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PARÁMETROS ¿De qué Definición Modificación depende? MAGNIFICA- De la construcción Es cuantas veces más grande A través de la selección de un objetivo CIÓN propia del es la imagen generada con con más o...

PARÁMETROS ¿De qué Definición Modificación depende? MAGNIFICA- De la construcción Es cuantas veces más grande A través de la selección de un objetivo CIÓN propia del es la imagen generada con con más o menos magnificación. microscopio. respecto al objeto ubicado Se calcula como la magnificación del Depende de la lente en la platina. Esta grabada objetivo x magnificación ocular. objetivo y del ocular en la lente objetivo CONTRASTE De la construcción Es la diferencia de intensidad A través del voltímetro (perilla que se propia del lumínica entre un punto de mueve para modificar la intensidad de microscopio. una imagen y su fondo luz) Depende del cono de A través del diafragma de condensación iluminación (para modificar el cono de iluminación). @Chemiistrygram Al cerrar el diafragma. ↓ cono de iluminación y ↑ contraste. Cerrar mucho el diafragma disminuye la resolución (porque disminuye la AN). Es mejor usar el voltímetro RESOLUCIÓN Fundamentalmente Es la capacidad de distinguir Limite Resolución = λ. 0,61 / AN de como el individuo entre dos objetos ubicados AN = n. sen θ ajuste el microscopio uno muy cerca del otro (esta para la observación. distancia se llama límite de La apertura numérica es la medida de Depende de la resolución). capacidad del objetivo de captar la luz. apertura numérica Se relaciona con el criterio Poder resolutivo: inversa de LR. que tenga el objetivo de Rayleigh que anuncia que ↑AN, ↑captación de rayos. ↑ poder el ojo humano puede resolutivo (o resolución). distinguir dos puntos cuando El índice de refracción es un número el máximo de uno coincide resultante del cociente de la velocidad de con el mínimo del otro la luz en el vacío y en el medio. Cuando la luz pasa por un medio con determinado n, cambia su velocidad y se curva.  TIPO DE MICROSCOPIO DEFINICIÓN S Se coloca un anillo de campo oscuro debajo del I condensador → se deja pasar la luz de los bordes → los N Campo oscuro haces de luz interaccionan con la muestra → cambian su dirección → entran al objetivo. M Los haces que no interaccionan con la muestra, no A entran al objetivo R Se coloca un diafragma anular → los haces interaccionan C con la muestra (que tiene diferente índice de refracción) A Contraste de fases → cambia la velocidad de la onda y se desfasa C Los haces que no interaccionan con la muestra, no se I desfasan @Chemiistrygram Ó Se coloca un polarizador → los haces interaccionan con la N muestra → se genera una interferencia de haces de luz Contraste de especimen polarizada próximos. Sirve para la visualización de células vivas. Fluorescencia Fenómeno de emisión molecular en el cual se irradia una molécula con una longitud de onda determinada, los electrones se excitan y luego se desexcitan, emitiendo luz de mayor longitud de onda (menor energía) y se pueden ver en el MO por debajo del límite de resolución (200 nm), pero no se pueden resolver. Es un método de contraste ideal ya que se observa un fondo oscuro y la molécula fluorescente emite luz. Fluorocromo con selectividad El propio Fluorocromo tiene selectividad con la molécula de la célula. Por ejemplo, Hoechst interactúa con mucha afinidad con el ADN y permite marcar núcleos en azul. Fluorocromo unido a moleculas El Fluorocromo se une a una molécula que le da selectividad. Por ejemplo, Faloidina-FITC. El Fluorocromo verde (FITC) se conjuga y se lo une a la toxina Faloidina la cual se une al citoesqueleto de actina que polimeriza. Fluorocromo unido a sonda El Fluorocromo se une a una sonda de hibridación de ARN o ADN y se obtiene una secuencia determinada de nucleótidos → se pegan específicamente a una secuencia donde tiene complementariedad de bases → los cromosomas se tiñen de diferentes colores Fluorocromo unido a anticuerpos Se genera anticuerpos y a estos se les une un Fluorocromo. Se coloca un anticuerpo primario → reconoce al antígeno que se quiere revelar → se une un anticuerpo secundario que tiene el Fluorocromo. Para amplificar la señal, se @Chemiistrygram unen 4 anticuerpos secundarios al primario. Para poder hacerse una inmunofluorescencia, las células al fijarse pierden viabilidad. Además, se debe permeabilizar la membrana para que pueda ingresar el fluorocromo o anticuerpo.  Útil para seguir la movilización de una Proteína fluorescente verde con 11 proteína láminas beta y un centro cromóforo Está codificada por un gen que se puede clonar e introducir en células. Para esto Se genera un plásmido con el gen de la proteína de interés y al lado, el gen de la GFP @Chemiistrygram Se coloca el plásmido a la célula Luego se empieza a expresar la proteína de interés con la GFP en su estructura primaria (proteína quimérica) El fluorocromo se excita con luz azul (ya que tiene menor λ y mayor energía) mediante una lámpara de mercurio y se desexcita emitiendo luz verde Un microscopio de luz trasmitida NO se puede Se utiliza la EPIILUMINACIÓN utilizar para microscopía de fluorescencia La luz viene de abajo, pasa por la La luz de excitación no llega al ocular → se ve un muestra y llega al ojo → se ve un fondo fondo negro y aumenta el contraste azul y el contraste es malo Se excita filamento de mercurio → genera un arco voltaico → se desexcita emitiendo luz de todas las λ → filtro de excitación deja pasar la luz azul → espejo dicroico a 45° → la luz rebota → pasa por el objetivo → llega a la muestra → excita al fluorocromo → emite luz verde → pasa por el objetivo → atraviesa el espejo dicroico (para la λ verde no se comporta como espejo) → filtro de emisión → ocular → detector @Chemiistrygram Ya que se puede generar imágenes con fluorescencia fuera de foco (fluorocromos excitados que no son parte de la célula u organela de interés) ANALÓGICO DIGITAL CONFOCAL MULTIFOTÓNICO CONVOLUCIÓN DECONVOLUCIÓN Se excita con un Se excita con dos láser en un punto láseres de mitad focal de interés, de energía que sin embargo, se cuando se excita toda la encuentran en un muestra ya que el punto único, láser pasa por excitando un toda la muestra. punto específico MAS ENERGÍA de la célula. TIENE TIENE UNA ONDA MEJOR ELECTROMAGN. RESOLUCIÓN QUE MENOS PENETRA. EL CONFOCAL. Permite un nuevo tipo de microscopía: INTRA VITAL, que tiene una apertura numérica alta y una distancia de trabajo larga. TÉCNICA FUNCIÓN FUNDAMENTO FRET Evaluar por microscopía la interacción de Se tiene dos fluorocromos (uno es donador y el moléculas otro aceptor) → el donador se excita a una λ determinada → la emisión del fluorocromo es la energía de excitación del segundo (si están a una distancia menor a 5nm.) → se produce luz de la λ de emisión del segundo fluorocromo Ver cambios de conformación dentro de @Chemiistrygram una misma proteína. FRAP Evaluar los parámetros cinéticos de una Se hace un fotoblanqueo a una zona → se proteína (velocidad de difusión, velocidad de destruye el centro cromogénico del transporte, etc.). fluorocromo → deja de emitir fluorescencia Por lo tanto, se observa la zona (que queda oscura) y se analiza cuanto tiempo tarda en recuperar fluorescencia. Esta fluorescencia se da por otras proteínas fluorescentes que se incorporan en la zona.