4. gyakorlat PDF - Molekuláris Biológia Laborgyakorlat

Molekuláris Biológia MScD laborgyakorlat, 4. gyakorlat pET-Pfu plazmiddal transzformált Rosetta (DE3) telepek leoltása Cél: Overnight starter kultúra indítása a pET-Pfu plazmiddal transzformált Rosetta sejtekből. Módszer: A lemezen kinőtt telepek közül 1 leoltása fogpiszkáló segítség...

Molekuláris Biológia MScD laborgyakorlat, 4. gyakorlat pET-Pfu plazmiddal transzformált Rosetta (DE3) telepek leoltása Cél: Overnight starter kultúra indítása a pET-Pfu plazmiddal transzformált Rosetta sejtekből. Módszer: A lemezen kinőtt telepek közül 1 leoltása fogpiszkáló segítségével steril fülkében, 5 ml LB+Amp+Chlr – t tartalmazó tápoldatba, növesztés 37°C-on éjszakán át. Anyagok és oldatok: LB tápoldat Steril fogpiszkáló pET-Pfu-val transzformált Rosetta (DE3) sejtek indukálása IPTG ill. laktóz segítségével Cél: A pET-Pfu plazmiddal transzformált Rosetta sejtek indukciója, az indukált minták levétele. Módszer: a baktériumok növesztése LB táptalajon majd a fehérje termelés indukciója manuálisan Elméleti háttér: pET vektor alapú prokarióta expressziós rendszer indukciója IPTG-vel illetve laktózzal Láthattuk, hogy T7 RNS polimeráz génjének szabályozása a lac operon szabályozásához vált hasonlatossá, így az expressziós rendszer laktózzal és laktózzal analóg molekulával, pl. IPTG (izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozid) indukálható. Ha IPTG-t adunk a pET vektort hordozó BL(DE3) E. coli sejtekhez, akkor a T7 RNS polimeráz génje felszabadul a lac represszor általi gátlás alól, és a sejtben megjelenik az aktív T7 RNS polimeráz. Mivel ez egy virális eredetű fehérje, általa felismert promóter szekvencia a baktérium genomban nem, egyedül csak az általunk bejuttatott pET vektorban található meg. Így nagyon szelektíven csak az általunk termeltetni kívánt fehérje génjét írja át a T7 RNS polimeráz. A bejutatott IPTG indukáló szer a pET plazmidon a T7 promóter és az általunk termeltetni kívánt fehérje génje között elhelyezkedő lac operátor régióban is megakadályozza a lac represszor fehérje kötődését, így lehetővé teszi a fehérjénk kifejeződését. Források: http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Causey/pET.html Blaber M. 1998 Spring. Web Page for Lecture 25 of Molecular Biology and Biotechnology Course: Prokaryotic Expression Vectors Robert Novy, Don Drott, Keith Yaeger and Robert Mierendorf : Overcoming the codon bias of E. coli for enhanced protein expression, in Novations, number 12, June 2001 A gyakorlat menete: A felnőtt „over night” startert átoltani 60 ml LB+Amp.+Cam-ba, növesztés OD=0.7-ig (1,5-2h legalább). Ezt a lépést a technikus végzi el! Indukció: - Egyik páros: 200 mM IPTG (1 mM vcc) - Másik páros: 20% Laktóz (0,2% vcc) Jegyezze fel az indukció időpontját a mintavételek pontos levétele miatt! Mintavételek rendje: - 1. Mintavétel 0h (IPTG/Laktóz bemérésekor): 1 ml - 2. Mintavétel 45 min: 1ml - 3. Mintavétel 90 min: 1 ml, 5 ml, 40 ml Az 1 ml-es mennyiségek centrifugálása 13000 rpm 1 percig, felülúszót eldobjuk és a pelletet - 20°C-on tároljuk. Az 5 ml-es és 40 ml-es mintákat is centrifugáljuk 4000 rpm 10 percig, mindkettőt fagyasztóba (- 20C eltenni. Tehát minden párosnak lesz 3 db 1ml-s lefugált mintája (0h; 45 min és 90 min) és további 2 minta (90 min 5ml, 90 min 40 ml). Anyagok és oldatok: 200 mM IPTG 20% laktóz LB tápoldat