6. DNA, RNA-temelli teknikler, PCR tekniği ve uygulamaları.pdf

DNA, RNA bazlı teknikler, PCR tekniği ve uygulamaları DR. ÖĞR ÜYE. SEVDA AKAY SAZAKLIOĞLU Nükleik asitler ➢Nükleik asitler, her hücrede bulunan genler ve kalıtsal faktörlerle ilgili protein sentezinin temel bileşenleridir. ➢İlk kez hücre çekirdeğinden izole edildiği için "nüklein" veya "nüklein ma...

DNA, RNA bazlı teknikler, PCR tekniği ve uygulamaları DR. ÖĞR ÜYE. SEVDA AKAY SAZAKLIOĞLU Nükleik asitler ➢Nükleik asitler, her hücrede bulunan genler ve kalıtsal faktörlerle ilgili protein sentezinin temel bileşenleridir. ➢İlk kez hücre çekirdeğinden izole edildiği için "nüklein" veya "nüklein maddesi" olarak adlandırılmıştır. ➢Ancak nükleik asitlere çekirdeğin dışında da rastlandığı bilinmektedir. ➢Prokaryot hücrelerin sitoplazmasında, ökaryot hücrelerde çekirdek, mitokondri ve kloroplast organelinde bulunur Nükleik Asit Yapısı oNükleik asitler, nükleotidlerin polimerizasyonuyla oluşturulur. oMolekülün ana omurgası şeker ve fosfat birimlerinin fosfodiester bağlarıyla bağlanması sonucu oluşur. oNükleotidler molar oranları 1:1:1 olan 3 tip maddeden oluşur: oPentoz oFosfat grubu oAzotlu baz (pürin veya pirimidin) NÜKLEİK ASİTLERİN YAPISI VE TAMAMLAYICILIĞI Moleküler analizler nükleik asitlerin tipine ve dizilişine bağlıdır. Nükleik asitler, deoksiribonükleik asit (DNA) veya ribonükleik asit (RNA) olmak üzere iki formdan birinde bulunur. Nükleik asitler, bir şekerin 5' karbon atomunun komşu şekerin 3' karbon atomuna kovalent olarak bağlandığı bir fosfat şekeri omurgasından oluşur. DNA dört deoksinükleotid bazından oluşur: guanin (G); sitozin (C); adenin (A); ve timin (T), urasil (U) ise RNA'daki timin yerine geçer. NÜKLEİK ASİTLERİN YAPISI VE TAMAMLAYICILIĞI ❑DNA'da şeker deoksiriboz, RNA'da ise şeker ribozdur. ❑Deoksiribozun 3' karbonunda bir hidroksil grubunun varlığı, DNA replikasyonunda kritik bir rol oynar. ❑Bazlar kimyasal bileşimlerine ve yapılarına göre purin (G ve A) veya pirimidin bazları (C, T, U) olarak ikiye ayrılır. ❑Spesifik olarak, G yalnızca C'ye bağlanır ve A yalnızca T'ye bağlanır. Her G-C eşleşmesi için üç hidrojen bağı bulunurken, A-T eşleşmesi için yalnızca iki hidrojen bağı vardır. Çift sarmallı DNA'da purin ve pirimidin bazları arasındaki hidrojen bağı DNA = yaşam talimatları commons.wikimedia.org/wiki/File:Eukaryote_DNA.svg DNA DNA, uzun bir alt birim zincirinden oluşan çok büyük bir moleküldür. Her bir nükleotid aşağıdakilerden oluşur: deoksiriboz adı verilen bir şeker bir fosfat grubu -PO4 ve organik bir baz THE DOUBLE HELIX bazlar şeker-fosfat zinciri Nükleik asit bazlı yöntemler Nükleik asit bazlı yöntemlerde ilk adım genellikle nükleik asitlerin çevresel örneklerden ekstraksiyonudur. Bu adım, sonraki analizler için kritik öneme sahiptir. Bu süreçte DNA, bir numune içindeki tüm popülasyonlardan eş zamanlı olarak ekstrakte edilerek topluluk DNA'sı olarak adlandırılan bir DNA karışımı oluşturulur. • DNA parçaları negatif yüklüdür • DNA, fosfat omurgası nedeniyle negatif yüklü olduğundan jelin içinden çekilir. • Negatif yüklü DNA, jelin ucundaki pozitif elektrot tarafından çekilir ve böylece DNA, ağ benzeri jel yapısı boyunca çekilir. Phosphate and sugar backbone Image: www.boundless.com Elektroforez Nedir? “Electro” elektrik enerjisi anlamına gelmektedir. “Phoresis” ise, Yunanca “phoros”tan türeyerek içinden taşımak anlamına gelmektedir. Elektroforez, bir çözeltide asılı taneciklerin, elektrik alanı etkisiyle ayrılmasıdır. Arne Tiselius tarafından geliştirilmiş olan elektroforezden, özellikle tıpta ve biyokimyada, kandaki çeşitli protein ve lipitlerin ayrılması, tanınması ve miktarının ölçülmesinde yararlanılır. Bu çalışmadan dolayı kendisi 1948'de Nobel Ödülü ile ödüllendirilmiştir. ELEKTROFOREZ Elektroforez, bir elektrik alanının etkisi altında yüklü parçacıkların veya moleküllerin göçünü tanımlar. ELEKTROFOREZİN YAPILMASININ AMACI 1. Belirli bir numunedeki bileşenlerin sayısını, miktarını ve hareketliliğini belirlemek veya bunları ayırmak. 2.Parçacıkları çevreleyen elektriksel çift katmanlar hakkında bilgi edinmek. 3.Proteinlerin molekül ağırlığının belirlenmesi ve DNA dizilimi. Çalışma Prensibi Herhangi bir yüklü iyon veya molekül, bir elektrik alanına yerleştirildiğinde göç eder. Göç oranı net yüküne, boyutuna, şekline ve uygulanan elektrik akımına bağlıdır. Aşağıdaki denklem ile temsil edilebilir. v = molekülün göç hızı. E = cm başına volt cinsinden elektrik alanı q = molekül üzerindeki net elektrik yükü f = sürtünme katsayısı ELEKTROFORETİK HAREKETLİLİĞİ ETKİLEYEN FAKTÖRLER 1.Yük – yük ne kadar yüksek olursa elektroforetik hareketlilik de o kadar fazla olur. 2. Boyut – molekül ne kadar büyük olursa, ortamın ona uyguladığı sürtünme ve elektrostatik kuvvetler de o kadar büyük olur. Sonuç olarak, daha büyük parçacıklar, daha küçük parçacıklara kıyasla daha küçük elektroforetik hareketliliğe sahiptir. 3. Şekil yuvarlatılmış konturlar, keskin konturlarla karşılaştırıldığında daha az sürtünme ve elektrostatik gecikmeye neden olur. Bu nedenle küresel proteinler lifli proteinlerden daha hızlı hareket eder. Elektroforez Türleri 1. Kağıt ve selüloz asetat elektroforezi 2. İnce tabaka elektroforezi 3. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) 4. Agaroz jel elektroforezi 5. Kılcal elektroforez Jel Elektroforezi ❑Bir jel matrisine uygulanan elektrik akımı kullanılarak Deoksiribonükleik asit, Ribonükleik asit veya protein moleküllerinin boyutlarına ve elektrik yüklerine göre ayrılması için kullanılan bir tekniktir. Jel nedir? ❑Jel, bileşimi ve gözenekliliği hedef moleküllerin özgül ağırlığına ve gözenekliliğine göre seçilen çapraz bağlı bir polimerdir. ❑Jel Çeşitleri ❑Agaroz jel ❑Poliakrilamid jel Jel Elektroforezi Elektroforez DNA parçalarını boyutlarına göre ayırır. kuyucuklara pipetlenen DNA örnekleri Jel Elektroforezi ❑Jel elektroforezi, DNA parçalarının boyutlarına göre ayrılmasını sağlayan, DNA'nın incelenmesi için önemli bir tekniktir. ❑Jel, DNA'nın içinden geçmesi için bir tür ağ görevi görür. ❑Kısa parçalar jel içerisinde kolaylıkla hareket edebilirken, uzun parçalar yakalanır ve bu nedenle jel içerisinde hızlı hareket edemez. Agaroz JEL ❑Agardan türetilen yüksek derecede saflaştırılmış yüksüz bir polisakarittir. ❑Nükleik asitler, büyük proteinler ve protein kompleksleri gibi makromolekülleri ayırmak için kullanılır. ❑%0,5 agarozun kaynar suda çözünmesi ve 40°C'ye kadar soğuması ile hazırlanır. ❑Zayıf hidrojen bağları ve hidrofobik bağların oluşması nedeniyle kırılgandır. Bilinen uzunluklarda fragmanlara sahip bir DNA işaretçisi genellikle numunelerle aynı anda jelden geçirilir. DNA örneklerinin bantlarını DNA işaretçisindeki bantlarla karşılaştırarak örneklerdeki DNA parçalarının yaklaşık uzunluğu belirlenebilir. Sonuçların görselleştirilmesi DNA jel boyunca yeterince ilerledikten sonra elektrik akımı kapatılır ve jel, elektroforez tankından çıkarılır. DNA'yı görselleştirmek için jel, DNA'ya bağlanan bir floresan boya ile boyanır ve lekeli DNA'yı parlak bantlar halinde gösterecek bir ultraviyole transillüminatör üzerine yerleştirilir. Alternatif olarak boya dökülmeden önce jel ile karıştırılabilir. Eğer jel doğru şekilde çalıştıysa DNA işaretleyicisinin/boyut standardının bant deseni görünür olacaktır. Daha sonra DNA işaretçisinin bantları boyunca uzanan yatay bir çizgi hayal ederek numunenizdeki DNA'nın boyutunu yargılamak mümkün olur. Daha sonra numunedeki DNA'nın boyutunu, bunları işaretleyicideki en yakın bantla eşleştirerek tahmin edebilirsiniz. Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) ➢Akrilamid monomerlerinden elde edilen poliakrilamid polimerler elde edilir. ➢Poliakrilamidin gözenekliliği, akrilamid içeriği değiştirilerek değiştirilebilir.PAGE yöntemi doğal (doğal) proteinleri ayırmak için uygulanabilir. ➢Bu teknik aynı zamanda sodyum dodesil sülfat (SDS) kullanılarak proteinlerin denatüre edilmesi yoluyla moleküler kütlenin belirlenmesi için de kullanılır. ➢SDS-PAGE, moleküler biyoloji araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir protein elektroforezi tekniğidir. ➢Bu teknik aynı zamanda klinik laboratuvarlarda rutin kullanıma göre çok daha iyi bir ayırma sağlar. Aynı zamanda proteinlerin çok sayıda alt biriminin ayrılmasını da sağlar. Jeller akrilamid polimerlerin çapraz bağlı matrisleridir. Serbest radikaller vinil polimerizasyon reaksiyonunu başlatır Dikkat: Reaksiyona girmemiş akrilamid ve bisakrilamid monomerleri nörotoksinlerdir; poliakrilamid inerttir Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) ➢Jel elektroforezinde kullanılan jeller matrisin türüne göre nişasta, agaroz veya poliakrilamid olabilir. Elektroforezde kullanılan matrisin yükü kaldırılmalıdır. Matriks yüklenirse yüklü biyomoleküllerin ilerlemesi engellenir. Matristeki maddenin konsantrasyonu arttıkça gözenek çapı küçülür. Gözenek çaplarına göre en büyük gözenekli jel agaroz, ardından nişasta ve en küçük gözenekli jel ise poliakrilamiddir. Bu süreçte iki faktör önemlidir. % T ve % C % T = Toplam monomer miktarı % C = Toplam monomerdeki bisakrilamid miktarı (Çapraz bağlantı oranı) ➢% C = bisakrilamid (g) / akrilamid (g) + bisakrilamid (g) x 100 PROTEİNLERİN ELEKTROFOREZİ Proteinlerin ayrılması için en yaygın kullanılan teknik, Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezidir (SDS-PAGE). PROSEDÜR ❑Protein numunesi ilk olarak SDS ve β-merkaptoetanol içeren bir tampon solüsyonunda 5 dakika kaynatılır. ❑Protein denatüre olur ve çubuk şeklinde bir yapıya açılır. ❑Numune tamponu, izleme boyası olarak kullanılan bromofenol mavisi ve sükroz veya gliserol içerir. ❑Numune ana ayırma jeline yüklenmeden önce, ayırma jelinin üzerine bir istifleme jeli dökülür. PROSEDÜR Devamı… ■ Akım açık. ■ Negatif yüklü protein-SDS kompleksleri artık anoda doğru hareket etmeye devam eder. ■ Ayırma jelinden geçerken protein, jelin moleküler eleme özellikleri nedeniyle ayrılır. ■ Boya jelin dibine ulaştığında akım kesilir. ■ Cam plakaların arasından jel çıkarılır ve uygun bir leke solüsyonunda çalkalanır. ■ UV ışınları altında mavi renkli bantlar görülür. Adli durumlar DNA Amplifikasyonu Olay yerinde DNA örneği bulundu ancak DNA miktarı analiz için yeterli değil. DNA ekstraksiyonundan sonra araştırmacı, dizileme yapmak için genin belirli bir bölümünü incelemek ister. Peki araştırmacı bu sorunu nasıl çözer? Çözüm, DNA parçalarının amplifikasyonunu yapmaktır!! PCR PCR Polymerase Chain Reaction Polimeraz Zincir Reaksiyonu, DNA’nın belirli bir bölgesinin tüp içinde çoğaltılması işlemidir. Bu teknik ile DNA molekülünün milyonlarca hatta milyarlarca kopyasını yapmak mümkündür. Replikasyonun laboratuar ortamında taklit edilmesidir. Çift sarmal DNA açılır DNA polimeraz enzimi yeni ve komplementer iplikçiği üretir. PCR – Polimeraz zincir reaksiyonu PCR, sekansı bilinen iki bölge arasında yer alan bir DNA bölgesinin amplifikasyonuna yönelik in vitro bir tekniktir. PCR amplifikasyonu oligonükleotid primerleri kullanılarak elde edilir. Oligonükleotidler, DNA polimeraz için primer görevi görür ve büyük DNA fragmanının denatüre iplikleri şablon görevi görür. Bu, ana şablon iplikçiklerine tamamlayıcı olan yeni DNA iplikçiklerinin senteziyle sonuçlanır. Bu yeni şeritler tanımlanmış 5' uçlara (oligonükleotid primerlerinin 5' uçları) sahipken, 3' uçların uzunluğu potansiyel olarak belirsizdir. Belirli bir hedef dizinin amplifikasyonu •PCR örnekteki DNA'nın tamamını kopyalamaz. PCR primerleri tarafından hedeflenen bir şablon DNA'dan yalnızca çok spesifik bir genetik kod dizisini kopyalar. Amplifiye edilecek DNA fragmanının (hedef DNA) yanındaki bazı DNA sekansı bilgilerinin bilinmesini gerektirir. "Polymerase chain reaction" by Enzoklop - Own work. Licensed under Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 via Wikimedia Commons 1- DENATÜRASYON Çift sarmal DNA’nın yüksek sıcaklık altında (93-96⁰C) çözülerek tek zincir hale geçmesidir. Hidrojen bağlarının kırılmasıyla olmaktadır. Ortamdaki tüm DNA sarmalları tek zincir haline geçtiğinde reaksiyon tamamlanır. 2- PRİMER BAĞLANMASI ❑Sıcaklık düştükçe (54-70 ⁰C ) tekli DNA iplikçikleri birbirine eşleşir. ❑Eğer ortamda hedef bölgeye komplementer ve kısa bir DNA dizisi varsa , tüm iplikçiğin eşleşmesindense öncelikli olarak kısa iplikle eşleşme olacaktır. ❑Bu kısa iplikçik primerdir!! İleri ve geri yönlü primerlerle ilgili bölge sınırlandırılır. Primerler 18-25 bazlık tek iplikçikli DNA dizileridir. İçerdikleri bazlara göre bağlanma sıcaklıkları değişir. 3- UZAMA Sıcaklık tekrar yükseltilir ve DNA polimeraz enzimi, primerlerin ucuna kalıp DNA’ya eşlenik bazlar (dNTP) ekleyerek yeni DNA iplikçiğini uzatır. DNA polimeraz sıcaklığa dayanıklı olmak zorundadır. ◦ Örneğin Thermus aquaticus’dan Taq DNA polymerase optimum çalışma sıcaklığı 72⁰C Bir döngü sonunda her DNA iki katına çıkmış olur. Her döngüde n 2 Neden iki primere ihtiyacımız vardır? Bir PCR reaksiyonunda hedef diziyi çoğaltmak için iki primere ihtiyacınız vardır: İleri DNA zincirinin aynı dizisine sahip olan ve tamamlayıcı ters zincire bağlanan ileri primer. Ters DNA zincirinin aynı dizisine sahip olan ve tamamlayıcı ileri zincire bağlanan ters primer. *Sadece bir primer varsa, PCR reaksiyonunda çift sarmallı DNA'nın yalnızca bir sarmalı çoğaltılacaktır. PCR Prensipleri Polimeraz zincirleme tepkimesi (polymerase chain reaction) Örnek •DLG3 genindeki bir mutasyonu ve bunun hafızayla ilişkisini incelemek istiyorsunuz: 1. Herhangi bir web sitesinden gen dizisini bulun, örneğin Ensebmle. 2.Hedef bölgenizi belirleyin. 3.Primer3 gibi primer tasarım aracını kullanarak primerleri tasarlayın ve bunları sentezleyecek herhangi bir şirkete gönderin. 4.Çalışmak istediğiniz alanın primerler arasında olduğundan emin olun (çalışılacak bölge ileri ve geri primerler arasında olmalıdır). 5. BLAST ile primer spesifikliğini kontrol edin. 6. PCR'nizi ve sorun giderme işleminizi optimize edin. 7. PCR'yi başlatın. PCR değişkenleri 1. Sıcaklık--- primerin bağlanma sıcaklığı ve kullanılan DNA polimerazın çalıştığı sıcaklıklar farklı olabilir 2. Aşamaların uzunlukları ve döngü sayısı--- hedef bölgenin büyüklüğüne göre değişir 3. Primer ---hedef DNA’ya göre baz dizileri, bağlanma sıcaklığı değişir. Tm sıcaklığı önemlidir : bazların yarısının bağlı olduğu sıcaklık. Buna göre en uygun bağlanma sıcaklığı belirlenir…. Her deneye ve laboratuara göre farklı olabilir. 4. Tampon çözelti ve MgCl2--- DNA polimerazın aktif olabilmesi için gerekli olan iyon dengesini sağlar. 5. Polimeraz enzimi --- ticari olarak çeşitli enzimler bulunmaktadır, hata oranları, çalıştıkları sıcaklıklar ve yoğunluklar farklı olabilir. Kısa ürünlerin elde edilmesi Kontaminasyona açık olma PCR’ın Sınırları Taq DNA polymerase giderek inaktive olur. Taq DNA Polimerazin, yari ömrü 92.5°'de 130 dk; 95°C'de 40 dk'dir. Bu nedenledir ki PCR'in sonlarina dogru olan sikluslarda aktivitesi sinirlanmaktadir. Ortamda Fenol kalıntılarının bulunması PCR ı inhibe eder. References: ❑Emily B. Hollister, John P. Brooks and Terry J. Gentry, Nucleic Acid-Based Methods of Analysis. Chapter 13