального детектора для рідинної хроматографії не існує. Ультрафіолетовий детектор. Найбільш поширений і високочутливий, в якому аналізовані речовини детектуються шляхом вимірювання кількості випромінювання, що поглинається при проходженні світла через проточну кювету детектора. Детектор використовують на певних довжинах хвиль. Флуоресцентний детектор (ФЛД) є другим за популярністю детектором в рідинній хроматографії після ультрафіолетового. Принцип дії ФЛД заснований на вимірі не поглиненого, а випроміненого молекулами світла. Молекули деяких сполук випромінюють частину поглиненої радіації (зазвичай в видимому діапазоні) в формі світла нижчої енергії, з більшою довжиною хвилі. Це випромінювання може бути виміряне і використане для визначень концентрації речовини. Спектрофотометричні детектори визначають оптичну густину розчинника при фіксованій довжині хвилі в ультрафіолетовій області спектра. Рефрактометричний детектор. Найбільш популярний тип детекторів загального призначення, що вимірюють показник заломлення. Принцип дії рефрактометричного детектора оснований на диференціальній зміні показника заломлення чистого розчинника та аналізованого розчину. Електрохімічні детектори. Принцип дії заснований на визначенні електрохімічних характеристик елюату після хроматографічної колонки. Розрізняють детектори, які реагують на зміну властивостей елюату, або на конкретний компонент елюату. До першого типу належить кондуктометричний детектор, до другого – амперометричний. Кондуктометричний детектор вимірює електропровідність елюату. Іноді елюат після колонки піддають УФ опроміненню і визначають іонізовані продукти деструкції. При створенні різниці потенціалів іони, що знаходяться в розчині, починають переміщатися у напрямку до протилежно заряджених електродів. Провідність залежить від числа заряджених частинок в розчині. 59  Вольтамперометричний детектор вимірює електричний струм у кюветі, що виникає при окисненні-відновленні аналізованої суміші на поверхні робочого електроду при поданні на нього певної напруги. Полярографічний детектор вимірює силу струму між поляризованим і неполяризованим електродами в умовах заданої постійної різниці потенціалів. У результаті прикладеної напруги сорбат, що потрапив у кювету детектора окиснюється або відновлюється. У кулонометричному детекторі аналізовані речовини електризуються повністю на відміну від вольтамперометричного. 4.5. Високоефективна рідинна хроматографія Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) – це аналітична методика, що використовується для розділення, ідентифікації або кількісного визначення кожного компонента в суміші. Суміш розділяють із використанням основного принципу колонкової хроматографії, а потім ідентифікують і визначають кількісно за допомогою спектроскопії. В 1960-х роках колонкова рідинна хроматографія з її придатними для низького тиску скляними колонками була удосконалена до ВЕРХ із адаптованими до високого тиску металевими колонками. ВЕРХ, таким чином, являє собою високоефективну форму колонкової рідинної хроматографії. Замість того, щоб розчиннику давати капати через стовпчик під дією сили тяжіння, було запропоновано подавати елюент (рухливу фазу) під високим тиском – до 40 МПа і більше для прискорення процесу хроматографії. Висока ефективність розділення в хроматографічній колонці досягається в результаті використання мікрозернистих твердих носіїв, однорідних за розмірами зерна. Зерна в колонках для ВЕРХ дуже дрібні, діаметром до 10 мкм (10−3мм). Активна зона розташована на поверхні цих зерен і має товщину близько 0,1…0,3 мкм. Проте колонки, наповнені такими мікрозернистими твердими носіями, чинять великий опір потоку рідини. Тому для пропускання через них рухливої рідкої фази потрібно високі тиски. З цієї причини ВЕРХ називається також рідинною хроматографією високого тиску. Високий тиск забезпечує значну швидкість проведення процесу і знижує коефіцієнт молекулярної дифузії. Модернізація апаратури, що застосовується в класичній рідиній колонковій хроматографії (рис. 4.5), зробила ВЕРХ одним з перспективних і сучасних методів аналізу. 60  Рис. 4.5. Складові системи ВЕРХ Переваги ВЕРХ :  великий діапазон молекулярних мас речовин, що розділяються;  висока ефективність розділення;  висока швидкість проведення аналізу;  точність кількісного розділення суміші на компоненти;  висока чутливість методу. Застосування. ВЕРХ – фармакопейний метод аналізу, рекомендований для контролю якості субстанцій, лікарської рослинної сировини, готових лікарських засобів за рядом показників якості (вміст домішок, кількісне визначення, однорідність вмісту, розчинення). 4.5.1. Апаратура ВЕРХ. У рідинній хроматографії високого тиску використовують прилади різного ступеня складності – від найбільш простих систем, до хроматографів високого класу, виготовлених з дорогих метеріалів. На рис. 4.6 показана схема сучасного хроматографа для високоефективної рідинної хроматографії, що містить мінімально необхідний набір складових частин, у тому або іншому виді присутніх у будь-якій хроматографічній системі. Як резервувар для елюента (розчинника, рухливої фази) найчастіше використовують скляні ємності місткістю 0,7…1 л. Велике значення має ретельна дегазація рухливої фази. Важливо виконувати цю операцію 61 безпосередньо в посуді, щоб виключити переливання розчинника. Рис. 4.6. Обов’язкові складові апаратурного забезпечення системи ВЕРХ: 1- резервуар з розчинником (елюентом) і вхідним фільтром; 2 - насоси з датчиком тиску; 3 - трубопровід високого тиску; 4 - ручний або автоматичний інжектор - автосемплер; 5 - захисна передколонка; 6 - термостат; 7 - аналітична колонка; 8 - постколоночний реактор або блок пост- колоночної дериватизації; 9 - детектор; 10 - обладнання збору і обробки даних; 11 - резервуар для відпрацьованого розчинника. Сучасні насоси для рідинної хроматографії являють собою обладнання, що забезпечує постійну подачу розчинника в колонку і здатне створювати тиск більше 100 МПа та забезпечити хроматографічне розділення. Конструкція насоса визначається робочим тиском у системі. Насос також повинен мати можливість забезпечувати постійний тиск за будь-яких умов і контрольовану й відтворювану швидкість потоку. Більшість насосів, використовуваних у сучасних системах ВЕРХ, створюють потік шляхом руху поршня із приводом від двигуна (поршневі насоси). Через ці рухи поршня він створює «імпульси». Інжектори (система введення проби) забезпечують уведення проб від 0,1 мкл до декількох мл з високою відтворюваністю за умови тиску до 30…50 МПа. Інжектори повинні працювати в умовах підвищених температур, у середовищі активних розчинників і реагентів. Найпростіший спосіб інжектування – використовувати шприц, яким зразок уводиться в потік елюента. Найбільше широко використовуваний метод уведення заснований на петлях відбору проб. Також широко використовується система автосемплера (автоінжектора), яка дозволяє проводити повторні ін’єкції у встановлений час. Колонка являє собою товстостінну трубку виготовлену з металів, стійких до дії агресивних середовищ (легованої сталі, оксиду цирконію, 62 титану і т.д.) або із кварцового скла з полірованими внутрішніми стінками (рис.4.7). Рис.4.7. Колонка для ВЕРХ За розмірами колонки для ВЕРХ поділяються на:  капілярні (діаметр колонки 0,18…0,5 мм, довжина від 5 см до 55 м);  мікроколонки (діаметр колонки < 2 мм);  аналітичні (діаметр колонки 2…6 мм, довжина 5…25 см);  напівпрепаративні (діаметр колонки 7…10 мм),  препаративні (діаметр колонки 10…40 мм, довжина 10…30 см);  великомасштабні препаративні (діаметр колонки > 40 мм). Колонки здатні витримати високий тиск в залежності від умов проведення хроматографії від 4…6 МПа до 15…40 МПа. В деяких випадках умови проведення хроматографії вимагають тиску до 80 МПа і більше. Існує кілька типів колонок: картріджні, аналітичні, препаративні та ін. Промисловість випускає кілька десятків різних конструкцій колонок. Об’єм проби, що вводиться в колонку хроматографа ВЕРХ, зходиться у діапазоні від 5 до 75…100 мкл. Селективність колонки залежить від двох факторів: пружності парів компонентів суміші і коефіцієнта активності парів у рідкій фазі. При розчиненні суміші речовин пружність парів над розчином прямо пропорційна коефіцієнту активності, молярній частці в розчині й тиску парів чистої речовини при даній температурі. Концентрація кожного компонента в рівноважній паровій фазі визначається його парціальним тиском над розчином. Чим нижча температура кипіння речовини, тим слабше втримується вона у хроматографічній колонці. Використання підвищених температур покращує ефективність колонки, змінює селективність розділення, сприяє зниженню в’язкості розчинника, знижуючи тим самим робочий тиск у хроматографічній системі, дозволяє збільшити ефективність колонки. Час утримання компонентів проби зменшується на 1…3% зі збільшенням температури колонки на 1 градус. 63  Час проведення одного аналізу в ВЕРХ становить 10…15 хвилин. При застосуванні у складі рухливої фази іон-парних реагентів, час аналізу може досягати 45 хвилин. Термостат забезпечує постійну температуру колонки. Стабілізація температури підвищує точність кількісних визначень, тому використання термостатів досить бажане, а іноді і обов’язкове. Більшість процесів розділення у ВЕРХ здійснюються при температурі 35…90°С. Для проведення ВЕРХ достатнім є діапазон термостатування до 100°С. В окремих випадках, зокрема в ексклюзійній хроматографії деяких синтетичних полімерів, необхідно підтримувати температуру до 150°С. Сучасні хроматографи характеризуються стабільною підтримкою температури від кімнатної до 200…400°С. Температура, при якій відбувається хроматографічний процес, впливає на ефективність, на стабільність часу утримання речовин і на тиск в хроматографічній системі. Підвищення температури, окрім одночасного зниження тиску в системі, дозволяє підвищити ефективність розділення. Найчастіше застосовують повітряні термостати з інтенсивною циркуляцією повітря, у яких розташовані теплообмінник для підігріву розчинника, дозатор і колонка. Для забезпечення безпеки роботи термостат продувають азотом і часто встановлюють у ньому датчики, що реагують на появу парів органічних розчинників. Детектор реєструє вихід з колонки окремого компонента суміші. Для реєстрації можна використовувати зміну будь-якого аналітичного сигналу, що іде від рухливої фази і пов’язаний з природою і кількістю компонента суміші. У рідинній хроматографії використовують аналітичні сигнали світлопоглинання або світлопропускання променя, що проходить через вихідний розчин (фотометричні й флуориметричні детектори), показник заломлення (рефрактометричні детектори), потенціал і електрична провідність (електрохімічні детектори) та ін. УФ - детектор. Найчастіше застосовують ультрафіолетові детектори, оскільки більшість органічних речовин поглинає світло при 210 нм (С=О) та 250 нм (ароматичні кільця). Флуориметричний детектор реєструє флуоресцентне випромінювання поглиненого світла. Поглинання проводять в УФ-області спектра при максимальній довжині хвилі для даної групи речовин, а випромінювання вимірюють на виході фільтра, що не пропускає промені збудження. Довжини хвилі флуоресцентного випромінювання завжди перевищують довжини хвиль поглиненого світла. У зв'язку з тим, що детектування ведеться від нульової інтенсивності флуоресценції, даний тип детектора більш чутливий у порівнянні з детекторами поглинання (УФ-детекторами). Електрохімічні детектори налаштовані на визначення електрохімічних властивостей сполуки у потоці елюента. Розрізняють детектори, які реагують на зміну властивостей елюата, або на конкретний 64 компонент суміші, що розділяється. До першого типу належить кондуктометричний детектор, до другого – амперометричний. Більшість електрохімічних детекторів працюють в амперометричному режимі, за якого підтримується постійна напруга між двома електродами, зануреними у потік елюента, і реєструється залежність сили струму від часу. Електрохімічні детектори використовуються для детектування речовин, які легко окиснюються або відновлюються: феноли, меркаптани, аміни, ароматичні нітро- і галогенпохідні, альдегіди кетони, бензидини. Рефрактометричні детектори є універсальними на відміну від фотометричних, що реагують тільки на речовини, які поглинають світло. Вони особливо корисні, коли речовини не мають інтенсивного поглинання в УФ області, не флуоресціюють і не володіють електрохімічною активністю. Їх принцип дії заснований на диференціальному вимірюванні показника заломлення чистого розчинника і розчину аналізованої речовини в цьому розчиннику. Внесок розчиненої речовини у зміну показника заломлення розчинника пропорційний об’ємній концентрації цієї речовини, причому розчинник також є речовиною, що піддається детекції, оскільки має певний показник заломлення. Мас-селективні детектори. Принцип дії мас-селективних детекторів полягає в іонізації компонентів речовин. Різні вузли й деталі іонної оптичної системи фокусують і спрямовують потік іонів в аналізатор мас, у якому іони розділяються. Після чого іони реєструються як сигнали. Найбільш популярними типами детекторів загального призначення є рефрактометри, що вимірюють показник заломлення системи проба-елюент, і спектрофотометричні детектори (УФ-детектори), що визначають оптичну густину розчинника за фіксованою довжиною хвилі (як правило, в УФ області). Реєструюча система складається з диференціального підсилювача і прилада-реєстратора (раніше – самописця, нині – сучасного програмного засобу, що його замінив). Сучасна система обробки даних являє собою сполучений с хроматографом персональний комп’ютер із установленим програмним забезпеченням, що дозволяють реєструвати й обробляти хроматограмму, а також управляти роботою хроматографа й стежити за основними параметрами хроматографічної системи. Сигнал, що безперервно надходить від детектора, реєструється приладом-реєстратором. Хроматограма є зафіксованою послідовністю сигналів детектора, які утворюються у процесі виходу з колонки окремих компонентів суміші. У разі розділення суміші на хроматограмі одержуємо окремі піки. Положення піків на хроматограмі використовують для ідентифікації компонентів суміші, висоту або площу піку – для кількісного визначення даного компонента. Система обробки даних дозволяє повністю автоматизувати виконання аналізу: автоматичне настроювання детектора, завдання й контроль режимних параметрів, реєстрацію вихідних сигналів, обробку 65 експериментальних даних, включаючи ідентифікацію речовин, і видачу протоколів з результатами аналізу. 4.5.2. Рухлива та нерухлива фази у ВЕРХ. Рухлива фаза у ВЕРХ – рідина, склад якої підбирається, виходячи з хроматографічної характеристики досліджуваних речовин та способу детектування. Як рухливу фазу використовують чисті розчинники або їх суміші з високою елююючою здатністю (метанол і ацетонітрил) або речовини з меншою елююючою здатністю (водні розчини солей і кислот: натрієві і калієві солі фосфорної, оцтової або трифтороцтової кислот, водні розчини мурашиної, трифтор- чи трихлороцтової кислот), іон-парні реагенти та ін. Розчинники, що вживаються у ВЕРХ, повинні задовольняти наступним основним вимогам:  чистота;  хімічна інертність;  сумісність з детектором;  достатня розчинна здатність для аналізованих речовин;  низька в’язкість;  безпечність. Чистота розчинника в рідинній хроматографії має дуже велике значення, оскільки різні домішки у рухливій фазі впливають на основні стадії процесу : розділення у колонці, детектування і відтворюваність результатів. Нерухливою фазою може бути твердий сорбент, але може бути рідка речовина, що не змішується з рухливою фазою. У ВЕРХ використовується велика кількість типів нерухливих фаз:  силікагель, оксид алюмінію або пористий графіт, використовуваний у нормально-фазовій хроматографії, у якій розділення засноване на різниці в адсорбції й/або масовому розподілі (розподільна хроматографія);  велика кількість хімічно модифікованих носіїв, виготовлених з полімерів, силікагелю або пористого графіту, використовуваних у нормально-фазовій (адсорбційна хроматографія) і обернено-фазовій хроматографії, у якій розділення засноване на поділі молекул між рухливою й нерухливою фазою;  смоли або полімери, модифіковані кислотними або основними групами, використовувані в іонообмінній хроматографії, у якій розділення засноване на конкуруючій взаємодії між поділюваними іонами й іонами рухливої фази;  пористий силікагель або полімери, використовувані в ексклюзійній хроматографії, у якій розділення засноване на різниці в розмірах молекул, відповідних стеричній ексклюзії;  спеціальні хімічно модифіковані нерухливі фази, наприклад, похідними целюлози або амілози, білками й пептидами, 66 циклодекстринами тощо, використовувані для поділу енантіомерів (хроматографія на хіральних нерухливих фазах);  інші нерухливі фази, використовувані у високоефективних модифікаціях різних типів рідинної хроматографії. Основними характеристиками сорбентів є розмір частинок у мкм та розмір внутрішніх пор в Å або нм (1 Å = 0,1 нм). Розмір пор сорбентів є важливим параметром проведення ВЕРХ. Чим менше розмір пор, тим важче проникати молекулам компонентів суміші, а отже, тим менша ємність сорбентів. Сорбенти, що використовуються у ВЕРХ, ділять на кілька груп. Загальноприйнятим є поділ сорбентів на групи за хімічною природою матриці (основи) сорбенту, за методом хімічної обробки матриці, що робить її придатною для використання в певному виді хроматографії. Основні розчинники і адсорбенти для ВЕРХ наведено у таблиці 4.3. Таблиця 4.3. Розчинники і адсорбенти, найпоширеніші у ВЕРХ Розділювані Розчинники Адсорбенти речовини (рухлива фаза) (нерухлива фаза) Вуглеводні Етанол, ацетон, хлороформ, Силікагель, оксид алюмінію тетрахлорид вуглецю Спирти Хлороформ, діетиловий ефір, Активоване вугілля, діоксан, бензол силікагель, оксид алюмінію Феноли Етанол, діетиловий ефір, Оксид алюмінію, оксид бензол кальцію Альдегіди і Етиловий ефір, тетрахлорид Оксид алюмінію, оксид магнію, кетони вуглецю, бензол силікагель, тальк Карбонові Вода (для нижчих кислот), Активоване вугілля, оксид кислоти етанол бензол, гептан алюмінію, силікагель, тальк Естери Хлороформ, бензол, гексан, Активоване вугілля, оксид, тетрахлорид вуглецю алюмінію, силікагель Aміни, аміди Діетиловий ефір, бензол Силікагель, оксид алюмінію тетрахлорид вуглецю Вуглеводи Вода, етанол, хлороформ Активоване вугілля, силікагель, бензол оксид алюмінію Гетероциклічні Вода, етанол, ацетон Оксид алюмінію, силікагель, сполуки хлороформ, етиловий ефір, карбонат кальцію, тальк бензол Вітаміни Вода, етанол, бензол Оксид алюмінію, оксид магнію 67  Адсорбційні властивості силікагелів, що є висушеними гелями кремнієвої кислоти, залежать від кількості і концентрації на їх поверхні гідроксильних груп. Зміна хімічної природи поверхні силікагелів у результаті термічної дегідратації, регідратації або внаслідок заміщення на різні атоми або органічні радикали викликає різку зміну адсорбційних властивостей силікагелю. Силікагель порівняно з оксидом алюмінію має більш широкий діапазон пористості поверхні і діаметру пор. Особливо популярними є хімічно модифіковані силікагелі, які характеризуються хімічною інертністю, високою термостійкістю, легкістю регулювання пористості структури – цей комплекс властивостей дає можливість приготувати на основі силікагелю сорбенти, каталізатори і носії з високою питомою поверхнею при оптимальній пористості структури. Модифіковані сорбенти мають розмір зерна від 1,5 до 3 мкм. Такі сорбенти містять різні включення, наприклад, спеціальні хімічні містки, що дозволяють підвищити механічну міцність нерухливої фази, витримують великий робочий діапазон рН. Хімічне модифікування або дериватизація це хімічний вплив на полімер хімічних або фізичних агентів, що супроводжується зміною хімічного складу полімера та/або його молекулярної маси, а також уведення на стадії синтезу невеликої кількості речовини, що вступає з основним мономером у сополімеризацію або сополіконденсацію. Використовується при аналізі лікарських і наркотичних речовин, таких як амфетамін, метамфетамін, каннабіноїди, морфін, кодеїн. Метилювання — введення в органичні сполуки метильної группи ─СН3 замість атома водню, металу або галогену. Застосовується для аналізу саліцилової кислоти, ацетилсаліцилової кислоти, жирних кислот, барбітуратів. Ацетилювання (приєднання залишку оцтової кислоти CH3CO─ ) застосовується для аналізу парацетамолу методом газо-рідинної хроматографії. Види щеплення нерухливої фази. Прищеплені сополімери – це розгалужені високомолярні сполуки, макромолекули яких складаються з основного ланцюга та бічних відгалужень, що відрізняються за складом та/або будовою. На відміну від фаз, нанесених за рахунок просто адсорбції, рідкі прищеплені нерухливі фази витримують високі температури. Вони не випаровуються і механічно стійкіші. Прищеплені рідкі нерухливі фази набагато надійніші, ніж фази прищеплені адсорбцією. Найчастіше їх отримують щепленням на селікагелі вищих спиртів, тобто на поверхню селікагелю по ОН-групах вводять вищі спирти (октиловий, дециловий, октодециловий). При цьому отримують довгі радикали, які є рідкою нерухливою фазою. Вибір тієї або іншої фази залежить від природи речовин, що розділяються, і температури аналізу. Головна відмінність рідких нерухливих 68 фаз від твердих полягає в тому, що основним є їх розподіл в глибину нерухливого носія. Таким чином, речовини що розділяються можуть заходити углиб нерухливої фази. Захисні групи тимчасово вводяться в молекули органічних сполук для збереження в хімічних реакціях певних реакційних груп таких як ─ОН, ─СО, ─СООН, ─NH2, ─SH. Такі групи повинні відповідати наступним вимогам:  вибірково захищати (блокувати) певні функціональні групи;  бути стійкими до намічених перетворень молекули;  вибірково видалятися, регенеруючи вихідну групу. Захисні групи уводять за допомогою реакцій заміщення, приєднання, циклізації та ін. Це алкільні, арилалкільні, ацильні, силильні групи та ін. Найпоширеніші захисні групи:  алкільні і близькі до них за будовою групи захищають ─ОН, ─СООН, ─SH, з утворенням простих або складних ефірів і сульфідів. Захисні групи видаляють з реакціями гідролізу, ізомеризації, дією солей Hg, Ag, Сu;  арилалкільні групи захищають ─ОН, ─ SH, ─ NH2, ─ СООН з утворенням відповідних заміщених амінів, простих і складних ефірів, сульфідів;  гетероциклічні групи використовують для захисту ─ОН і ─SH з утворенням змішаних ацеталей і тіоацеталей;  алкилдієнова і арилалкилдієнова групи захищають первинні аміни, 1,2- і 1,3-діоли з утворенням відповідних азометинів, циклічних ацеталей і кеталей;  ацильні групи захищають ─ОН, ─ SH, ─ NH2, з утворенням складних ефірів, карбонатів, карбаматів, тіоефірів;  силильні групи похідні силану SiH4. Силилування – уведення в молекулу органічної або неорганічної сполуки заміщеної силильної групи SiХ3 з утворенням нових хімічних зв'язків С-Si, О-Si, N-Si і т.п. Силильні групи захищають групи ─ОН, ─ SH, ─ NH2, ─ СООН, утворюючи силилові ефіри і силилзаміщені аміни.  ендкепірування – захист неприщепелених ділянок сорбенту (силікагелю) додатковим щепленням більш активними молекулами меншого розміру. Силанольні групи, що перебувають на поверхні вихідного силікагелю, до якого прищеплюється фаза, не можуть бути повністю заміщені. Для повного покриття поверхні силікагелю застосовують процес «ендкепінгу». Зшиваючі агенти - речовини, здатні незворотно перетворювати (зшивати) молекули полімерів або олігомерів (смол) у тверді неплавкі та нерозчинні сітчасті полімери. Зшиваючі агенти, різко зменшують здатність полімерів до незворотних деформацій і набухання, підвищують їх міцність, теплостійкість і хімічну cтійкість. 69  4.5.3. Різновиди високоефективної рідинної хроматографії. 1. Нормально-фазова: нерухлива фаза є полярною (наприклад, диоксид кремнію), а рухлива фаза – неполярною. Розподільна нормально-фазова ВЕРХ застосовується для розділення речовин, що легко розкладаються або здатні до хемосорбції та перегрупування. Це – вітаміни, моносахариди, цитохроми, поліциклічні та ароматичні вуглеводні і кислоти, стероїди, наркотичні речовини. Цей тип ВЕРХ використовується для чутливих до води сполук, геометричних ізомерів, цис-транс- ізомерів і хіральних сполук. 2. Обернено-фазова: нерухлива фаза неполярна (наприклад, С18), рухлива фаза – вода + розчинник, що змішується (наприклад, метанол). Таким чином, причиною сорбції у обернено-фазовій хроматографії є сильне притягання полярних молекул розчинника, які ніби «притискають» розчинені менш полярні молекули до неполярної поверхні. З цього випливає, що порівняно з нормально-фазовою хроматографією у обернено-фазовій роль хімічної природи нерухливої фази відносно мала, оскільки взаємодія сорбат- сорбент обмежується слабкими дисперсійними силами. Із усіх варіантів ВЕРХ обернено-фазовий метод застосовується найчастіше тому, що він має простий механізм сорбції, передбачувану поведінку речовин, основану на їх будові, методичну простоту та універсальність. Розчинники, що використовуються в обернено-фазовій хроматографії (ацетонітрил, метанол, тетрагідрофуран, вода) відносно легко розчиняють більшість практично важливих органічних і природних речовини, що перебувають в організмі людини, біологічних об’єктах, продуктах харчування, лікарських препаратах, а також дозволяють працювати з оптичними детекторами в УФ- і видимому діапазоні спектра. Метод широко застосовується для розділення сумішей, розчинних у воді та органічних розчинниках. Розділення гомологів (алканів, аренів, фенолів і т.д.) відбувається у порядку зростання їх молекулярної маси. Метод дає змогу аналізувати вуглеводи, ліпіди, складні ефіри, спирти. Може використовуватися для полярних, неполярних, іонізуємих та іонних зразків. 3. Іонообмінна ВЕРХ. Нерухлива фаза містить іонні групи, а рухлива фаза є буферною. Використовується для розділення аніонів і катіонів. 4. У ексклюзійній або гель-проникній хроматографії молекули речовин розділяються за розміром за рахунок їх різної здатності проникати в пори носія. При цьому першими виходять з колонки найбільші молекули (з великою молекулярною масою), здатні проникати у мінімальну кількість пор носія. Останніми виходять речовини з малими розмірами молекул, що вільно і глибоко проникають у пори сорбенту. 5. Високоефективна афінна рідинна хроматографія (ВЕАРХ). Процес розділення речовин з використанням афінної хроматографії включає кілька самостійних етапів: вибір матриці і її активація; іммобілізація на поверхні активованої матриці біологічно активних сполук, що називаються афінними 70 лігандами, якими можуть бути білки, пептиди, нуклеїнові кислоти, вуглеводи, вітаміни, амінокислоти, тощо; хроматографічний аналіз, в процесі якого відбувається специфічне і зворотнє комплексоутворення компонента із певною біологічно активною молекулою; руйнування комплексу, що утворився, і елюювання специфічно адсорбованої речовини. Біологічно активні сполуки мають унікальну здатність до молекулярного розпізнавання і утворення специфічних і зворотньо диссоціюючих комплексів з адсорбційними центрами, іммобілізованими на поверхні стаціонарної фази. Фермент розпізнає свій субстрат, антиген – антитіло, гормон – рецептор. Нерухливі фази (матриці) в ВЕАРХ, що застосовуються для іммобілізації біологічно активних речовин, повинні мати високу механічну міцність, велику питому поверхню, нерозчинність у рухливих фазах, високу гідрофільність і біосумісність, хімічну реакційну здатність до лігандів різних біомолекул. Типові матриці: агароза (структурна одиниця - D-галактоза), для ВЕАРХ - агарозний гель, целюлоза - високопориста матриця зі сферичними гранулами, декстрани - полімери глюкози. Такі матриці мають жорстку структуру, мало схильні до дії тиску, тому можуть забезпечувати високі швидкості потоку рухливої фази. Застосування. Особливо ефективна у біотехнології і фармації для виділення і очистки ферментів, білків, гормонів. Отже, швидкий масоперенос за умови високої ефективності розділення дозволяє використати ВЕРХ для розділення та ідентифікації молекул (адсорбційна і розподільна хроматографія), для розділення та ідентифікації іонів (іонообмінна, іонна, іон-парна хроматографія), для розділення макромолекул (ексклюзійна або гель-хроматографія). Методами афінної і лігандообмінної хроматографії розділяють біологічно активні молекули і оптичні ізомери. Обмеження у використанні ВЕРХ 1. Вартість. Незважаючи на свої переваги, ВЕРХ може бути дорогою, вимагаючи великих кількостей дороговартісних реактивів і обладнання. 2. Складність. Необхідна висока кваліфікація обслуговуючог?