FARM-310 2024 EPO, IFNs, & G-CSF - PDF

Jeltsch Lab FARM-310 (Biologiset Lääkevalmisteet, peruskurssi) - Luento 4 Slide 1 of 68 & UH Terapeuttiset proteiinit II: Erytropoietiini, interferonit, & G-CSF Luennoitsija: Michael Jeltsch, Farmasian tiedekunta, Helsingin yliopisto Kurssi: FARM-310 Basics of Biopharmaceuticals/Biologiset lääkevalmisteet, peruskurssi Syyslukukausi 2024 Tämän esitelmän viimeisin versio: mjlab.ﬁ/FARM-310-4-FIN Lecture slides in English: mjlab.ﬁ/FARM-310-4 Ladattavat ja muokattavat lähdetiedostot: mjlab.ﬁ/FARM-310-4-ﬁles Kaikki tämän esityksen aineisto on lisensoitu CC BY-NC-SA 4.0 -lisenssillä, paitsi jos toisin on Linkki attribuutioon (jos tekijä ei ole Michael Jeltsch) merkitty, kuten oikealla on esitetty. Jeltsch Lab Sisällys Slide 2 of 68 & UH Sisällysluettelo Käsitteet Erytropoietiini Glykosylaatio-tekniikka EPO-lääkkeiden 3 sukupolvea PEGylointi Interferonit Aminohapposekvenssin muuntelu IFN alfa E. coli ja CHO solut IFN beta G-CSF (ﬁlgrastiimi) Filgrastiimi-lääkkeiden 3 sukupolvea Jeltsch Lab Biologisten lääkevalmisteiden kirjo Slide 3 of 68 & UH Rokotteet Geeniterapia Soluterapia Proteiinit Siirteet “Elävä” virus Virukset Kantasolut Vasta-aineet: Solu-, elin- & “Kuollut” virus DNA (autologinen polyklonaalinen kudossiirteet Rekombinantti- RNA uudistava (“antiseerumi”) & (luuydin, veri, rokotteet hoito) monoklonaalinen verituotteet) DNA/RNA- Autologiset Proteiini- Ulostesiirre rokotteet & hormonit, Kseno- allogeeniset kasvutekijät & transplantaatio Tolerogeenit solut sytokiinit Biomateriaalit (CAR-T) Entsyymit Proteiinitoksiinit Jeltsch Lab Neljä suurinta proteiinilääkkeiden luokkaa (esimerkkeineen) Slide 4 of 68 & UH Neljä suurinta proteiinilääkkeiden luokkaa Kasvutekijät/sytokiinit/proteiinihormonit (enimmäkseen ihmisen proteiineja) - Darbepoetiini α, erytropoietiini/”epo”, Aranesp®: lisäävät punasolujen tuotantoa luuytimessä - Insuliini (Hypurin®, Humulin®, Novolin®, Fiasp®, jne.): diabeteksen hormoni-korvaushoito Toksiinit (bakteeri-, eläin-, kasviperäisiä, jne. proteiineja) - Ziconotide, ω-MVIIA, Prialt®: kipulääke - Botulinumtoksiini, OnabotulinumtoxinA, BOTOX®: lihasrelaksantti Entsyymit - TPA (Activase®): verihyytymien liuotus - DNaseI (Dornase α/Pulmozyme®): kystisen ﬁbroosin aiheuttaman liman liuotus - Adenosiini deaminaasi (ADA): korvaushoito SCID-potilailla (vaikea periytyvä immuunipuutos) Vasta-aineet - Tetanus (jäykkäkouristus) antitoksiini (anti-tetanus toksiini polyklonaalinen vasta-aine, “antiseerumi”): passiivinen immunisaatio/altistuksen jälkeen otettava rokote - Avastin™, bevacizumab (anti-VEGF-A monoklonaalinen vasta-aine): syöpälääke Jeltsch Lab Proteiinilääkekohteet Slide 5 of 68 & UH Proteiinikääkkeen kohteena voi olla joko 1. se itse (= korvaushoito tai täydentäminen): insuliini, ADA (adenosiini deaminaasi, “kuplapoika”), EPO, IFN, G-CSF 2. vasta-aineen antigeeni tai entsyymin substraatti (= inhiboiva tai neutraloiva terapia): moni uusi syöpälääke, TPA (kudoksen plasminogeeniaktivaattori), DNaseI 3. kasvin, eläimen tai bakteerin toksiini Jeltsch Lab Erytropoietiini Slide 6 of 68 & UH Erytropoietiini (“EPO”) image credit On munuaisten tuottama hormoni selkärankaisilla. Edistää punasolujen tuotantoa. image credit Nimi erytropoietiini keksittiin Suomessa Eeva Jalaviston & Eva Bonsdorfﬁn toimesta vuonna 1948*. Eeva Jalavisto image credit Jeltsch Lab HIF Slide 7 of 68 & UH Fysiologian ja lääketieteen Nobelin palkinto 2019 (Gregg L. Semenza, William G. Kaelin Jr., Peter J. Ratcliffe): Miten happipitoisuuden säätelemä geeniekspressio toimii? Jeltsch Lab Efektiivinen happipitoisuus eri korkeuksilla Slide 8 of 68 & UH Korkeus (m) Effective O2-conc (%) Esimerkki 0 20.9 Helsinki Matala 500 19.6 Levi, Ruka 1000 18.4 Saana Keskikorkea 1500 17.3 Boulder (Colorado); ~ Halti (Suomi/Norja) 2000 16.3 Mexico City, paine lentokoneessa 2500 15.3 Aspen (Colorado); Galdhøpiggen (Norja) Korkea 3000 14.4 Zugspitze (Saksa) 3500 13.5 4000 12.7 ~ Mt. Fuji (Japani) Erittäin korkea 4500 11.9 5000 11.2 Mt. Blanc (Italia/Ranska), korkeimmat pysyvät asutukset (Peru, Tiibet) 5500 10.5 6000 9.9 Kilimanjaro (Tansania), Denali (Mount McKinley, Alaska) Äärimmäisen korkea 6500 9.3 7000 8.7 Aconcagua (Argentiina) 7500 8.2 Erittäin 8000 7.7 äärimmäisen 8500 7.2 korkea 9000 6.8 Mt. Everest (Nepal/Kiina) Jeltsch Lab “Feedback” (takaisinkytkentä) säätely punasolujen tuotannossa Slide 9 of 68 & UH Munuaiset tuottavat EPOa kun kehon happipitoisuus on matala (“hypoksia”). HIF (hypoksian indusoima tekijä) stimuloi EPOn tuotantoa munuaisissa. EPO stimuloi punasolujen tuotantoa luuytimessä. Useammat punasolut kuljettavat enemmän happea, jolloin herätesignaali EPOn tuottamiseksi poistuu (feedback säätely). EPOn synteesi lisääntyy voimakkaasti matalahappisessa ympäristössä (esim. suurissa korkeuksissa). Jeltsch Lab Hematopoieesi Slide 10 of 68 & UH Verisolujen muodostumista stimuloi suuri joukko hematopoieettisia kasvutekijöitä Modiﬁed from https://commons.wikimedia.org/ wiki/File:Hematopoiesis_(human)_diagram.png Jeltsch Lab Erytropoietiini, primäärinen rakenne (= aminohapposekvenssi) Slide 11 of 68 & UH Kuva perustuu tähän: https://www.uniprot.org/uniprotkb/P01588 Jeltsch Lab EPO ja EPO-reseptori Slide 12 of 68 & UH Jeltsch Lab EPO-reseptorin epitooppien 3-ulotteinen orientaatio on kriittinen! Slide 13 of 68 & UH JAK-2 fosforylaatio riippuu kahden EpoR:n orientaatiosta toisiinsa nähden. Jotkut Epo-analogit (esim. EMP33) ovat vahvoja Epo-reseptorien inhibiittoreita! JAK-2 2 K- EpoR JA high afﬁnity non-activat- ing ligand R (EMP33) JAK-2 Ep o R o EpoR E p Epo 2 - A K J Jeltsch Lab Eri EPO-tuotteiden nimeäminen Slide 14 of 68 & UH Kun ensimmäiset EPO-lääkkeet kehitettiin (1980-1990), nimeämistä ei ollut vielä standardoitu*, ja jotkut tuon ajan lääkkeiden nimistä ovat säilyneet tähän päivään asti. INN-nimet (International Nonproprietary Names) = biologisten lääkkeiden yleisnimet: 1. -epoetiini + kreikkalainen kirjain: Eri EPO-tuotteet, sama aminohapposekvenssi kuin ihmisen villityyppisellä erytropoietiinillä, eroja: tuottava solulinja, puhdistusmenetelmä. 2. Etuliite + -epoetiini: EPO-tuotteet, joiden aminohapposekvenssi on muunnettu (= mutatoitu), esim. darbepoetiini-α. *https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/74475/23_4_2009.pdf Jeltsch Lab Indikaatiot Slide 15 of 68 & UH Indikaatio: Anemian hoito ja ehkäisy Munuaisten toimintahäiriöstä johtuva erytropoietiinin puutos (krooninen munuaissairaus, CKD) Anemian ehkäisy erittäin ennenaikaisesti syntyneillä keskosilla (anemia johtuu osittain monien verinäytteiden ottamisesta). Syöpäpotilaiden kemoterapian aiheuttaman anemian hoito. “Kemoterapia” estää syöpäsolujen lisäksi myös luuytimen hematopoieettisten solujen jakautumista. Punasolujen tuotannon stimuloiminen verenluovutusta varten. Käytetään useimmiten autologisissa verensiirroissa (= potilaat luovuttavat omaa vertansa valmistautuessaan leikkaukseen, joka todennäköisesti edellyttää verensiirtoa). https://thenounproject.com/ic on/chemotherapy-1250231/ Jeltsch Lab Epoetiinien rekombinanttituotanto Slide 16 of 68 & UH Rekombinantti ihmisen epoetiinien (rhEPO) tuotanto rhEPO:ta tuotetaan nisäkässoluissa, jotka on muunnettu geneettisesti siten, että ne sisältävät ihmisen erytropoietiinigeenin. Eri epoetiinien aminohapposekvenssi on identtinen ihmisen sekvenssin kanssa, mutta hiilihydraattiosat ovat enemmän tai vähemmän erilaisia. Jeltsch Lab Epoetiinien rekombinanttituotanto Slide 17 of 68 & UH INN tuotantosolulinja Tuotemerkki Yritys Päämarkkinat Epoetin alfa α CHO (Kiinanhamsterin munasarja) Epogen Amgen USA Epoetin alfa α CHO Procrit Ortho Biotech USA Epoetin alfa α CHO Eprex Johnson&Johnson/ ei-USA Janssen Epoetin beta β CHO NeoRecormon Roche Eurooppa Epoetin delta δ HT1080 (ihmisen solulinja!) Dynepo Aventis → Shire lopetettu Pharmaceuticals Epoetin theta θ CHO Eporatio Ratiopharm Eurooppa Epoetin zeta Ζ CHO Retacrit Pfitzer Eurooppa, USA Epoetin omega ω BHK (hamsterivauvan munuainen) Epomax, Elanex Pharma Itä-Eurooppa, Epomega, → Takeda Aasia, Etelä- Hemax Amerikka Jeltsch Lab N (Asn)-sidoksinen glykosylaatio Slide 18 of 68 & UH Glykosylaatio on solutyyppikohtaista: CHO (α, z), HT1080 (δ), BHK-solut (ω). Glykosylaatio on kloonispesiﬁstä (esim. kun solu tuottaa paljon EPO:a, glykosylaatioentsyymien endogeeninen määrä ei riitä täydelliseen prosessointiin). Puhdistusmenetelmä voi vaikuttaa glykosylaatioon. Kaikki EPO-tuotteet tarvitsevat stabilointiainetta (koska valmisteen proteiinimäärä on pieni). Jeltsch Lab Darbepoetiini alfa (Aranesp) Slide 19 of 68 & UH EPO-johdannainen, jossa on kaksi ylimääräistä glykosylaatiokohtaa >sp|P01588|EPO_HUMAN Erythropoietin OS=Homo sapiens (Ala30 ja Trp88). OX=9606 GN=EPO PE=1 SV=1 Viisi pistemutaatiota NXS/T-kohtien MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPP luomiseksi ("glykoengineering"). N T RLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHC Pidempi biologinen puoliintumisaika, SLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEV alhaisempi afﬁniteetti EPO-reseptoria VN T kohtaan. WQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQL HVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPD Suurempi aktiivisuus in vivo verrattuna AASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKL epoetiiniin*. KLYTGEACRTGDR Tuotetaan CHO-soluissa muunnellusta (mutatoidusta) ihmisen cDNA:sta. https://doi.org/10.1002/dta.1341 Jeltsch Lab Vertailu: Epoetiini alfa vs. Darbepoetiini alfa Slide 20 of 68 & UH CKD-hoidon aikataulut Epoetin alfa Darbepoetin alfa Jeltsch Lab Aranesp® (Darbepoetiini α) vs. CERA (pegyloitu epoetiini β) Slide 21 of 68 & UH darbepoetiini α (Amgen) Continuous erythropoiesis receptor >sp|P01588|EPO_HUMAN... activator (CERA, pegyloitu epoetiini MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPP β, ROCHE)* N T >sp|P01588|EPO_HUMAN... RLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHC MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPP SLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEV PEG VN T RLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHC WQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQL SLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEV HVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPD PEG PEG AASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKL WQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQL KLYTGEACRTGDR HVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPD AASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKL O-linked glycosylation N-linked glycosylation (wt) KLYTGEACRTGDR N-linked glycosylation (darbepoetin α) PEGylation CERA on epoetiini-beta-johdannainen, jolla on kolme potentiaalista pegylaatiokohtaa (Ala18, Lys72 ja Lys79), joista vain yksi on käytetty. Jeltsch Lab CERA Slide 22 of 68 & UH Kolme hiilihydraatti- CERA Epoetiini kiinnityskohdetta (kaikki käytetään) Pidempi bio- Hiili- hydraatti- loginen puoliintu- osa CERA misaika, pienempi afﬁniteetti EPO-reseptoriin. Proteiini- 30 kDa Suurempi osa metoksipoly- Kolme PEG aktiivisuus in vivo etyleeniglykoli- kiinnitys- verrattuna polymeeriketju kohdetta (YKSI kohde epoetiiniin. käytössä) 10.4103/1673-5374.215240 Tuotetaan CHO-soluissa. Jeltsch Lab Vertailu: Epoetiini alfa vs. Darbepoetiini alfa vs. CERA Slide 23 of 68 & UH Epoetiini alfa Darbepoetiini alfa CERA N-glykosylaatiokohdat 3 5 3 PEGylaatiokohdat 0 0 3 Sialiinihapon tähteet 14 22 14 Molekyylimassa 30.4 kDa 38.5 kDa 60 kDa Proteiini (%) 61 48 31 Keskimääräinen 7 h suonensisäinen (iv) 24 h iv 133 h iv puoliintumisaika* 19 h ihon alle (sc) 48 h sc 137 h sc *https://doi.org/10.1016/S0140-6736(06)69120-4 Jeltsch Lab Lääketieteellinen hoito vs. doping Slide 24 of 68 & UH Vaikea havaita lyhyen havaintoikkunan, Suurten annosten rhEPO:n 1. sukupolvi antaminen kolmesti mikroannostelun ja (Epoetiinit) viikossa doping endogeenisen EPO:n samankaltaisuuden vuoksi Keskipitkä rhEPO:n 2. sukupolvi Viikottainen havaitsemisikkuna, (Darbepoetiini alfa) annostelu helppo erottaa endogeenisesta EPO:sta Kahden viikon potilaat rhEPO:n 3. sukupolvi välein tai kuu- Pitkä havaitsemisikkuna, (CERA) kausittainen helppo erottaa endo- annostelu geenisesta EPO:sta Jeltsch Lab Käyttö Suomessa Slide 25 of 68 & UH *Tasolla 1000 DDD/1000 as./vrk, kaikki väestöön kuuluvat ovat jatkuvassa lääkityksessä! DDD = defined daily dose* Jeltsch Lab Käyttö Suomessa (epo-lääkkeen kokonaismyynti ~16 Mio. €/v.) Slide 26 of 68 & UH Vertailun vuoksi mainittakoon, että syöpälääkkeiden kokonaismyynti on noin 900 miljoonaa € vuodessa. TMH = Tukkumyyntihinta (wholesale price, excl. VAT) Jeltsch Lab Kilpaileva oraalinen pienimolekyylilääke Slide 27 of 68 & UH Kilpaileva lääke: Roksadustaatti (FG-4592, Evrenzo) & muut oraaliset prolyylihydroksylaation (PHD) estäjät (indikaatio: krooninen munuaissairauden aiheuttama anemia) Mekanismi: linkki #7 Toimii yhtä hyvin tai paremmin kuin epoetiinit EMA:n hyväksymä v. 2021 (saatavilla Suomessa vuodesta 2022 alkaen) On vallannut vain pienen osan mahdollisista markkinoista. Käytettiin dopingiin ennen kuin FDA hyväksyi sen! Jeltsch Lab EPO:a koskevat sekalaiset tiedot Slide 28 of 68 & UH Immuunivasteen riski epoetiinejä vastaan! Immunivaste voi hävittää kaiken endogeenisen EPO:n, mikä johtaa punasoluaplasiaan. Yleisin Eprexin ihonalaisessa annostelussa vuosina 1998-2003 (epoetiini α). Todennäköisin syy on "adjuvantin" vaikutus, joka stimuloi immuunivastetta (adjuvantti = orgaaniset yhdisteet, jotka huuhtoutuvat esitäytettyjen ruiskujen päällystämättömistä kumitulpista, kumitulpat korvattiin teﬂon-tulpilla). Potentiaalinen ongelma kaikkien proteiinilääkeiden kanssa → Puhtaus rules! https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Injection_Syringe.png Jeltsch Lab EPO:a koskevat sekalaiset tiedot Slide 29 of 68 & UH Geeniterapia? Doksisykliinisäädelty AAV-EPO johti hengenvaaralliseen autoimmuuni- anemiaan jaavanapinamallissa doi:10.1182/blood-2003-11-3845. Rapamysiinillä säädelty AAV-EPO ei aiheuttanut ongelmia (doi:10.1182/blood-2004-06-2501), mutta verratkaa eläinten määrää potilaiden määrään!!!! Dopingin vastainen testaus ei ole aina niin selkeää kuin sen pitäisi olla (in dubio pro reo): https://www.sportsintegrityinitiative.com/borderline-analysis-wada-accredited-laboratories https://leastthing.blogspot.com/2016/11/lab-times-exchange-on-problematic.html CiclismoItalia Jeltsch Lab Interferonihoito vuoden 1960 Flash Gordon-sarjakuvassa Slide 30 of 68 & UH Linkki Flash Gordon-sarjakuvaan (tekijänoikeuslain vuoksi sarjakuvaa ei saa laittaa tähän esitykseen) Jeltsch Lab 1-tyypin IFN:n viestinvälitys Slide 31 of 68 & UH 1-tyypin IFN-tuotanto on luonnollinen vaste virusinfektioihin, osa synnynnäistä immuniteettia. Jeltsch Lab Interferonit Slide 32 of 68 & UH IFN-γBP Interferonit löydettiin vuonna 1956: IFN-γ Viruksen tartuttamat solut olivat vastustuskykyisiä toisen viruksen tartunnalle. Tämä interferoiva ominaisuus voitiin siirtää infektoitu- mattomiin soluihin. Aineelle annettiin nimi "interferoni". Ensimmäinen kokeellinen hoito vuonna Mpox (“apinarokko”)-virus koodaa IFN-y:tä sitovaa 1964 epäonnistui luultavasti siksi, että proteiinia (3BES) annos ei ollut riittävän suuri. Ensimmäiset tehokkaat kliiniset kokeet IFN:llä tehtiin suomalaisen tutkijan Kari Cantellin tuottamalla ihmisen leukosyyteistä puhdistetulla IFN:llä (Valtion seerumilaboratorio, Helsinki)*. *https://www.hs.ﬁ/ihmiset/art-2000003167716.html Jeltsch Lab Kolme erilaista interferonia (IFN:a) Slide 33 of 68 & UH Jeltsch Lab Eräät interferonien antiviraaliset vaikutukset Slide 34 of 68 & UH Eräät interferonien antiviraaliset vaikutukset (monista sadoista) mRNA:n RNase L Adenosiinista iNOS induktio MHC:n lisääminen translaation aktivaatio -inosiiniin → NOᐧ tuotanto (Major Histo- estäminen editointi (vapaa radikaali) compatibility adenosiini- Complex) deaminaasin avulla* Virusksen Tartunnan ssRNA ja saaneiden solujen dsRNA eliminointi https://doi.org/10.1128/CMR.14.4.778-809.2001 Jeltsch Lab Eräät interferonien vaikutukset kasvaimiin Slide 35 of 68 & UH ➕ Immuunisolujen ➖ Lisääntynyt aktivointi: makrofagit, PD-L1:n (ohjelmoitu NK (luonnolliset solukuolema-ligandi tappaja) 1) ekspressio solut ➖ T solujen ehtyminen ➕ Lisää p53-aktiivisuus → ohjelmoitu solu- ➖ Tryptofaanin kuolema (apoptoosi) hajoaminen → immuunitoleranssi ➕ Tehostettu antigeenin esittely https://doi.org/10.18632/oncotarget.19531 Jeltsch Lab Interferoni alfa Slide 36 of 68 & UH 12 erilaista IFNα:a ihmisillä (13 geeniä). Kutsutaan myös "leukosyytti-interferoniksi", koska sitä tuottavat leukosyytit (lymfosyytit, monosyytit ja makrofagit). Vain IFN-α2 on lääketieteellisessä käytössä (poikkeus: ihmisen soluista eristetty IFN). 165 aminohappoa, glykosyloimaton (!), 4 heliksin muodostama kimppu), koko ~19 kDa. Jeltsch Lab Kaksi polymorﬁsmia/SNP:iä IFNA2-geenissä: kolme IFN-2A:n alleelia. Slide 37 of 68 & UH Vertailusekvenssi (HUGO): IFN-alfa2B; alleelit 2A ja 2C ovat harvinaisia Euroopassa, mutta niitä esiintyy afrikkalaisessa ja afro-karibialaisessa väestössä. SNP:t (yhden nukleotidin polymorﬁsmit) on yksi polymorﬁsmilaji (muut: ?) Jeltsch Lab Geneettistä sukututkimusta tekevät yritykset Slide 38 of 68 & UH Nämä yritykset eivät sekvensoi DNA:tasi. Sen sijaan ne määrittävät noin 200 000 SNP:iä. "Etninen tausta" määritetään tiettyjen SNP:iden suhteellisen frekvenssin perusteella ("probabilistinen"). Heidän algoritmiaan ei ole julkaistu, joten niitä ei voida validoida tieteellisesti. Jotkin SNP:t ovat farmakologisesti merkityksellisiä. Ne ovat usein lääkkeitä metaboloivissa entsyymeissä. Esimerkki: SNP:t tietyissä sytokromi P450 (CYP) -geeneissä voivat ennustaa tiettyjen kolesterolia alentavien statiinilääkkeiden lihashaittojen riskiä*. Tulevaisuudessa on taloudellisesti järkevää tehdä koko genomin sekvensointi jokaiselle sairaalaan tulevalle potilaalle. *https://doi.org/10.3390/jpm11070677 Jeltsch Lab Kaksi IFN-alfa2-lääkettä Slide 39 of 68 & UH Roferon-A IntronA IFN-alfa2A ja IFN-alfa2B ovat käytännössä kaikilta osin samanlaisia. Potilaat voivat itse annostella injektiona oikean annoksen määrittämisen jälkeen. Jeltsch Lab Interferoni alfa: Geenin monistuminen evoluution aikana Slide 40 of 68 & UH Joillekin lajeille on todennäköisesti eloonjäämisetua siitä, että niillä on paljon erilaisia interferoneja; voisiko selityksenä olla ehkä viruskuormitus? Human Mouse Cattle Pig Bat 17 (12) 27(2) 51 (13) 57 (16) 10 (8) Muokattu lähdeestä https://doi.org/10.1371/journal.pone.0112378 Jeltsch Lab Hepatiiti B/C Slide 41 of 68 & UH B-hepatiittivirus (HBV) tarttuu vain verikontaktin kautta. HBV-rokotuksia on olemassa. 5-10 % HBV-infektioista kroonistuu aikuisilla (~ 5 % maailman väestöstä), 30-50 % HBV-infektioista kroonistuu lapsilla. Krooninen tauti on aluksi useimmiten oireeton, mutta noin ¼ kroonisista potilaista sairastuu maksakirroosiin ja maksasyöpään. Kroonisen infektion hoito viruslääkkeillä ja https://commons.wikimedia.org/wiki/File:HBV_Genome.svg interferonilla. C-hepatiittiviruksen (HCV) aiheuttama sairaus on hyvin samankaltainen kuin hepatiitti B (mutta täysin erilainen virus, ei rokotuksia, harvinaisempi). Jeltsch Lab Interferoni alfan lääkeet Slide 42 of 68 & UH Type Brand name Chemical modiﬁcation Structure Company Source Remarks Lymphoblastoid Wellferon® None Mixture of natural human IFNs Glaxo Wellcome Lymphoblastoid Hairy cell leukemia, juvenile laryngeal papillomatosis, condylomata IFN alpha N1 alpha subtypes (Namalva) cells acuminata, chronic hepatitis B/C Natural human Alfaferone® None Mixture of natural human IFNs Alfa Wassermann Human leukocyte Hairy cell leukemia, multiple myeloma, non-Hodgkin lymphoma, follicular leukocyte IFN alpha subtypes lymphoma, chronic myelogenous leukemia, malignant melanoma, alpha AIDS-related Kaposi's sarcoma, chronic hepatitis B/C HuIFN alpha-Le Multiferon® None Human leukocyte IFN alpha Swedish Orphan Sendai Malignant melanoma; treatment of patients who initially respond to (IFN alfa-1, 2b, 8, 10, 14, 21) Biovitrum AB virus-infected recombinant IFN-alpha, but for whom treatment subsequently fails, most human leukocytes likely as the result of neutralizing antibodies; Discontinued by its Swedish producer in 2012 as non-proﬁtable. IFN alpha 2b Intron A® None 165 amino acids (19 kDa) Schering-Plough Transformed E. coli Chronic hepatitis B/C (+ antiviral drug) and multiple cancers: hairy cell Arginine at position 23, leukemia, follicular lymphoma, condylomata acuminata, AIDS-related deletion at position 44 Kaposi's sarcoma and malignant melanoma; EMA approval in 2000; administered by subcutaneous injection IFN alpha 2a Roferon-A® None 165 amino acids (19 kDa) Hoffmann – La Transformed E. coli Chronic hepatitis B/C (+ antiviral drug) and multiple cancers: hairy cell Lysine at position 23, deletion Roche Inc. leukemia, chronic myelogenous leukemia, Kaposi sarcoma, cutaneous at position 44 T-Cell lymphoma, follicular non-Hodgkin lymphoma, advanced kidney cancer, malignant melanoma; ﬁrst interferon drug in use in Europe (1986-) and Finland (1996-); administered by subcutaneous injection Consensus IFN Infergen® ≈89% homology with 166 amino acids (19.4 kDa) Kadmon Corp. Transformed E. coli Chronic hepatitis C, hairy cell leukemia (IFN alfacon-1) IFNɑ & 30% with IFNβ Pegylated IFN PegIntron® 12 kDa linear PEG 165 amino acids (19 kDa) Schering-Plough Transformed E. coli Chronic hepatitis C, t½ ~40 h (→ weekly injections), pegylation alpha 2b introduces heterogeneity w/o major pharmacological consequences Pegylated IFN Pegasys® 40 kDa branched PEG 165 amino acids (19 kDa) Hoffmann – La Transformed E. coli Chronic hepatitis B/C, t½ ~80 h (→ weekly injections), pegylation alpha 2a Roche Inc. introduces heterogeneity w/o major pharmacological consequences Pegylated IFN Reiferon Re- 20 kDa linear PEG 165 amino acids (19 kDa) Rhein- Transformed Hanse- Chronic hepatitis C alpha 2a tard® – Egypt Minapharm nula polymorpha Pegylated IFN Sylatron™ 31 kDa PEG 165 amino acids (19 kDa) Schering Corp. Transformed E. coli Melanoma after surgery alpha 2b Pegylated Pro- Besremi® 40 kDa branched PEG 166 amino acids (19 kDa) AOP Orphan Transformed E. coli Polycythaemia vera (slow-growing hematological cancer of RBCs) IFN alpha 2b Pharmaceuticals Jeltsch Lab Konsensus-interferoni Slide 43 of 68 & UH Konsensus-interferoni (interferon alfacon-1, Infergen) on tehokkaampi kuin mikään yksittäinen IFN-alfa HCV-infektion hoidossa. Poistettu EU:n markkinoilta kaupallisista syistä. Jeltsch Lab Interferoni beta Slide 44 of 68 & UH Tulehdusta ehkäisevä vaikutus Käytetään relapsoivan Terve MS-tautia multippeliskleroosin hermosolu sairastava hermosolu (MS-taudin) hoitoon Ei parantava Vaurioitunut Myeliinikalvo myeliini MS-tauti: Autoimmuunisairaus, jossa immuunisolut hyökkäävät hermosoluja ympäröivää https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Adskcxvbklawe;las.png eristettä (myeliiniä) vastaan. Jeltsch Lab Interferoni beta Slide 45 of 68 & UH Vain yksi IFNβ ihmisillä (yksi geeni: IFNB1*). Kutsutaan myös "ﬁbroblasti-interferoniksi", koska sitä tuottavat ﬁbroblastit. 166 aminohappoa, yksi glykosylaatio (Asn101), 4:n heliksin kimppu, koko ~22,5 kDa. Vai Asn80? Miksi on kaksi tapaa laskea aminohappoja? Jeltsch Lab Aminohappojen numerointi proteiineissa on hieman sotkuista Slide 46 of 68 & UH Ongelmat Päällekkäiset lukukehykset Polyproteiinit (virukset) Proteiinien isoformit ja ensymaatiset katkaisut Vasta-aineilla on omat numerointijärjestelmänsä - Kabat - Chothia - Martin - Gelfand - Honegger - IMGT Jeltsch Lab Interferoni beta lääkkeet Slide 47 of 68 & UH Tyyppi Tuotemerkki Kemiallinen Rakenne Yritys Lähde Huomautukset modiﬁkaatio IFN beta 1a Rebif®, Ei ole 166 aminohapon Merck CHO MS-tauti (multippeliskleroosi), Avonex tähdettä (22.5 kDa) Europe B.V., kerran viikossa lihaksensisäinen Biogen tai kolmesti viikossa ihon alle Netherlands (itsehoito) B.V. IFN beta 1b Betaferone®, Ei ole 165 aminohapon Bayer AG, E. coli MS-tauti, joka toinen päivä ihon Extavia* tähdettä (18.5 kDa) Novartis alle (itsehoito) (ensimmäinen Met Europharm puuttuu), Cys38→ Ltd. Ser (se ei muodosta disulﬁdisidosta!) PEG-IFN Plegridy® 20 kDa 166 aminohapon Biogen CHO Pidempi puoliintumisaika beta 1a mPEG-O-2-methylpr tähdettä (~44 kDa) Netherlands verrattuna ei-pegyloituun IFN opionaldehyde B.V. beeta 1:een; EMA-hyväksyntä (mPEG) konjugoituna 2014, ihon alle kahden viikon terminaaliseen välein (itsehoito) NH2-ryhmään Jeltsch Lab IFN-β:n rakenne Slide 48 of 68 & UH Entsymaattinen poisto, jos M-1:n jälkeen seuraa pieni aa: G, A, S, T, C, P, V Kysteiinit häiritsevät oikeaa disulﬁdisillan muodostumista. https://doi.org/10.1016/j.jns.2006.05.071 Jeltsch Lab INCOMIN kliininen tutkimus Slide 49 of 68 & UH INCOMIN-MS tutkimuksen tulokset (24 kk:n kuluttua): “Huonompi” proteiini menestyy paremmin, ehkä hoito-ohjelman vuoksi Avonex (n=73) Betaferon (n=76) Signiﬁcance level CHO IFNβ-1a 30μg im 1x week E. coli IFNβ-1b 250 μg sc qod (= joka toinen päivä) Relapse-free (0-24 mo) 30 (33%) 46 (48%) 0.036 % change lesion load +11.7% -2.8% 0.0001 Expanded disability status scale 28 (30%) 13 (14%) 0.005 progression (0-24 mo) New T2 lesions (6-12 mo)* 33 (45%) 16 (21%) 0.002 Gd+ lesions (6-12 mo)* 16 (22%) 7 (9%) 0.03 T2 lesion free (0-24 mo)* 19 (26%) 42 (55%) 0.0003 Gd Lesion free (0-24mo)* 18 (25%) 39 (51%) 0.0008 Adverse effects (0-12 mo) 4 (6%) 15 (22%) 0.01 Neutraloivat vasta-aineet eivät vaikuttaneet tuloksiin. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(02)08430-1 Jeltsch Lab Käyttö Suomessa Slide 50 of 68 & UH Jeltsch Lab Käyttö Suomessa (kokonaismyynti 16 Mio. €) Slide 51 of 68 & UH Jeltsch Lab Interferoni gamma (tuotemerkki Actimmune) Slide 52 of 68 & UH Interferoni gamma-1b (tuotemerkki Actimmune) Krooninen granulomatoosi: immuunisolujen kyvyttömyys tuottaa H2O2:ta. Suuri alttius hengenvaarallisille bakteeri- ja sieni-infektioille. Muut muissa maissa hyväksytyt käyttöaiheet (tietyt syövät). Ei saatavilla Suomessa Vetyperoksidi???? Jeltsch Lab Interferoni gamma (tuotemerkki Actimmune) Slide 53 of 68 & UH Hapettavat aineet Antioksidantit Vapaat radikaalit Ihmiskeholla on erittäin tehokkaat mekanismit redox-ympäristön ylläpitämiseksi! Jeltsch Lab Granulosyyttikasvutekijä (G-CSF, CSF3) Slide 54 of 68 & UH Neutroﬁilit ovat yleisimpiä valkosoluja (leukosyyttejä), noin 40-75%. Ne ovat tärkeitä primaarisessa tulehdusreaktiossa. Ne fagosytoivat vaurioitunutta kudosta ja mikrobeja. leukosyytit Modiﬁed from https://commons.wikimedia.org/ wiki/File:Hematopoiesis_(human)_diagram.png Jeltsch Lab Granulosyyttikasvutekijä (G-CSF, CSF3) Slide 55 of 68 & UH 174 (kanoninen muoto: 177*) aminohapon tähdettä, O-glykosyloitu proteiini (Thr163), ~21 kDa 4:n heliksin kimppu. Tuottavat monosyytit, makrofagit, ﬁbroblastit, endoteelisolut ja luuytimen stroomasolut. 2 erilaistumistehtävää: HSC → myeloidinen kantasolu granulosyytti → neutroﬁili Lisää neutroﬁilien aktiivisuutta Jeltsch Lab G-CSF:n primäärinen rakenne (aminohapposekvenssi) Slide 56 of 68 & UH https://www.uniprot.org/uniprotkb?query=(gene:CSF3)%20AND%20(organism_id:9606) Antaa sinulle kaikki ihmisen proteiinit, joita ilmennetään CSF3-geenistä. https://www.uniprot.org/uniprotkb?query=CSF3 Antaa sinulle kaikki CSF3-proteiinit (ja myös monet niihin liittyvät proteiinit, kuten CSF3-reseptorin). Jeltsch Lab Neutropenia Slide 57 of 68 & UH Neutropenia = neutroﬁilien epätavallisen alhainen määrä (< 1,5 miljoonaa/ml). Vähentynyt vastustuskyky bakteeri-infektioita, kuten keuhkokuumetta, poskiontelotulehdusta, korvatulehduksia jne. vastaan. Riippuen neutroﬁilien vähenemisen asteesta oireet voivat olla mitä tahansa lievistä hengenvaarallisiin. Kestosta riippuen se luokitellaan akuutiksi (< 3 kuukautta) tai krooniseksi (> 3 kuukautta). Mahdollisia syitä: ○ Kemoterapia ○ Kloramfenikoli-antibiootin harvinainen haittavaikutus ○ Luuytimeen vaikuttavat sairaudet (esim. säteilysairaus, sädehoito) ○ Leukemia ○ Tietyt virukset (EBV, HBV, inﬂuenssa,...) ○ Aplastinen anemia ○ Harvinaiset perinnölliset sairaudet (Fanconin anemia, Shwachman-Diamondin oireyhtymä) Jeltsch Lab Filgrastim (Neupogen) Slide 58 of 68 & UH Filgrastim (Neupogen) Modiﬁoitu G-CSF 18,8 kDa:n proteiini, jota tuotetaan E. coli-bakteerissa. Ylimääräinen N-terminaalinen metioniini (r-met-hG-CSF), jotta sitä voidaan valmistaa E. coli- bakteereissa. Ei glykosylaatiota → lyhyempi puoliintumisaika, mutta se on toiminnallinen (toisin kuin EPO:ssa, https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Neupogen-and-box.jpg jossa glykosylaatio on välttämätön in-vivo-aktiivisuuden kannalta). Jeltsch Lab Miksi N-terminaalinen metioniini tarvitaan? Slide 59 of 68 & UH Jeltsch Lab Filgrastiimin käyttöaiheet Slide 60 of 68 & UH Syövän kemoterapian aiheuttaman neutropenian ehkäisy ja lyhentäminen Potilaille, joilla on suuri riski pitkittyneeseen ja vaikeaan neutropeniaan luuydinsiirtojen yhteydessä, kun isännän hematopoieettiset solut tapetaan ja korvataan luovuttajan hematopoieettisilla soluilla. Infektioriskin vähentämiseksi neutropeniapotilailla, joilla on aiemmin ollut vakavia ja toistuvia bakteeri-infektioita (esim. pitkälle edennyt HIV-infektio). Ennen verensiirtoa tehtävä hematopoieettisten kantasolujen (HSC) mobilisoiminen luuytimestä verenkiertoon. Farmakokinetiikka: ○ Lääkeaineen maksimipitoisuus seerumissa 5 tunnin kuluttua (keskimääräinen puoliintumisaika 3,5 tuntia). ○ Maksimaalinen absoluuttinen neutroﬁilipitoisuus (ANC) veressä 12 tunnin kuluttua, ANC palautuu normaaliksi noin 24-48 tunnin kuluttua. Jeltsch Lab Lenograstiimi (Granocyte) Slide 61 of 68 & UH Lenograstiimi (Granocyte) rhG-CSF 18.8 kDa proteiini, tuotettu CHO soluissa (→O-glykosyloitu) Glykosylaatiota ei tarvita aktiivisuuden kannalta, mutta se parantaa pH- ja lämpöstabiilisuutta sekä proteaasiresistenssiä. In-vitro hieman parempi kuin ﬁlgrastiimi, in-vivo ei havaittavaa eroa. Jeltsch Lab Pegﬁlgrastiimi (Neulasta) Slide 62 of 68 & UH Pegﬁlgrastiimi (Neulasta) rhG-CSF, joka on muunneltu metoksi- PEG-propionaldehydillä (kiinnitetty N-terminaaliseen aminoryhmään). ~39 kDa:n proteiini, jota tuotetaan transformoidussa E. coli-bakteerissa Pidempi puoliintumisaika (suuremman koon vuoksi munuaispuhdistuma pienenee) → viikoittainen annostelu. Syöpäpotilaat, jotka saavat solunsalpaajahoitoa (pois lukien verisolusyövät, jotka reagoivat G-CSF: ään lisääntymällä ) Jeltsch Lab Lipegﬁlgrastiimi (Lonquex) Slide 63 of 68 & UH Lipegﬁlgrastiimi EMA:n 2013 hyväksymä "glyko-" pegyloitu r-met-hG-CSF (Thr134) 39 kDa, tuotettu E. coli-bakteerissa Yhtä tehokas kuin pegﬁlgrastiimi t½ ~30 h, pidentynyt puoliintu- misaika -> viikoittainen annostelu Sama käyttöaihe kuin pegﬁlgrastiimilla: Syöpäpotilaat, jotka saavat kemoterapiaa (lukuun ottamatta verisolusyöpiä, jotka reagoivat G-CSF:ään) Jeltsch Lab (Li)pegﬁlgrastiimin rakenne Slide 64 of 68 & UH Jeltsch Lab Filgrastiimin 3 sukupolvea Slide 65 of 68 & UH Jeltsch Lab 12 kalleimman lääkkeen osuus kaikista korvauksista on 25 prosenttia Slide 66 of 68 & UH Jeltsch Lab Käsitteet Slide 67 of 68 & UH Käsitteet Glykosylaatio-tekniikka (glycoengineering) Hiilihydraattiketjut ovat usein tärkeitä proteiinilääkkeen puoliintumisajan ja stabiilisuuden kannalta. Nisäkässoluja käytetään tuottamaan proteiineja, joissa on endogeenisia hiilihydraattiketjuja. Proteiinia koodaava sekvenssi (DNA) voidaan muuttaa siten, että se sisältää ylimääräisiä hiilihydraattiketjuja (esim. darbepoetiini). PEGylointi Kemiallisia modiﬁkaatioita voidaan käyttää myös proteiinin puoliintumisajan pidentämiseen, esim. PEGylointi (esimerkki: PEG-Interferon beta 1a). Aminohapposekvenssin muuntelu Proteiinilääkkeen aminohapposekvenssiä muutetaan joskus (verrattuna ihmisen villityyppiseen sekvenssiin). Tämä on tarpeen esimerkiksi ylimääräisten glykosylaatiokohtien lisäämiseksi (darbepoetiini) tai proteiinin tuottamiseksi bakteereissa, esimerkiksi E. coli-bakteerissa (koska proteiinin ensimmäinen aminohappo on aina oltava metioniini). E. coli ja CHO solut Nisäkässolut (useimmiten CHO-solut) ovat proteiinilääkkeiden ilmentämisen standardi. Bakteereja (useimmiten E. coli) voidaan kuitenkin käyttää, jos syntyvä proteiini on biologisesti aktiivinen. E. coli on paljon helpompi ja halvempi kasvattaa kuin nisäkässolut. Jeltsch Lab Valinnainen video katsottavaksi Slide 68 of 68 & UH Valinnainen Youtube video katsottavaksi luento #4 jälkeen The big IF Koko video: https://www.youtube.com/watch?v=wgKOl-mM4dU Suomessa tehty tutkimus (alkaen 16 min 40 sek): https://www.youtube.com/watch?v=wgKOl-mM4dU&t=16m40s Jeltsch Lab Tehtävät Slide 69 of 68 & UH Lue lehden artikkeli "Borderline Analysis" (Lab Times 6.10.2016 ) ja tieteellinen katsaus "Erythropoietin as a performance-enhancing drug" (Salamin ym. 2018) ja vastaa seuraaviin kysymyksiin: 1. Mitä muutoksia alkuperäiseen epoetiini alfaan on tehty, jotta on saatu kakkossukupolven erytropoieesia stimuloivia aineita (ESA) ja kolmossukupolven ESA-lääkkeitä? Miten nämä vaikuttavat potilaisiin ja urheilijoihin jotka tarvitsevat/haluavat käyttää niitä? 2. Onko nykyään helpompaa vai vaikeampaa jäädä kiinni EPO-dopingista? Selittäkää vastauksenne ottaen huomioon EPO-lääkkeiden kehitys viime vuosikymmeninä. 3. Mitä muita dopingmenetelmiä voitte kuvitella, jotka myös perustuisivat veren tehostettuun kykyyn kuljettaa happea? Miten ne toimisivat? 4. Joissakin urheilulajeissa urheilijat, joilla on liikaa punasoluja (mitattuna korkeana hemoglobiinina), ovat olleet suljettu pois kilpailuista, koska on oletettu, että he ovat käyttäneet ESA-valmisteita. Onko tämä tieteellisesti perusteltua? Selitä! Jeltsch Lab Jos sinulla on kysyttävää, ota yhteyttä Slide 70 of 68 & UH Labra: mjlab.ﬁ (https://www.helsinki.ﬁ/en/researchgroups/lymphangiogenesis-research-and-antibody-development) Biolääketieteellisten proteiinien tuotannon ja puhdistuksen core facility: b3p.it.helsinki.ﬁ jeltsch.org (private rumblings) jeltsch.org/science (private rumblings ilman ei-tieteellisiä juttuja) Kysymykset: [email protected], perjantaina 9-12 IRL (huone 4051) Tämä esitelmä: https://mjlab.ﬁ/FARM-310-4-FIN

FARM-310 2024 EPO, IFNs, & G-CSF - PDF

Document Details

Tags

Related

Summary

Full Transcript

Upgrade to continue