Endomembransystem und Katabolismus PDF

Inhalte der Vorlesung Zusammenfassung þ Methoden der Zellbiologie: u.a. Mikroskopie, Zellfraktionierung þ Die Plasmamembran (Aufbau/Funktion & Transportvorgänge) þ Die Zelle der Eukaryoten: Überblick über Bau & Funktion...

Inhalte der Vorlesung Zusammenfassung þ Methoden der Zellbiologie: u.a. Mikroskopie, Zellfraktionierung þ Die Plasmamembran (Aufbau/Funktion & Transportvorgänge) þ Die Zelle der Eukaryoten: Überblick über Bau & Funktion þ Zellwand & extrazelluläre Matrix, Zellhüllen þ Zellkern, DNA, Nukleolus, Chromatin, Gen þ RNA, Ribosomen & Proteasom i Vesikel-Traffic: ER, Golgi Apparat & Exozytose i Lysosomen, Peroxisomen & Glyoxisomen i Mitochondrien & Plastiden i Cytoskelett i Zell-Zell-Kontakte & -kommunikation i Zellteilung & Zelltod Dresselhaus  6. Endomembransystem Kompartimente & Vesikel-Traffic u Endoplasmatisches Retikulum (ER) u Golgi-Apparat und Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) u Lysosomen, Vakuolen, Peroxisomen, Glyoxisomen u Exo- und Endozytose u Traffic zwischen Endomembrankomponenten Die Kompartimente des Endomembransystems sind von einer Membran umgeben und stehen miteinander in Verbindung bzw. im Austausch ! Dresselhaus  6. Endomembransystem Endoplasmatisches Retikulum (ER) F äußere Kernmembran geht in das Endoplasmatische Retikulum (ER) über F der inneren Kernmembran ist die Kernlamina aufgelagert F Kernporen (Æ ca. 50 nm): regulieren Im- & Export von Proteinen und RNA bzw. RNPs (Ribonukleinpartikel) PE 16-5 Dresselhaus  6. Endomembransystem Endoplasmatisches Retikulum lat. retikulum = „kleines Netz“ Ø irreguläres Geflecht aus Membranröhren Ø rER liegt meist eng am Zellkern Ø perinukleärer Raum und Lumen des ER sind ein räumliches Kontinuum rER rauhes mit Ribosomen ER (rER) glattes ER (sER) mit Ribosomen ohne Ribosomen PE 16-5 Dresselhaus  6. Endomembransystem Endoplasmatisches Retikulum lat. retikulum = „kleines Netz“ sER rER rauhes ER (rER) ER-Membran glattes ER (sER) mit Ribosomen ER-Lumen ohne Ribosomen PE 16-5 Dresselhaus  6. Endomembransystem Endoplasmatisches Retikulum Funktionen des rER rER mit Ribosomen rauhes ER (rER) glattes ER (sER) mit Ribosomen ohne Ribosomen PE 20-1 Dresselhaus  6. Endomembransystem Endoplasmatisches Retikulum Funktionen des rER 1. Synthese und Faltung sekretorischer Proteine & Membranproteine 2. Oxidation von Cystein-Resten zu Disulfid-Brücken 3 Glykosylierung sekretorischer Proteine (N-Glykosylierung) rauhes ER (rER) glattes ER (sER) mit Ribosomen ohne Ribosomen Dresselhaus  6. Endomembransystem Endoplasmatisches Retikulum integrale Membranproteine werden am rER synthetisiert unpolare (hydrophobe) AS polare AS S-S Brücken basische AS saure AS Dresselhaus  6. Endomembransystem Endoplasmatisches Retikulum integrale Membranproteine werden am rER synthetisiert unpolare (hydrophobe) AS polare AS N-Glykosylierung basische AS saure AS Dresselhaus  6. Endomembransystem Endoplasmatisches Retikulum Funktionen des rER 1. Synthese und Faltung sekretorischer Proteine & Membranproteine 2. Oxidation von Cystein-Resten zu Disulfid-Brücken 3 Glykosylierung sekretorischer Proteine (N-Glykosylierung) rauhes ER (rER) glattes ER (sER) mit Ribosomen ohne Ribosomen Dresselhaus  6. Endomembransystem Endoplasmatisches Retikulum Funktionen des sER 1. Synthese von Lipiden (Phospholipide, Sterole, Fette, Geschlechtshormone) 2. Ca2+ Speicher (Ci bis 10 mM) [SR - „sarkoplasmatisches Retikulum“ im Muskel] 3. Entgiftung von Xenobiotica (z.B. pharmazeutische Wirkstoffe) durch Cytochrom P450 – Oxidasen rauhes ER (rER) glattes ER (sER) mit Ribosomen ohne Ribosomen Dresselhaus  6. Endomembransystem Endoplasmatisches Retikulum Zusammenfassung der wichtigsten ER-Funktionen (1) Synthese & Faltung sekretorischer Proteine (2) Prozessierung sekretorischer Proteine: S-Brücken rauhes ER (3) N-Glykosylierung sekretorischer Proteine (4) Synthese von (Phospho-)Lipiden (5) Entgiftung von Xenobiotica glattes ER (6) Ca2+ - Speicher Dresselhaus  6. Endomembransystem Endoplasmatisches Retikulum Bsp.: Synthese sekretorischer Proteine ins rER von Säugetieren u.a. Proteine im Blutserum Peptidhormone *Albumin (Leberzellen) *Insulin (Bauchspeicheldrüse) *Immunglobuline (IgG) (Lymphocyten) *Glucagon (Bauchspeicheldrüse) *Endorphine (Neurosekretorische Zellen) *Erythropoetin (EPO) (Niere, Leber) *Oxytocin (Hypothalamus) Proteine der extrazellulären Matrix Verdauungsenzyme *Kollagen (Bindegewebe) *Trypsin (Bauchspeicheldrüse) *Elastin (Bindegewebe) *RNAsen (Bauchspeicheldrüse) *Fibronectin (Bindegewebe) *DNAsen (Bauchspeicheldrüse) *Proteoglycane (Bindegewebe) Milchproteine *Casein (Milchdrüsen) Dresselhaus  6. Endomembransystem Endoplasmatisches Retikulum Zusammenfassung: Biosynthese sekretorischer Proteine ins rER 1.) Prä-Proteine besitzen eine Signal-Sequenz (hydrophob am N-Terminus) 2.) Erkennung durch ein Signal Recognition Particle (SRP) an freien Ribosomen 3.) Bindung an einen SRP Rezeptor in der rER-Membran (gebundene Ribosomen) 4.) Translokation ins Lumen des rER (Translokator) 5.) Abspalten der Signal-Sequenz durch eine Signal-Peptidase 6.) Proteinfaltung (Chaperone) und ggf. weitere Modifizierungen (im ER-Lumen) ! integrale Membranproteine haben interne hydrophobe Signalsequenzen ! Dresselhaus  6. Endomembransystem Endoplasmatisches Retikulum Wie gelangen die Proteine ins rER? „Sekretorische Proteine tragen N-terminale Verlängerungen, die dafür sorgen, daß Ribosomen an das ER andocken. Das neu gebildete Protein wird in das Lumen des rER hinein translatiert. Die Signal-Sequenz wird anschließend abgespalten.“ Günther Blobel (Rockefeller Uni, USA) Nobelpreis 1999 (Physiologie oder Medizin) Dresselhaus  Inhalte der Vorlesung Zusammenfassung þ Methoden der Zellbiologie: u.a. Mikroskopie, Zellfraktionierung þ Die Plasmamembran (Aufbau/Funktion & Transportvorgänge) þ Die Zelle der Eukaryoten: Überblick über Bau & Funktion þ Zellwand & extrazelluläre Matrix, Zellhüllen þ Zellkern, DNA, Nukleolus, Chromatin, Gen þ RNA, Ribosomen & Proteasom i Vesikel-Traffic: ER, Golgi Apparat & Exozytose i Lysosomen, Peroxisomen & Glyoxisomen i Mitochondrien & Plastiden i Cytoskelett i Zell-Zell-Kontakte & -kommunikation i Zellteilung & Zelltod Dresselhaus  6. Endomembransystem Golgi-Apparat Polarität des Golgi-Apparats trans-Golgi-Netzwerk (TGN) Vesikel medial-Golgi Camillo Golgi Nobelpreis 1906 Zisternen Medizin cis-Golgi Dresselhaus  6. Endomembransystem Golgi-Apparat Aufbau des Golgi-Apparats Golgi-Zisternen Ø scheibenförmige, abgeflachte Zisterne Membransäckchen Ø peripher blasig erweitert Ø 6-8 Zisternen übereinander gestapelt Golgi-Vesikel Vesikel Ø kugelige Membransäckchen Golgi-Stapel = Dictyosom (Pflanzen) Dresselhaus  6. Endomembransystem Golgi-Apparat Funktionen des Golgi-Apparats „Rangierbahnhof der Zelle“ und Sortierapparat F Produktion von Komponenten der Zellwand bzw. extrazellulären Matrix (z.B. Polysaccharide, Pektine und Proteoglycane) F Modifizierung (insb. O-Glykosylierung von Proteinen) und Verteilung von Lipiden und sekretorischen Proteinen Dresselhaus  6. Endomembransystem Golgi-Apparat O-Glykosylierung an –OH Gruppen unpolare (hydrophobe) AS polare AS O-Glykosylierung basische AS saure AS Dresselhaus  6. Endomembransystem Golgi-Apparat Funktionen des Golgi-Apparats „Rangierbahnhof der Zelle“ und Sortierapparat F Produktion von Komponenten der Zellwand bzw. extrazellulären Matrix (z.B. Polysaccharide, Pektine und Proteoglycane) F Modifizierung (insb. O-Glykosylierung von Proteinen) und Verteilung von Lipiden und sekretorischen Proteinen F Verteilung der synthetisierten Substanzen zu ihren Bestimmungsorten (Extrazellularraum, Plasmamembran, Lysosom bzw. Vakuole) Dresselhaus  6. Endomembransystem Golgi-Apparat rER & Golgi-Apparat sind Bestandteile des sekretorischen Wegs der sekretorische Weg (engl.: secretory pathway) Dresselhaus  6. Endomembransystem Übersicht Kernhülle/rER mit Ribosomen Golgi-Komplex Rückhol- (Retrieval) primäres Lysosom sekretorische Vesikel Wege spätes Endosom/Lysosom Exportwege Importweg frühes Endosom Plasmamembran Dresselhaus  6. Endomembransystem Vesikel-Traffic Vesikel-Transport vom rER zum cis-Golgi-Apparat PE 20-11 Dresselhaus  6. Endomembransystem Vesikel-Traffic Vesikel-Transport vom rER zum cis-Golgi-Apparat trans-Golgi medialer-Golgi COPII-Vesikel (engl.: coat complex II) Æ 50nm cis-Golgi rER > 10 verschiedene Proteine für COPII-Coat (-Hülle) notwendig Dresselhaus  6. Endomembransystem Vesikel-Traffic: Exozytose Vesikel-Transport vom trans-Golgi-Apparat zur PM extrazellulär Plasmamembran Lysosom Trans-Golgi-Netz (TGN) Vakuole trans-Golgi Cytosol medialer-Golgi cis-Golgi Dresselhaus  6. Endomembransystem Übersicht Kernhülle/rER mit Ribosomen Golgi-Komplex Rückhol- (Retrieval) primäres Lysosom sekretorische Vesikel Wege spätes Endosom/Lysosom Exportwege Importweg frühes Endosom Plasmamembran Dresselhaus  6. Endomembransystem Vesikel-Traffic Rücktransport von ER-Proteinen aus dem Golgi in COPI-Vesikel COPI-Vesikel Æ 50nm Dresselhaus  6. Endomembransystem Vesikel-Traffic Rückhol- (Retrieval-) Wege Rücktransport von ER-Proteinen aus dem Golgi-Komplex Ø lösliche ER-Proteine: C-terminale KDEL Sequenz; KDEL Rezeptor im ER, Rücktransport via Vesikel. K=Lysin, D=Aspartat, E=Glutamat, L=Leucin Ø ER-Membranproteine: C-terminale KKXX Sequenz (X = jede AA) Dresselhaus  6. Endomembransystem Übersicht Kernhülle/ER mit Ribosomen Golgi-Komplex Rückhol- (Retrieval) primäres Lysosom sekretorische Vesikel Wege spätes Endosom/Lysosom Exportwege Importweg frühes Endosom Plasmamembran Dresselhaus  6. Endomembransystem Vesikel-Traffic Selektion von Ladung und Zielkompartimenten 1. Selektion der Ladung F “Ladungs-Rezeptor“ 2. Container-Bildung F Sec-Proteine (engl. secretion) (Transport-Vesikel) 3. Selektion und Fusion mit Zielkompartiment F SNARE-Proteine Dresselhaus  6. Endomembransystem Vesikel-Traffic Vesikel-Erkennung & Verschmelzung durch SNARE-Proteine PE 21-5 Dresselhaus  6. Endomembransystem Aufklärung des Sekretionsweges Nobel Prize in Physiology or Medicine 2013 Thomas Südhof Randy Schekman James Rothman (Stanford, USA) (UC Berkeley, USA) (Yale, USA) "for their discoveries concerning the transport and logistics of the cell" – Aufklärung molekularer Mechanismen des Protein-Transportes innerhalb der Zelle durch Vesikel. Dresselhaus  6. Endomembransystem Aufklärung des Sekretionsweges Nobel Prize in Physiology or Medicine 1974 Albert Claude Christian de Duve George E. Palade "for their discoveries concerning the structural and functional organization of the cell" - Proteine gelangen vom rER über den Golgi zur Plasmamembran und liegen dabei immer im Organell oder in Vesikeln vor. Dresselhaus  6. Endomembransystem Aufklärung des Sekretionsweges das “Palade-Experiment” Pulse-Chase- („Impuls-Verfolgungs-“) Experiment: Ø lebende Zellen werden für 3 min mit radioaktivem *Leucin (3H oder 14C markiert) gefüttert (= Pulse) Ø Überschuss an nicht-radioaktivem Leucin zugeben (Chase beginnt) Ø zu bestimmten Zeitpunkten werden Zellen geerntet, fixiert und für das EM präpariert Ø TEM-Präparate werden mit AgBr Schicht überzogen ð *Leucin gibt Schwärzung (Autoradiographie) Dresselhaus  6. Endomembransystem Aufklärung des Sekretionsweges das “Palade-Experiment” Chase-Zeit: 0 min 7 min 15 min 30 min 60min 80min 117 min Dresselhaus  6. Endomembransystem Übersicht Kernhülle/ER mit Ribosomen Golgi-Komplex Rückhol- (Retrieval) primäres Lysosom sekretorische Vesikel Wege spätes Endosom/Lysosom Exportwege Importweg frühes Endosom Plasmamembran Dresselhaus  6. Endomembransystem Endozytose – Aufnahme von Stoffen 1. Phagozytose 2. Endozytose i.e.S Clathrin- (Bakterien, Zellfragmente) Pinozytose Makropinozytose Endozytose PE 23-1 Dresselhaus  6. Endomembransystem Endozytose – Aufnahme von Stoffen Clathrin-umhüllte Endozytose extrazellulär Plasmamembran Cytosol Vesikel mit Clathrin-Coat Lysosom Æ 50nm TGN trans-Golgi medial-Golgi cis-Golgi Dresselhaus  6. Endomembransystem Endozytose – Aufnahme von Stoffen Clathrin-umhüllte Endozytose z.B. bei Rezeptor-vermittelter Endozytose PE 23-6 Dresselhaus  6. Endomembransystem Endozytose – Aufnahme von Stoffen Clathrin-umhüllte Endozytose: Hüllprotein: Clathrin (clathron = Gitter) 3x schwere 3x leichte Kette Kette „Triskelion“ „clathrin-coated pit“ Dresselhaus  Inhalte der Vorlesung Zusammenfassung þ Methoden der Zellbiologie: u.a. Mikroskopie, Zellfraktionierung þ Die Plasmamembran (Aufbau/Funktion & Transportvorgänge) þ Die Zelle der Eukaryoten: Überblick über Bau & Funktion þ Zellwand & extrazelluläre Matrix, Zellhüllen þ Zellkern, DNA, Nukleolus, Chromatin, Gen þ RNA, Ribosomen & Proteasom þ Vesikel-Traffic: ER, Golgi Apparat & Exozytose i Lysosomen, Peroxisomen & Glyoxisomen i Mitochondrien & Plastiden i Cytoskelett i Zell-Zell-Kontakte & -kommunikation i Zellteilung & Zelltod Dresselhaus  6. Endomembransystem Endosomen & Lysosomen Endosomen-Reifung & Recycling Ø Acidifizierung (Ansäu- erung) früher Endosomen Ø Reifung zum späten Endosom Ø Verschmelzung mit primärem Lysosom Ø Lysosom: Abbau PE 23-12 Dresselhaus  6. Endomembransystem Lysosomen „Magen“ und „Mülleimer“ der Zelle Aufbau: ü Größe: 0,1-1 µm ü einfache Membranumhüllung ü pH: ~5,0 ü Inhalt: saure Hydrolasen Lysosom Dresselhaus  6. Endomembransystem Lysosomen „Magen“ und „Mülleimer“ der Zelle Funktion (Abbau – Katabolismus): Ø Abbau von Proteinen, Polysacchariden, Nukleinsäuren & Lipiden Ø Aufnahme dieser Substrate von außen über Endozytose Ø saure Hydrolasen und Phosphatasen mit niedrigem pH-Optimum (Proteasen, Glykosidasen, DNasen, RNasen, Lipasen, Phosphatasen, Lysozym etc.) Lysosom Dresselhaus  6. Endomembransystem Lysosomen Definitionen (griech. heteros = fremd, autos = selbst) Heterophagie F Abbau von Fremdmaterial, welches über Endozytose aufgenommen wurde Autophagie F Abbau von Eigenmaterial, teilweise Selbstverdau Dresselhaus  6. Endomembransystem Autophagie Induktion der Autophagie z.B. durch Apoptose – programmierter Zelltod Frosch: z.B. Rückbildung aller Schwanzzellen Mensch: z.B. Rückbildung des Finger-/Zehen- zwischengewebes Dresselhaus  6. Endomembransystem Autophagie Induktion der Autophagie z.B. durch Apoptose – programmierter Zelltod apoptotische Zelle weiße Blutzelle Dresselhaus  6. Endomembransystem Autophagie - Autophagosombildung Autophagie durch Ausstülpen des glatten ER (sER) PE 24-3 Dresselhaus  6. Endomembransystem Autophagie Nobel Prize in Physiology or Medicine 2016 Yoshinori Ohsumi (Tokyo IT, Japan) "for his discoveries of mechanisms for autophagy" – Entdeckung Stress- induzierter Autophagie-Gene und Aufklärung molekularer Mechanismen der Autophagosome-Bildung Dresselhaus  6. Endomembransystem Lysosomen lysosomale Speicherkrankheiten F fehlt nur eine saure Hydrolase aufgrund eines genetischen Defekts, so kommt es zur Anhäufung ihrer Substrate Beispiel: Tay Sachs-Erkrankung: kein Abbau von Ganglio- siden (spez. Glycolipide), diese häufen sich in den Lysosomen von Nervenzellen an Folgen: geistige Behinderung, frühzeitiges Erblinden, Tod meist vor Erreichen des 3. Lebensjahres Dresselhaus  6. Endomembransystem Lysosomen Vakuole – zentrales „Lysosom“ der Pflanzen Ø erfüllt in älteren Zellen bis 95 % des Zellvolumens Ø Membran der Vakuole = „Tonoplast“ Ø in jungen Zellen mehrere kleine Vakuolen, in älteren Zellen eine große Vakuole = Zentralvakuole Ø Vakuolen kommen auch bei Pilzen vor, selten bei Protozoen Dresselhaus  6. Endomembransystem Lysosomen Funktionen der pflanzlichen Vakuole Speicher Abbau Wasserhaushalt ü Saccharose hydrolytische Enzyme: ü Wasserspeicher ü Proteine Proteasen, Lipasen, … ü Turgor ü Sekundärmetabolite ü Streckungswachstum ü Farbstoffe ü Ionen ü Xenobiotika Vergrößerung des Zellvolumens bei konstantem Volumen des Cytoplasmas F Wasser als billiges Baumaterial ! Dresselhaus  6. Endomembransystem Zusammenfassung: 3 Arten von Zytosen - Endozytose: 1. Phagozytose / 2. Clathrin-vermittelte Endozytose - Exozytose: 3. i.d.R. vom Trans-Golgi zur PM (2 Typen) - 4. Transzytose (bei Pflanzen ?) pH 6 pH 5 pH 7 Dresselhaus  7. Abbau von Zellkomponenten Zusammenfassung: Katabolismus 1. Autophagie (u.a. Autophagosom, PCD) – Heterophagie 2. Lysosomen (primär / sekundär – ist aktiv, Verdauung) 3. Ubiquitin-Proteasom-Weg ! Dresselhaus  Inhalte der Vorlesung Zusammenfassung þ Methoden der Zellbiologie: u.a. Mikroskopie, Zellfraktionierung þ Die Plasmamembran (Aufbau/Funktion & Transportvorgänge) þ Die Zelle der Eukaryoten: Überblick über Bau & Funktion þ Zellwand & extrazelluläre Matrix, Zellhüllen þ Zellkern, DNA, Nukleolus, Chromatin, Gen þ RNA, Ribosomen & Proteasom þ Vesikel-Traffic: ER, Golgi Apparat & Exozytose i Lysosomen, Peroxisomen & Glyoxisomen i Mitochondrien & Plastiden i Cytoskelett i Zell-Zell-Kontakte & -kommunikation i Zellteilung & Zelltod Dresselhaus  7. Abbau von Zellkomponenten Zusammenfassung: Katabolismus 1. Autophagie (u.a. Autophagosom, PCD) – Heterophagie 2. Lysosomen (primär / sekundär – ist aktiv, Verdauung) 3. Ubiquitin-Proteasom-Weg ! Dresselhaus  7. Abbau von Zellkomponenten Ubiquitin-Proteasom-Weg Abbau von Proteinen im Cytoplasma & im Zellkern 1 2 abzubauendes Protein 3 F Proteasom-Weg ist in allen Eukaryonten konserviert und somit ubiquitär ! Dresselhaus  7. Abbau von Zellkomponenten Ubiquitin-Proteasom-Weg abzubauende Proteine werden durch Ubiquitin markiert poly-Ubiquitinierung Ubiquitin hoch konserviertes Protein 76 Aminosäuren (aa) abzubauendes Protein PE 24-7/PDB Dresselhaus  7. Abbau von Zellkomponenten Ubiquitin-Proteasom-Weg Ubiquitin-Konjugation ist ein 3-stufiger Prozess 1. Aktivierung: E1 = Ubiquitin-aktivierendes Enzym 2. Übertragung auf Träger-Protein: E2 = Ubiquitin-Carrier-Proteine 3. Übertragung auf Substrat-Protein: E3 = Ubiquitin-Ligase (e.g. Parkin) PE 24-8 Dresselhaus  7. Abbau von Zellkomponenten Ubiquitin-Proteasom-Weg Struktur des Proteasoms (in der Zelle nur 26S) 19S-Partikel (regulatorische UE): reguliert den Zugang, Erkennung und Entfaltung (ATPase) abzubauender Proteine; besteht aus vielen Proteinen 20S 23S 26S 20S-Partikel (katalytische UE): enthält die proteolytische Aktivität; besteht nur aus 2 unterschiedlichen Proteinen PE 24-5 Dresselhaus  7. Abbau von Zellkomponenten Ubiquitin-Proteasom-Weg Struktur der 20S-UE des Proteasoms: katalytische UE F die katalytische UE besteht aus nur 2 unterschiedlichen Proteinen (4x7 Proteine) 20S 20S PE 24-5 Dresselhaus  7. Abbau von Zellkomponenten Ubiquitin-Proteasom-Weg Zerlegen von Proteinen in der 20S-UE des Proteasoms PE 24-6 Dresselhaus  7. Abbau von Zellkomponenten Ubiquitin-Proteasom-Weg Nobelpreis für Chemie 2004 Aaron Ciechanover Avram Hershko Irwin Rose "for the discovery of ubiquitin-mediated protein degradation" Dresselhaus  7. Abbau von Zellkomponenten Ubiquitin-Proteasom-Weg Zusammenfassung Ø der Ubiquitin-Proteasom-Weg ist der Hauptabbauweg für Proteine (Vorkommen: Cytoplasma, Zellkern) Ø Ubiquitin (76 aa) markiert Proteine zum Abbaus (Poly-Ubiquitinkette) Ø Ubiquitin-Übertragung ist ein 3-stufiger Prozess (E1, E2, E3) Ø das Proteasom ist ein Multi-Protein-Komplex und besteht aus 2 regulatorischen und einer katalytischen UE Dresselhaus