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Hit Discovery HTS screening Hit: una molecola organica iniziale capostipite di una nuova classe di prodotti in un programma di ricerca – Attività micromolare verso il target biologico – Basso peso molecolare (es: MW 150-250) – Assenza di gruppi funzionali indesiderati – Trattabilità chimica ed espan...

Hit Discovery HTS screening Hit: una molecola organica iniziale capostipite di una nuova classe di prodotti in un programma di ricerca – Attività micromolare verso il target biologico – Basso peso molecolare (es: MW 150-250) – Assenza di gruppi funzionali indesiderati – Trattabilità chimica ed espandibilità – Spazio brevettuale sufficiente Lead: una molecola organica già parzialmente sviluppata (nel corso dell’hit-to-lead process) che abbia la potenzialità di essere testata in vivo – Attività submicromolare verso il target biologico – Attività in sistemi cellulari e possibilmente in modelli in vivo – Proprietà chimico-fisiche predittive di buon comportamento in vivo (drug-likeness) – Alcune proprietà ancora da ottimizzare per farne un prodotto di uso clinico (es. Solubilità, legame alle proteine del plasma (PPB), stabilità metabolica, etc.) Screening e highthroughput screening (HTS) Per HTS si intende un processo tramite il quale un numero elevato di molecole può essere esaminato, in modo automatizzato, per l’identificazione di un’attività farmacologica Cos’è un saggio? ! Un Sistema artificiale per determinare e quantificare l’attività biologica di un composto ! Esempi: ! ! Inibizione enzimatica ! Agonismo/antagonismo recettoriale ! Proliferazione cellulare/inibizione della crescita ! Blocco/attivazione di un canale ionico Screening biologico: ! HTS: screening biologico applicato ai grandi numeri 104-105 composti al giorno E’ richiesto un elevato grado di automazione L’uso di un saggio per identificare e caratterizzare composti con un’attività biologica. ! ! Questa tecnologia presuppone un elevato livello di automazione in molte sue compenenti: ! Pesata, diluizione e prelievo delle molecole da saggiare ! Preparazione del saggio biologico (reazione enzimatica o saggio di binding) ! Cattura dei risultati di binding o di inibizione del target Elementi necessari per condurre un HTS ! ! ! ! Una collezione di molecole da studiare: libreria molecolare Un saggio biologico adattato all’esecuzione automatizzata (BIOWARE) Una piattaforma robotizzata (HARDWARE) Un sistema computerizzato per la valutazione dei risultati (SOFTWARE) Collezione di composti per lo screening ! Una collezione e’ un insieme di composti, di diversa origine, che possono essere utilizzati per lo screening. ! Questi composti possono derivare da: - Composti proprietari sintetizzati nel corso degli anni per diversi progetti - Composti commerciali acquistati da vari fornitori Collezione di composti ! Collezioni derivanti da progetti di chimica farmaceutica: ! ! ! ! Composti naturali, prodotti di fermentazione, estratti ! ! ! ! ! I composti tendono ad essere correlati (analoghi per le SAR) Ben caratterizzati (spesso drug-like) La “storia” insegna che hits per nuovi targets spesso derivano da altri composti target Complessita’ delle miscele Riproducibilita’ nell’ottenimento dei campioni o nel far crescere gli organismi Forniscono farmaci molto importanti (antitumorali, malattie infettive) Ingegnerizzazione di microrganismi per la sintesi dei composti naturali (biologia combinatoriale) Composti derivanti dalla chimica combinatoriale ! ! Vantaggi: le collezioni possono essere progettate e possono essere anche molto numerose La grandi collezioni di composti delle grandi Svantaggi: problemi della qualita’ della libreria industrie farmaceutiche sono state costruite in questa maniera Costruzione della collezione di composti per lo screening ! Una collezione di composti viene “filtrata” prima dello screening ! Lo screening della collezione dovrebbe fornire buoni composti di partenza (hit) per lo sviluppo/ottimizzazione successivi Evitare falsi positivi Evitare composti che possono presentare problemi di varia natura (proprieta’ chimico-fisiche sfavorevoli, tossicita’ etc) Complessita’ molecolare Peso molecolare Lipofilia ! Gruppi funzionali che conferiscono reattivita’ o tossicita’ Ad es. ! ! Dopo la selezione di un bersaglio, viene definita una strategia di generazione di lead. ! Elaborazione HTS di un saggio primario ! Saggi secondari per la conferma e la validazione degli hit. L'obiettivo generale è ! la generazione di un gran numero di hit validati con una vasta diversità chimica ! l'identificazione di diverse serie di lead con relazioni ben definite tra struttura e attività. Questi composti entrano poi in un processo di ottimizzazione del lead. Target dei saggi Recettori accoppiati a proteine G ! Binding assays detect compounds that are ligands of the receptor ! Functional assays probe the signaling of the receptor within the cell. ! Direct measurement of G-protein activation using the non-hydrolyzable GTP analogue 35S-GTPgS. ! Fluorescent GTP analogues that show an enhancement of their emission upon binding to the Ga subunit. ! Determination of the concentration change of secondary messengers upon receptor activation due to the action of the effector proteins AC and PLC ! cAMP: detection of the cAMP produced by the cell in a competition assay with a labeled cAMP analogue (tracer) and a mono- or polyclonal cAMP antibody ! Ca2+: cell-based fluorimetric assays Operazioni da effettuare per un saggio convenzionale Assay ! Per effettuare un saggio di binding con ligando radiomarcato, sono necessarie diverse operazioni: ! Preparazione dei campioni: Si preparano campioni contenenti il recettore di interesse, ad esempio proteine o tessuti cellulari, in un ambiente appropriato per il saggio. ! Aggiunta del ligando marcato + ligando da testare a varie concentrazioni e incubazione dei campioni: I campioni contenenti il recettore vengono incubati con il ligando radiomarcato. Questo permette al ligando di legarsi al recettore, se presente, formando il complesso ligando-recettore. Se è presente un composto che compete con il ligando radiomarcato si osserverà una diminuzione della radioattività ! Separazione del complesso ligando-recettore non legato: Dopo un periodo di incubazione, si procede alla separazione del complesso ligando-recettore legato dal ligando non legato. Questo può essere fatto tramite diverse tecniche, come la centrifugazione o la filtrazione. ! Misurazione della radioattività: La quantità di ligando radiomarcato legato al recettore viene misurata utilizzando un contatore di radioattività. Questa misura fornisce informazioni sulla quantità di legame tra il ligando e il recettore, consentendo l'analisi del saggio. Questi sistemi permettono di quantificare la funzione biologica Come si misura l’attività? ! Both cell-free and cell-based assays can be performed in a heterogeneous or homogeneous format. ! Heterogeneous assays are multistep assays that can involve multiple additions, incubations, washings, transfer, filtration, and reading of the signal. ! ! The homogeneous assays, also called “mix-and-measure assays” ! ! These assays are labor-intensive, generally more difficult to automate, and in most cases only medium-throughput assays. All components of the assays are added in a stepwise manner, or ideally as mixtures, and the signal is ultimately read by a plate reader. Molti formati differenti, comprendenti: ! ! ! Tracers radioattivi Sistemi fluorescenti, luminescenti e colorimetrici Sistemi cellulari che possono includere metabolismo, potenziali di membrana e misure di sistemi reporter accoppiati alla trascrizione Metodi di lettura in HTS ! Metodi radioattivi ! Prodotti o ligandi radiomarcati devono essere separati dal substrato radioattivo o dal radioligando libero per filtrazione, precipitazione o adsorbimento ! Altamente sensibili e quindi possono essere miniaturizzati ! Fasi di separazione e/o lavaggio possono essere laboriosi ! La preparazione di traccianti marcati puo’ essere difficoltosa ! ! Scintillation Proximity Assays sono metodi di seconda generazione Si dividono in saggi di binding e saggi funzionali (es. Misurazione dell’attivazione della proteina G usando l’analogo non idrolizzabile del GTP, 35S-GTPgS) Scintillation Proximity Assay (SPA) ! Un agente di scintillazione viene incorporato su una microsfera e il target di interesse viene immobilizzato sulla sfera. ! 3H e 125I (emettono particelle b a bassa energia) ! No 14C, 35S o 33P (la radiazione b-arriva a distanze troppo elevate) ! Le microsfere sono fatte di yttrio silicato coperto con ioni di cerio come agente di scintillazione SPA bead SPA bead Low energy radioisotopes (3H and 125I) as labels due to their short range electron emission When bound close to a solid scintillator surface during the binding reaction, electron energy is transferred to the scintillator and the resulting photons can be captured by scintillation counting Electrons emitted from labeled molecules not close to the surface dissipate their energy and are not detected. Binding assays can take advantage of this technology and avoid the usual filtration or washing procedures. Saggi di binding recettoriali: recettori immobilizzati e ligandi radiomarcati SPA bead Aumento del segnale (Sintetasi): substrato accettore biotinilato, substrato donatore radiomarcato SPA bead Diminuzione del segnale (enzimi idrolitici): substrato radiomarcato legato via biotina a microsfere ricoperte di avidina P SPA bead SPA bead L’azione di enzimi come polimerasi, trasferasi e kinasi causano il trasferimento della radiomarcatura sul substrato biotinilato. Dopo la reazione il prodotto radiomarcato viene catturato dalla streptavidina che riveste la perla, causando una aumento del segnale Cattura del prodotto: prodotto radiomarcato catturato via anticorpo Nucleasi, proteasi, esterasi, fosfolipasi Peptidi fosforilati dall’azione delle kinasi FlashPlates - SPA senza microsfere Legame del recettore o del target sulla piastra Tracciante radiomarcato Solo il tracciante legato viene misurato With an appropriate substrate it is possible to measure the activity directly by recording the color change in the well that originates from the differences in the absorbance spectra between the educt and the product of the reaction. In cases where the educt and product are colorless, a further chemical reaction is carried out to produce a colored final product. Metodi di lettura in HTS Metodi colorimetrici I metodi colorimetrici usano la densita’ ottica della soluzione nel pozzetto o il suo cambiamento come parametro di lettura Saggi di assorbanza: Il NADH assorbe a 340 nm, NAD+ non assorbe….misurazione dell’attivita’ delle deidrogenasi Saggi cromogenici: un substrato contenente un cromoforo modificato durante una reazione ! Bassa sensibilita’ rispetto ai saggi fluorimetrici o radioattivi Interferenza da parte di composti colorati della libreria Sensibilita’ della lunghezza del cammino ottico e cambiamento del menisco per aggiunta del composto al pozzetto Metodi di lettura in HTS ! Metodi fluorimetrici Altamente sensibili – adatti alla miniaturizzazione ! Fluorescence polarization (FP) ! Fluorescence Resonance Energy Transfer La fluorescenza e’ un processo ciclico di assorbimento ed emissione di fotoni da parte di un fluoroforo L’assorbimento di un fotone da una sorgente luminosa (lampada a incandescenza o laser) determina l’eccitazione del fluoroforo Passaggio da So a S1 Dopo pochi nanoseondi (parte dell’energia e’ dissipata come calore o con altri processi che dimunuiscono la probabilita’ che avvenga l’emissione di fluorescenza) il fluoroforo torna allo stato di riposo emettendo un fotone (ad una lunghezza d’onda diversa da quella di assorbimento ! Metodi fluorimetrici ! I fluorofori sono generalmente rigidi, planari ed estesamente coniugati attraverso sistemi p. ! Grandezza e PM ! Solubilita’ in soluzione acquosa (evitare lo stacking) ! Differenza tra lunghezze d’onda di emissione e assorbimento ! Coefficiente di estinzione (probabilita’ di assorbimento) ! Efficienza quantica (probabilita’ di emissione) ! Tempo di vita dello stato eccitato …..con proprieta’ ottimizzate la sensibilita’ dei metodi fluorimetrici e’ da 100 a 1000 volte superiore rispetto ai saggi colorimetrici Saggi ad intensita’ di fluorescenza ! Viene letto un aumento o diminuzione dell’intensita’ di emissione Saggi fluorogenici: il reagente non e’ fluorescente e il prodotto e’ un fluoroforo o viceversa (reazioni enzimatiche) Quenching della fluorescenza: il cambiamento di fluorescenza origina dall’interazione fisica del fluoroforo con un un ambiente locale o con un marker non fluorescente ! quenching dinamico ! quenching statico The peptide substrate is labeled at the amino terminus with EDANS as a donor fluorophore and at the carboxyl terminus with DABCYL. In the intact peptide, fluorescence resonance energy transfer (FRET) from EDANS to DABCYL results in quenching of the EDANS fluorescence. On cleavage of the peptide by HIV protease, the fluorescence of EDANS is restored. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) ! ! ! ! Il FRET e’ il trasferimento non-radiante di energia tra una molecola donatrice e una accettrice Sovrapposizione tra l’emissione del donatore e l’assorbimento dell’accettore Il trasferimento di energia dipende dalla distanza tra accettore e donatore Le distanze coinvolte sono quelle rilevanti in biologia ! The FRET donor is a coumarin dye, which is covalently linked to a phospholipid. ! The acceptor is a highly fluorescent, membrane-soluble anionic oxonol dye. ! When the cell membrane is loaded with the dyes, the phospholipid anchors the coumarin donor to the outside of the cell, whereas the oxonol dye is accumulated in the cell membrane. ! The distribution of the anionic oxonol in the membrane depends on the polarity of the membrane potential: if the oxonol dye is located on the extracellular side of the membrane in close proximity to the coumarin donor, FRET occurs and the emission is mostly at 580 nm. ! If the polarity changes, the oxonol rapidly translocates to the intracellular side of the membrane, too far from the coumarin donor for FRET, and the emission is mostly at 460 nm. Fluorescence polarization (FP) ! La tecnica FP usa una luce polarizzata di eccitazione per rilevare cambiamenti nella mobilita’ rotazionale di un fluoroforo. ! In seguito a illuminazione con una luce linearmente polarizzata il fluoroforo in soluzione ha la massima possibilita’ di assorbire un fotone quando ha una orientazione parallela al vettore della luce incidente ! Se la molecola fosse ferma l’emissione sarebbe anch’essa fortemente polarizzata ! In realta’ durante l’eccitazione il fluoroforo puo’ ruotare: diffusione rotazionale ! rho: Tempo di correlazione rotazionale ! (T, viscosita’ e volume molecolare) ! tau: tempo di vita dello stato eccitato ! Se rho > tau emissione polarizzata ! Se rho < tau emissione non polarizzata Tipi di saggi ! Aumento della grandezza: saggi di competizione ligando-recettore ! Diminuzione della grandezza: una molecola fluorescente grande viene degradata ad una piu’ piccola (proteasi etc) ! Saggi indiretti: saggio competitivo in cui un prodotto non marcato di una reazione enzimatica compete con un tracciante fluorescente per il legame ad un anticorpo specifico Chemioluminescenza e bioluminescenza Processi in cui la luce viene generata durante reazioni chimiche o biologiche (reazioni esotermiche in cui una parte dell’energia di reazione viene convertita in fotoni) ! Chemioluminescenza: la molecola e’ convertita in un prodotto finale stabile dopo decadimento di un intermedio instabile ! Bioluminescenza: include reazioni di fotoproteine come aequorin ed enzimi come le luciferasi - Flash luminescence: reazione veloce che produce un segnale luminoso molto intenso ma di breve durata - Glow luminescence: la reazione e’ piu’ lenta e il segnale luminoso ha una maggiore durata. The AequoScreenTM system developed by Euroscreen utilizes this bioluminescent Ca2+-indicator in cell-based assays. AlphaScreen ! This principle senses the proximity of two beads, a donor and an acceptor bead, which is mediated by the interaction of molecules on the surfaces of the two beads. ! The donor beads contain the photosensitizer phthalocyanine, which absorbs light at 680 nm and converts ambient molecular oxygen to the highly reactive, excited singlet-state oxygen ! The lifetime of the excited singlet state is 4 ms, corresponding to a diffusion length for 1O2 in aqueous solution of 200 nm. The acceptor beads contain a thioxene derivative, which reacts with 1O2 to generate chemiluminescence at 370 nm. In addition, the acceptor beads contain fluorophores, which immediately absorb the chemiluminescence and shift the emission to wavelengths in the range from 520 nm to 620 nm. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) ! Metodo per valutare interazioni proteina-proteina ! Una luciferasi bioluminescente viene fusa ad una proteina candidato ! Una green fluorescent protein (GFP) viene fusa all’altra proteina di interesse ! La reazione della luciferasi genera bioluminescenza blu ! Se le due proteine sono vicine si ha un trasferimento di energia alla GFP ! Il colore della luce di emissione cambia dalla bioluminescenza blu alla biofluorescenza eccitata verde Identificazione degli Hits ! Processo - Il risultato dello screening di un grande numero di composti e’ solitamente una tabella che riporta la % di inibizione di ogni composto - Da questa lista occorre selezionare quali composti inviare alla riconferma, che consiste nella determinazione del valore di IC50 - La selezione puo’ anche essere basata su una percentuale soglia (cut off) di inibizione Active hydrazones Compounds to be tested -Modifications at Ar Compounds to be tested -Modifications at the linker Binding Site Analysis NDM-1, 249 ų VIM-2, 320 ų IMP-18, 319 ų The AA involved in metal coordination: Zn1: His-His-His Zn2: His-Asp-Cys IMP-1 (PDB ID: 1DD6) was used to model IMP-18; sequence identity 83%. Homology modeling was performed in Prime by using a single template based alignment and default settings due to the high degree of identity. The binding site was analyzed by means of SiteMap (Schrödinger). High-Throughput Docking 16 compounds selected for testing: 2 hits active on VIM-2 7 hits active on NDM-1 4 hits active on IMP-18 Our library: 5-, 6-, 7-membered heterocycles bicyclic and tricyclic structures chiral compounds peptides and peptidomimetics …. 1 hit active on both VIM2and NDM-1: Cpd 1 2 hits active on both NDM-1 and IMP-18 1st selection: ChemScores (> 40), visual inspection & unique cluster solution 2nd selection: predicted logP & logS, MW, and chemical tractability Hydrazonelinker Heterocyclic core Zinc-binding group PAINS: Pan-assay interference compounds Triaging of hits must always be done with an awareness of the target class and the specific goals of the project in mind. For example, cysteine protease inhibitors require a reactive functional group, although those may be undesirable for other targets. The AIDS drug AZT (also known as zidovudine or ZDV) contains an azide functional group The anti-cancer drug ixabepilone contains an epoxide function both are reactive functionalities that would be eliminated by some filters. There is also a growing appreciation that careful installation of reactive functionalities in certain cancer drugs can lead to very effective enzyme inhibitors. By some estimates, approximately 25% of known drugs would be eliminated by these filters. Lo screening identifica composti attivi Quale strategia di screening? Gli aspetti da considerare ! Considerazioni tecniche ! ! ! ! Formato del saggio Approvvigionamento di reattivi, cellule e tessuti Costi Considerazioni biologiche/mediche ! ! ! ! ! ! Validazione dei biomarker per la predizione dell’efficacia clinica Il meccanismo è stato completamente elucidato? Validazione del target Fornitori e proprietà delle molecole da sottoporre a screening First in class vs classi già validate Differenza rispetto ad altri medicinali Saggio biochimico o cellulare? ! Saggio biochimico ! Target purificato (enzima, intereazione proteina/proteina, recettori (solubili o di membrana) ! Specificità ! SAR precisa Espressione e purificazione del target HTS: formato del saggio Volumi: 3-15 uL Capacità delle piastre: 96 vs 384 vs 1536 ! Saggio cellulare ! Molti target contemporaneamente ! Promiscuità SAR influenzata da altre proprietà del composto Compatibilità delle cellule con il saggio Lo screening fornisce dati di IC50 o EC50 La curva dose-risposta dipende dal tipo di saggio Effetti di competizione possono spostare la curva dose-risposta in condizioni di equilibrio Slow Binding Kinetics can Limit Competition in Non-equilibrium Systems Il meccanismo di azione molecolare (MMOA) ! MMOA: meccanismo biochimico attraverso il quale le interazioni strutturali tra il farmaco e il suo target determinano una risposta funzionale ! ! include aspetti cinetici e i cambiamenti conformazioni che forniscono scpecificamente una risposta terapeuticamente utile E’ diverso dal meccanismo di azione: Definizione del sistema in cui i farmaci agiscono ! antiinfiammatorio ! antiistaminico ! antivirale MMOA-pharmacological hot spot Aspirina e ibuprofene: due medicinali, un target, differenti meccanismi molecolari, utilizzi diversi ! L’acido acetilsalicilico ha attività antipiastrinica mentre gli altri FANS non ce l’hanno ! ! ! efficace nella prevenzione delle malattie atero-trombotiche Entrambi si legano al sito attivo delle cicloossigenasi 1 e 2 ! L’acido acetilsalicilico causa una inattivazione irreversibile per acetilazione della Ser530 ! L’ibuprofene e altri FANS sono reversibili L’azione irreversibile dell’aspirina nelle piastrine determina effetti anti-trombotici a lungo termine ! le piastine non hanno la capacità di risintetizzare nuova proteina Modulatori del recettore per gli estrogeni: un target, meccanismi molecolari diversi, utilizzi diversi ! Il ligando induce cambiamenti conformazionali che reclutano coattivatori e corepressori in maniera contesto-specifico ! Il differente utilizzo terapeutico dipende sulle conformazioni uniche e specifiche indotte dal ligando Estradiolo: agonista ! ! ! Tamoxifene SERM (modulatore selettivo del recettore degli estrogeni) ! ! deficienza ormonale post-menopausa cancro al seno Raloxifene SERM ! osteoporosi