Les marqueurs et tests de sénescence PDF

Tests et marqueurs de sénescence Matthew Borok 3.10.23 Choses apprises d’Elizabeth Blackburn Longueur minimum des télomères pour éviter des fusions: 3800 bp Longueur des télomères est un très bon marqueur de mortalité En combinaisons avec d’autres critères, comme dép...

Tests et marqueurs de sénescence Matthew Borok 3.10.23 Choses apprises d’Elizabeth Blackburn Longueur minimum des télomères pour éviter des fusions: 3800 bp Longueur des télomères est un très bon marqueur de mortalité En combinaisons avec d’autres critères, comme dépression, améliore pouvoir de prédiction Comment trouver les cellules sénescentes? Regarder la longueur des télomères Immunofluorescence des marqueurs SA-ßgal Transcriptomique Les télomères Les télomères sont répétitions en tandem (TTAGGG) aux bouts des chromosomes, pour protéger les gènes Une partie est perdue avec chaque division de cellule T.A. Sciences Comment mesurer la longueur des télomères? Telomere restriction fragmentation qPCR Q-FISH Montpetit et al. 2015 Telomere restriction fragmentation Essentiellement un Southern blot Digestion de l’ADN avec enzymes qui ne coupent pas les séquences télomériques Electrophorèse Sonde télomérique Révélation Désavantage : Beaucoup de cellules nécessaires Ruella et al. 2009 qPCR Lapham et al. 2015 Q-FISH-metaphase spread Utilisation d’une sonde complémentaire aux répétitions télomériques, conjuguée a un fluorophore Avec étalage des chromosomes, possible de voir quels chromosomes manquent les télomères QFISH sur tissu QFISH avec une sonde fluorescente se liant avec les répétitions télomériques Imagerie confocal du signal fluorescent Plus d’intensité=télomères plus grands Flores et al. 2008 FLOW-FISH Fluorophore-labeled peptide nucleic acid (PNA) sonde se liant avec les télomères Approuvé par le FDA Utilisation de FACS (fluorescence-activated cell sorting) pour mesurer la taille des télomères dans cellules individuelles FACS: technique pour analyser et isoler des cellules marquées avec un fluorophore Abcam Sénescence replicative Après environ 50 divisions, le cycle cellulaire s’arrête Les cellules ne divisent plus et expriment p16, un inhibiteur du cycle et marqueur de sénescence Bai et al. 2017 Marqueurs de sénescence et techniques de détection-P16 DNA P16 Détectable par immunofluorescence Ryu 2017 Ressler et al. 2006  Marqueurs de sénescence et techniques de détection- phospho-H2AX phospho-H2A.X Ryu 2017 Ressler et al. 2006 Marqueurs de sénescence et techniques de détection: perte de lamine B1 Protéine de la membrane du noyau Impliqué dans la répression de l’hétérochromatine par séquestration à la périphérie du noyau DNA LMNB1 INM: inner nuclear membrane LAD: lamin-associated domain LB1: lamin B1 LBR: lamin binding region Lukasova et al. 2018 Proteintech  Marqueurs de sénescence et techniques de détection: perte de lamine B1 LB1/LMNB1: lamin B1 LB2/LMNB2: lamin B2 LA/C: lamin A/C LMNA: lamin A Actin: loading control SAHF: senescence- associated heterochromatin foci BrdU: bromo-deoxyuridine, labellise les cellules proliférants PD: passage day (combien de jours en culture) WI-38 cells: fibroblastes humaines de poumon fetale Shimi et al. 2011 Marqueurs de sénescence et techniques de détection: perte de lamine B1 Sc: scrambled short Réduction de Lamine B1 induit hairpin RNA, controle des marqueurs de senescence LB1sh: short hairpin RNA contre Lamine B1 pour réduire son expression SAHF: senescence- associated heterochromatin foci BrdU: bromo- deoxyuridine, labellise les cellules proliférantes Shimi et al. 2011 Marqueurs de sénescence et techniques de détection: expression de transposons 5 mo: 5 mois Dérépression des L1, MusD, B1, B2: transposons transposons dans les CR: caloric restriction, souris âgées réduction de nourriture, déjà montré de ralentir le vieillissement De Cecco et al. 2013 Les protéines et les lysosomes Dans les cellules âgées, les protéines peuvent former des gros agrégats Les cellules sénescentes contiennent plus de lysosomes que les cellules normales, avec une activité de β-galactosidase à pH6 Cellule normale Cellule sénescente lysosome Le marquage SA-βgal lysosome Blanco et al. 2018, Kamino et al. 2004 Le marquage SA-βgal lysosome Blanco et al. 2018, Kamino et al. 2004 SPIDER-βgal Marqueur fluorescent pour activité βgal Permet évaluation et tri de cellules sénescentes par FACS culture ARN Abcam Cellules sénescentes marquées Cellules normales avec SPIDER-βgal Doura et al. 2016 Résumé de marqueurs Positifs SA-Bgal P16 P21 Phospho-H2AX Négatifs Télomères longs Lamine B1 ARN-seq a niveau cellule unique Regarder l’expression de milliers de gènes dans chaque cellule d’un tissu Représentation de toutes les populations cellulaires Très facile d’explorer les données de Tabula muris, Tabula sapiens et Tabula muris senis (TP) Bawa et al. 2022 Tabula muris Souris: 4 males, 3 femelles 20 organes Tabula Muris Consortium 2018 Tabula muris Tabula Muris Consortium 2018 Approches transcriptomiques Lamb1 (3 mois) Lamb1 (24 mois) Tabula muris senis Muscle Take-home messages Plusieurs marqueurs existent pour identifier les cellules sénescentes Présent/élevé: P21, P16, SA-βgal, phospho-H2AX Absent/réduit: Télomères, Lamine B1 Techniques pour identifier les cellules spécifiques Immunofluorescence pour marqueurs protéiques FLOW-FISH (mesure de la longueur des télomères) SPIDER-βgal Séquençage ARN a niveau cellule unique (Tabula muris senis) Préparer pour le TD Lire le papier et répondre aux questions Amusez-vous: https://tabula-muris-senis.ds.czbiohub.org/