T34.-Células Madre y Diferenciación Celular - 1º Grado Medicina PDF

T34.-Celulas-Madre-y-Diferenciac... McSteamyURJC Biología Celular y Citología Humana 1º Grado en Medicina Facultad de Ciencias de la Salud. Campus de Alcorcón Universidad Rey Juan Carlos Reservados todos los derecho...

T34.-Celulas-Madre-y-Diferenciac... McSteamyURJC Biología Celular y Citología Humana 1º Grado en Medicina Facultad de Ciencias de la Salud. Campus de Alcorcón Universidad Rey Juan Carlos Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  159 Bloque II. Biología Celular Mc Steamy URJC – 1º Medicina T34. CÉLULAS MADRE Y DIFERENCIACIÓN CELULAR INTRODUCCIÓN CÉLULA MADRE (steem cell): son células de alta capacidad proliferativa y capaces de dividirse a otra igual o más diferenciada que ella. La actividad está inducida por unión a ligandos autocrinos, paracrinos o endocrinos que se asocian a receptores para controlar la actividad enzimática y estimular la transcripción y traducción proteica. Factores externos estimulan la división, muy importantes. Estas células están presentes en todos los tejidos y órganos. Tenemos células madre en el corazón, pero eso no significa que siempre se están dividiendo (llega un momento en el que no responde a los estímulos). ** Una célula, cuanto más diferenciada está, menos se divide, aunque no siempre pasa. TERAPIA CELULAR La medicina personalizada es un conjunto de técnicas que sirven para tratar específicamente a un paciente concreto, usando terapia celular, ingeniería de tejidos…. - TERAPIA CELULAR: se basa en usar célula como medicamento, las células pueden o no estar modificadas. Por lo que se definice como el procedimiento médico en el que las células son el producto medicinal. - INGENIERÍA DE TEJIDOS: se basa en la reconstrucción total o parcial de tejidos/órganos con células, modificadas o no, sobre sustancia extracelular o sustratos sintéticos o naturales. MEDICINA REGENERATIVA = TERAPIA CELULAR + TERAPIA GÉNICA + INGENIERÍA DE TEJIDOS. Que NO es lo mismo que la medicina personalizada, donde aplicamos procedimientos específicos a una persona en concreto. Por ejemplo, una persona tiene un patrón de proteínas y se crea un tratamiento específico para el tumor de esa persona. ** Los tres tipos de terapia están relacionados, pero no van necesariamente juntos. TIPOS DE CÉLULAS MADRE En las divisiones hay una jerarquía. Las células madre pueden dar lugar a otra célula igual que ella o una un poco más diferenciada, pero no totalmente diferenciada. Esta, a medida que se va dividiendo, va restringiendo su potencialidad. Al final, la célula solo se podrá dividir en la diferenciada. Existen distintos tipos en función de su potencialidad para dividirse: CÉLULAS TOTIPOTENTES: embrionarias hasta mórula (4-8c células). CAPAZ DE DAR TODOS LOS TIPOS CELULARES QUE EXISTEN. CÉLULAS PLURIPOTENTES: PUEDEN DAR LUGAR A TODO EL INDIVIDUO, PERO NO A LA PLACENTA. IMP DIFERENCIA CON ANTERIOR. - Embrionarias (ES) - Epiblásticas (EpiSC) - Germinales embrionarias (PGC) - Germinales (GSC) - De carcinoma embrionario (EC) - Inducidas (iPS) - Clonadas por transferencia nuclear (NT-ES) CÉLULAS MULTIPOTENTES (ADULTAS): solo pueden formar células del órgano donde se encuentran. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10458856 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  160 Bloque II. Biología Celular Mc Steamy URJC – 1º Medicina 1. CÉLULAS MADRE TOTIPOTENTES Se pueden diferenciar en cualquier tipo celular del organismo. Son las células embrionarias hasta el estado de mórula (8 células), recordemos que en blastocisto ya tenemos dos tipos de células. Pueden dar todos los tejidos embrionarios y extraembrionarios. El blastocisto no está incluido (es hasta blastocisto no incluido este). 2. CÉLULAS MADRE PLURIPOTENTES Recordemos que a diferencia con células madre totipotentes es que las pluripotentes NO pueden dar lugar a la placenta, pero si al resto de tejidos extraembrionarios. ¿Cómo sabemos si las células extraídas son pluripotentes? (llamamos células problema a las que queremos ver si son plutipotentes) Para saber esto se pueden hacer dos cosas: 1. Cogemos células y hacemos una quimera: inyectamos células madre problema en masa celular interna del blastocisto y si las células inyectadas colonizan todo el nuevo individuo es porque eran células madre pluripotentes, si no lo hacen no lo eran. Experimento STAM. 2. Implantamos células madre problema bajo la piel de animal de investigación, en ratones desnudos (sin sistema inmune para evitar el rechazo). Se forma un primordio y células se dividen dando lugar a todo tipo de células, formando un tumor conocido como teratocarcinoma, por lo que las células madre eran pluripotentes. ** DATO IMPORTANTE: cuando hablamos de TERATOCARCINOMA es porque es un conjunto celular con capacidad de división (no completamente diferenciado) y cuando hablamos de TERATOMA es porque ya es un conjunto celular sin capacidad de división (no hay células madre, pierde capacidad de división y por ello de invasión). El TERATOCARCINOMA consta de un TERATOMA (derivado de células germinales primordiales que puede ser benigno o maligno) y un CARCINOMA EMBRIONARIO (con las 3 capas germinales, son células madre malignas indiferenciadas que provienen de células madre pluripotentes y con elevada capacidad de metástasis). HAY VARIOS TIPOS DE CÉLULAS PLURIPOTENTES Ø Células madre embrionarias (ECS): solo pueden generar tejidos embrionarios, son sacadas de la masa interna del BLASTOCISTO. Dan lugar a todos los tipos celulares MENOS PLACENTA (pueden dar lugar a cualquier órgano). Ø Células Epiblásticas (EpiSC): aisladas de células embrionarias, de las crestas genitales. Derivadas de la masa interna (EPIBLASTO) en el momento de la implantación. No van a dar placenta. Ø Germinales embrionarias (PGS): aisladas del epiblasto de un embrión. Sacadas de las crestas genitales, órganos dentro del embrión que en el futuro darán al testículo o al ovario. Ø Germinales (GSC): aisladas de primordios germinales (de progenitores de las gonias y espermatogonias: ovocitos y espermatozoides). Son las células más indiferenciadas dentro de los testículos y los ovarios. Ø De carcinoma embrionario (EC): son aisladas de células de embriones que darán lugar a espermatogonias. Cogemos células del embrión y las ponemos en sitio ectópico (fuera de donde está normalmente) si las células se diferencian a todos los tipos de tejidos originan un teratoma, pero si las células no paran de dividirse porque no están del todo diferenciadas (sigue habiendo restos de células embrionarias con capacidad de división) se conoce como teratocarcinoma. Cuando la masa tumoral derivada del embrión tiene células que siguen dividiéndose sin control se conocen como células de carcinoma embrionario. ** En las analíticas hay marcadores tumorales, si hay alguna de estas células tumorales en nuestro organismo, hacen que en sangre haya anticuerpos contra antígenos de las células tumorales, que se pueden detectar con los marcadores tumorales. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10458856 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  161 Bloque II. Biología Celular Mc Steamy URJC – 1º Medicina Ø Inducidas (iPS): aisladas de células cancerosas que pueden dar lugar a tumores epiteliales. Se coge una célula adulta, se activan factores de trascripción de células embrionarias y las células adultas se desdiferencian y empiezan a comportarse como células embrionarias. Ø Clonadas por transferencia nuclear (NT-ES): célula adulta a la que se le han añadido factores de trascripción. Es un ovocito sin núcleo al que se le ha añadido (micromanipulación, como cuando se hace la microinyección de esperma) el núcleo de una célula somática, produciendo la indiferenciación de la célula. Se desarrolla un embrión que es genéticamente idéntico al señor que lo ha donado. MUCHA CAPACIDAD PLURIPOTENTE. CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS (ESC) Son aisladas de la masa celular interna del blastocisto. Se cultivan habitualmente con una monocapa de células nutricias (concretamente con células de riñón de mono). Teóricamente capaces de diferenciarse a cualquier tejido: durante mucho tiempo se pensó que serían la base de la ingeniería genética. Hay debate con esto porque realmente cuando sacas células madre embrionarias están destruyendo al embrión, por lo que en muchos sitios se prohibió y en otros no, hoy en día (aunque por ejemplo en España se puede hacer) no se utilizan en la práctica. El problema por el cual no se usa esta técnica está en que pese a usar una monocapa nutricia para el cultivo de estas células (como hizo Thomson) no somos capaces de crear el medio de cultivo para que las células sobrevivan. La monocapa libera sustancias, algunas de las cuales se pueden integrar en la membrana de las células (como el ácido siálico), que pasan a expresar una serie de antígenos en la superficie, por lo que cuando después usamos estas células para ponérselas a un individuo daría rechazo. Además, aunque esto no pasase, estaríamos poniendo células de un embrión en otro organismo, por lo que el receptor tendría que tomar medicación anti-rechazo de por vida. OTRO PROBLEMA: al implantarlas, daban todo tipo de tejidos, con su capacidad pluripotente conservada. El problema está en que como no sabemos cómo controlar las indiferenciadas, lo difícil es hacer que las células se diferencien en lo que queremos y además podrían dividirse incontroladamente y dar lugar a un tumor. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10458856 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  162 Bloque II. Biología Celular Mc Steamy URJC – 1º Medicina Dentro de las células madre embrionarias, sacadas de la masa celular interna existen 2 subtipos de ESC (y de iPS): “Sabemos que existen estos dos subtipos porque cada una responde a distintos factores de estimulación” 1. NAIVE (primitivas, semejantes a MCI): son las más pluripotentes e indiferenciadas de todas. - Los dos cromosomas XX están desmetilados, ya que a más metilación más tendencia a la diferenciación. XIST tiene su máxima expresión cuando están desmetilados y cuando uno de ellos se metila, la expresión del gen XIST. NO SE HAN CONSEGUIDO HACER NAIVE HUMANAS: es difícil hacerlo, porque rápidamente se pasan a Primed. 2. PRIMED (estimuladas, semejantes a epiblasto): un poco menos indiferenciadas, se parecen, pero sin llegar a ser las epiblásticas. - Un cromosoma X está metilado y otro desmetilado, por lo que están un poco menos indiferenciadas, ya que a más metilado más diferenciación. Las dos provienen de la masa celular interna del blastocisto y son PLURIPOTENTES. Ambos reaccionan diferente ante ciertos factores que las mantienen indiferenciadas, como pueden ser WNT, FGF, Insulina… que cuando se unen a sus Rc activan cadenas que acaban regulando en el núcleo la expresión génica. Por ejemplo factores que modifican la expresión a nivel nuclear son: STAT, JNK… Estos factores permiten que se mantenga en el estado indiferenciado, y ante estos factores, todas las células a pesar de ser pluripotentes no responden igual, todo depende del factor. ** Cuando no podemos mantener células indiferenciadas en el laboratorio estamos perdiendo la capacidad divisoria y por lo tanto el poder usarlas para lo que querríamos. ¿Qué pasa cuando inhibimos factores en Naive y Primed? - INHIBIMOS FACTORES EN NAIVE: factores que se encargan de mantener indiferenciada pesan más à Mantiene indiferenciada. - INHIBIMOS FACTORES EN PRIMED: factores que se encargan de mantenerla indiferenciada pesan menos y tienen a diferenciarse (siguen siendo pluripotentes, pero se diferencian un poco hacia otra célula, dividiéndose menos). En función de su respuesta a ciertos estímulos, hacen que se mantengan especialmente indiferenciadas, las PRIMED están un poco más diferenciadas (muy poco). Importante saber que los ligandos que estimulan a las NAIVE no estimulan PRIMED y viceversa. Cuando quitamos represores eipigenéticos se agudiza todo, mientras que cuando la célula está un poco más diferenciada pesan más factores que la llevan a diferenciación y si quitamos factores epigenéticos todo se expresa mucho más. Al metilar una PRIMED no estimulada se diferencia todavía más. El efecto de la metilación sobre NAIVE y sobre PRIMED es diferente. Cuanto más metilado más tendencia a diferenciarse y viceversa. ** Las PRIMED están un poco más metiladas que las NAIVE. “Cuanto más desmetilada, más NAIVE”. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10458856 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  163 Bloque II. Biología Celular Mc Steamy URJC – 1º Medicina ESC y iPS no son equivalentes en todas las especies MURINAS: son semejantes a las primitivas (NAIVE) y semejantes a MCI (masa celular tierna), las más indiferenciadas. HUMANAS: son semejantes a estimuladas (PRIMED), intermedias entre células de la MCI y epiblásticas, son menos indiferenciadas (expresan algunos factores naive como NANOG, está activo cuando la célula madre está indiferenciada). - OCT4 (f. de transcripción de células indiferenciadas) promueven diferenciación à Desmetilación tiene que ser absoluta. - Aislando las células embrionarias de humano y de ratón, las de ratón son más NAIVE y las humanas más PRIMED. Las epiblásticas no expresan NANOG, las PRIMED sí, siguen siendo indiferenciadas - pluripotentes. Criterios que deberían cumplir NAIVE humanas, para ser consideradas así: Theunissen, 2016, cell stem cell - Hay que asegurarse de que ha habido desmetilación absoluta, ya que debemos tener patrón epigenético que tiene blastocisto en estado normal. - Debemos asegurarnos de que la inactivación del cromosoma X debe ser igual a la de un embrión. - Transposones deben ser los justos, porque si hay muchos saltos puede haber mutaciones y dar tumores. - Contribución a quimeras: si ponemos células en blastocisto acabarían dando lugar a un embrión Está mal en la foto la X roja, debería ser un tic verde también. ¿ACTIVACIÓN CROMOSOMAS X? - CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS: 2 cromosomas X activos à AL IGUAL QUE NAIVED - EPIBLÁSTICAS: 1 cromosoma X activo y 1 cromosoma X inactivo à AL IGUAL QUE PRIMED ALGUNAS PROTEÍNAS/FACTORES IMPORTANTES: BMP (proteina morfogénetica de hueso), Catenina (regulada por Wnt), PKC, LIF (factor inhibidor de la leucemia, estimula f. de transcripción que promueven la indiferenciación). En humanas no hace nada LIF. ¿QUÉ OCURRE SI ELIMINAMOS LA ENZIMA QUE METILA EL DNA? Eliminando DNA metiltransferasa, las NAIVE siguen siendo NAIVE (aún más desdiferenciadas). En las PRIMED si quitamos la DNA metiltransfersa, pesan más los factores que hacen que la célula se diferencie. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10458856 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  164 Bloque II. Biología Celular Mc Steamy URJC – 1º Medicina EPS à EXTENDED PLURIPOTENT STEM CELLS O CÉLULA PLURIPOTENTE EXTENDIDA Es un caso in vitro en ratón donde al alterar condiciones de cultivo se consiguió que células pluripotentes de embriones, CÉLULAS NAIVE (pluripotentes) de ratón guarden estado totipotente, se considera que revirtieron su estado y se denominan células pluripotentes extendidas. Las células colonizaron tanto al embrión como a la placenta, por lo que son células con carácter totipotente. RESUMIDO FÁCIL: las EPS son células madre pluripotentes humanas que se DESDIFERENCIAN y recuperan carácter totipotente. Yang et al, 2017 QUIMERA: se han hecho quimeras humano-ratón. Esas células utilizadas eran totipotentes. PROBLEMAS ÉTICOS Y EN LA TÉCNICA CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS - No conocemos los factores necesarios para mantenerlas indiferenciadas en cultivo: además tampoco sabemos cómo hacer para después diferenciarlas a lo que queremos (no sabemos diferenciar a cada tipo celulares) (naive vs. primed). - Medio de cultivo es indefinido ya que no se conocen los factores necesarios para mantener células indiferenciadas: debido a esto se produce rechazo, porque las células madre captan moléculas de la monocapa nutricia (en su superficie pueden adoptar proteínas de origen externo), lo que supone un problema si dichas moléculas son integradas en la célula, pueden causar rechazo. - Acumulación de anomalías génicas y cromosómicas por el mantenimiento in vitro: no hay garantías de que no se transformen en células tumorales que formen un cáncer en el paciente (división fuera de control). - No sabemos diferenciarlas homogéneamente: aunque sí sabemos diferenciar las células de la masa celular interna (aisladas de embriones), aún sabiendo que producen rechazo inmune, solo es si son generadas a partir de embriones clonados. Las primeras ESC clónicas humanas las consiguió formar Tachibana et al (2013, cell). - Problemas éticos: existen pocos países que trabajen con células madre embrionarias, pues supone matar al embrión. ENSAYOS CLÍNICOS ** Los individuos genéticamente idénticos son los gemelos univitelinos. Primeras ESC clónicas humanas: Tachibana, 2013 ** El embrión en realidad tras estimulación partenogenética no fue clónico. En humanos está prohibido llegar más allá de etapa de blastocisto, pero en animales si como Dolly. Los orígenes de la clonación terapéutica a partir de células madre fueron: - John Gourdon; creó primer animal clónico, una rana sudafricana: Xenopus laevis. Cogió el núcleo de una célula de la piel (célula adulta), se metió en un ovocito sin núcleo. La rana de John Gourdon: primer animal clónico. Recibe premio Nobel por ello. - La oveja Dolly: se hizo famosa porque fue el salto a los mamíferos. Se conoce más este caso por el revuelo que causó en la prensa y no les dieron premio Nobel. - El perro Snoopy (Seul National University): primer perro clonado. - Perro Lancey: primer animal comercial clonado. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10458856 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  165 Bloque II. Biología Celular Mc Steamy URJC – 1º Medicina PROBLEMA CON CLÓNICOS HUMANOS: conseguirlo, dejando atrás los problemas éticos, es muy difícil porque para conseguirlo hacen falta muchísimos embriones (decenas de estos como mínimo), imaginemos que lo conseguimos con 30 embriones, pues cuando una persona necesitase algún tipo de tejido necesitaríamos que una mujer donase 30 embriones, algo que es bastante complicado, es por eso que si se ha conseguido en animales (donde es más fácil conseguir una mayor cantidad de embriones). Ø CLONACIÓN TERAPÉUTICA (permitida en algunos países): el ovocito (al que le hemos quitado el núcleo) de una donante se fusiona con el núcleo de una célula somática de la persona enferma (por ejemplo, un fibroblasto). Se crea el blastocisto y se extraen células de la masa celular interna à se diferencian estas células según el interés por medio de distintos tipos de estimulación. Ø CLONACIÓN REPRODUCTIVA: prohibida en todo el mundo. ** Las células adultas en condiciones estresantes pasan a ser totipotentes à DESDIFERENCIACIÓN 1. Geron: médula espinal seccionada. Aprobación en 2010, cancelado en 2013 Pretendió implantar células madre prediferenciadas a neuronas y ponerlas en pacientes que tuvieran la médula seccionada por un accidente previo, buscando que estas células madre se diferenciaran a neuronas. Fueron los primeros en usar células madre embrionarios para corregir problemas relacionados con la medula espinal, pacientes o bien tetrapléjicos o parapléjicos. Los axones de la medula espinal están rotos, se buscaba que al menos se recuperase parte de movilidad/sensibilidad en piernas/brazos. El experimento se llevó a cabo en ratas y no hay resultados en humanos porque les costó mucho conseguir pacientes que se prestaran al ensayo, por lo que el ensayó acabó cancelado. 2. Hôpitaux de Paris. 2014-18 Parece que habían conseguido transformar cardiomiocitos prediferenciados en cardiomicitos adultos. Se inyectaron cardiomiocitos predifereciados en corazones infartados (cicatriz cardiaca: sin flujo de sangre). Fue el 1º caso reportado con ligera mejoría en el volumen de sangre que bombea el corazón, se rellenaba la cicatriz con estas células que acababan sintetizando colágeno y rellenando huecos. De 10 pacientes 1 tuvo algo de mejoría, pocos resultados. 3. UCL-Pzizer (London Proyect to Cure Blindness) Fueron estudios en pacientes con distrofia macular. El ojo es poco inmunogénico, porque está muy expuesto al exterior, por lo que usamos el ojo para intentar evitar el problema del rechazo de las células. Trataron a 2 pacientes en 2018, se vio algo de mejoría (12- 29 letras). Se cogen células prediferenciadas a retina y se ponen en la mácula. 4. AstellasPharma (EEUU) Se trataron pacientes tanto con distrofia macular de Stargardt (2011 y queda en Fase I/II) como con distrofia macular asociada a la edad (2011 y llegan a Fase II). 18 pacientes y 10 con mejoría. Lo más común es que el sistema vaya degenerando y te quedes ciego, es como un desprendimiento de retina, ves borroso. 5. OTROS ENSAYOS CHA BIOTECH: resultados análogos para distrofia macular en Corea UCLA, MIAMI, BOSTON, PHILADELPHIA: distrofia macular. ESC sobre soporte sintético. 24 pacientes en 2015-20, 3 con mejoría. HADASSAH EIN KEREM MED CTR, JERUSALEM: esclerosis lateral amiotrófica (ELA). 16 pacientes (2020). No datos. UNIV SAO PAULO (Brasil): distrofia macular. 15 pacientes, sin datos. VIACYTE (EEUU): diabetes. En desarrollo hasta 2021. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10458856 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  166 Bloque II. Biología Celular Mc Steamy URJC – 1º Medicina CYTOTHERAPEUTICS (Australia): parkinson, ligera mejoría. 6 pacientes, phESC. Se trata con células partenogenéticas, como en las células podría haber rechazo, si hacemos la partenogenética a partir de ovocito no fecundando, lo hacemos dividirse como si estuvieran fecundado aun sin estarlo, se forma blastocisto y conseguimos células madre embrionaria, no hay rechazo porque es una célula tuya. Estas se metieron en cerebro para intentar formar neuronas dopaminérgicas, pero al ser partenogenética podría no tener bien el patrón de metilación y dar lugar a un teratoma. Se hizo esto porque la dopamina es el principal Nt que hay en déficit en la enfermedad del Parkinson. Volviendo a los tipos de células madre pluripotentes: CÉLULAS PLURIPOTENTES INDUCIDAS (iPS) Eliminamos problema de dilema ético (no matamos embriones) y evitamos también el rechazo. Son derivadas de células diferenciadas transfectadas con factores de transcripción de células madre embrionarias, poseen por ello una gran capacidad de diferenciación. Presentan la posibilidad de pasar de un estado diferenciado a otro sin el estadio pluripotente (fibroblastos a neuronas, pacientes con Alzheimer). Le dieron el premio Nobel en 2014, consiguió una célula pluripotente inducida, que básicamente es conseguir célula con capacidad pluripotentes desde una célula adulta ya diferenciada (vamos hacia atrás). Se cogieron fibroblastos de la piel y se inyectan los factores de Yamanaka (por medio de un vector: virus inactivado, son los que están en círculos rojos en la foto), que se meten en núcleo y hacemos que se active transcripción de genes que estaban silenciados. Lo que pasa es que este vector puede hacer que un protooncogén pase a ser oncogén y desarrolle un tumor, hay que tener mucho cuidado con esto. Las células que consiguieron se parecían mucho morfológicamente y, además, tenían la capacidad de pluripotencia. Si inyectamos a un embrión un marcaje fluorescente (proteína verde fluorescente): - ANIMAL AL QUE NO INYECTAMOS IPS: no vemos nada. - ANIMAL AL QUE INYECTAMOS IPS: vemos coloreado de verde, al ver en microscopio de fluorescencia, que se han formado todos los tipos de tejidos en el animal. PROBLEMAS CON LAS IPS - TEMORES DE TUMOROGÉNESIS: 1/3 generan tumores in vivo, hay problema de vectores, que pueden afectar en la metilación de protoncogenes, acabando siendo oncogenes y desarrollando tumores. - REPROGRAMACIÓN EPIGENÉTICA INCOMPLETA a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10458856 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  167 Bloque II. Biología Celular Mc Steamy URJC – 1º Medicina APLICACIONES DE LAS IPS 1. Generar IPS específicas para cada paciente à ELIMINAMOS PROBLEMAS DE RECHAZO 2. TERAPIA CELULAR ESPECÍFICA: corregimos genes alterados por ejemplo con CRISPR-CAS9, cogemos células alteradas del paciente, las modificamos en laboratorio con CRISPR y después ya las diferenciamos y sustituimos las células dañadas del paciente por células nuevas y sanas. Aunque aún esto no se ha hecho está previsto hacerlo. Esto es específico para cada paciente y evitamos los problemas de rechazo, de tartar con embriones y del nº de células necesarias (embriones difíciles de conseguir pero células de la piel tenemos muchísimas). Lo que está con flecha continua es que ya está comprobado por ensayos y lo 3. DESARROLLO DE NUEVOS FÁRMACOS que está con flecha discontinua es que está pendiente de resultado de ensayos MÁS ENSAYOS CLÍNICOS DISTROFIA MACULAR ASOCIADA A LA EDAD: Inst. Riken (Japón) à 2014-2017 - Suspendido, continúan esnayos con células alogénicas (células madre sanas se obtienen de la sangre o la médula ósea de un donante emparentado) - Moorfields (RU): 2016, autólogas, todavía sin resultados. PARKINSON: Kioto (Japón), Reclutamiento en 2018 - Idea es conseguir iPS diferenciadas a neuronas dopaminérgicas, la dopamina es principal Nt deficitario en pacientes con Parkinson. IMPLANTE VS. HUÉSPED: Cynata Therapeutics (Australia), 2017- , ligera mejoría, iPS alogénicas. - Se trata de fabricar células que modulen sistema inmune para que este no se hiperactive, mejorando la aceptación de órganos trasplantados y evitando el rechazo hacia estos. REPARACIÓN CARDIACA: Osaka (Japón), 2 pacientes, 2019 - 100 millones iPS alogénicas: consiguiendo formar una especie de parche (con su actina, miosina y todo lo que tiene el tejido cardiaco). DIABETES TIPO I: Vertex y ViaCyte - Células β alogénicas pre o totalmente diferenciadas, intentando que estas sinteticen insulina. - Fases I/II, 2022 DATO SOBRE LOS ENSAYOS CLÍNICOS - FASE I: vemos si es tóxico o no, ver si pacientes lo toleran. - FASE III: ya es cuando se extrapola a pacientes y es el ensayo clínico ene sí, cuando se prueba en pacientes y se hacen los dobles ciegos… ** CLINICAL TRIALS.GOV: buscador para ver ensayos clínicos, que dicen hasta la fase en que están los ensayos en el momento en que lo estás mirando. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10458856 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  168 Bloque II. Biología Celular Mc Steamy URJC – 1º Medicina 3. CÉLULAS MADRE MULTIPOTENTES à CÉLULAS ADULTAS Están presentes en numerosos tejidos adultos, aunque no en todos son funcionales (puede ser que estén inactivadas en el tejido y por estímulos se activarán). Son responsables de generar las células del tejido donde se encuentran: piel, tejido nervioso, corazón, médula ósea, vasos… Antes se pensaba que había una célula madre para cada tejido, ahora sabemos que no es así, no hay un único tipo de célula madre en cada tejido, sino que hay varios tipos en cada tejido. Habrá más tendencia a diferenciarse hacia algunos tipos celulares que a otros en función del tejido en que nos encontremos. Cuando avanza el desarrollo embrionario las células van volviéndose más adultas, perdiendo capacidad de diferenciación cuanto más adultas, cuando ya son 100% adultas solo darán lugar al dividirse a células del tejido en que se encuentra. En algunos casos puede dar lugar a más de un tipo celular dentro del órgano en que se encuentra, o a veces dar lugar a más tipos celulares à según PLASTICIDAD CELULAR ** PLASTICIDAD CELULAR: capacidad de una célula madre adulta de dar lugar a distintos tipos celulares, a parte de los característicos del lugar en que se encuentra. A mayor plasticidad la célula se podrá dividir a más tipos celulares. APLICACIÓN CLÍNICA à Reparación del tejido donde son propias - TRANSFUSIONES SANGUÍNEAS DE CÉLULAS MODIFICADAS O NO (anemia falciforme corregida en julio 2019 con CRISPR/cas). La corrección de la anemia falciforme con CRIPR se basa en eliminar el gen que hace que los eritrocitos se sinteticen falciformes y así se corrige el problema, se ha aprobado hace muy poco y es muy caro. Cuando hacemos trasplante de médula ósea lo que hacemos es sustituir células madre hematopoyéticas del paciente (que están dañadas) por células madre hematopoyéticas del donante (sanas). - PATOLOGÍAS MEDULARES CON CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS CD34+ (con marcaje inmune anti CD43 podemos marcar las células hematopoyéticas, por eso son células CD34+, si no dieran positivo con este marcaje serían CD34-): las sacamos de médula, de sangre de cordón o periférica. Las células madre hematopoyéticas son células madre adultas capaces de dar lugar a todos los tipos celulares presentes en la sangre. Hace unos años se trasplantaron células madre hematopoyéticas de un sexo a otro, en la autopsia del receptor se vió que había neuronas del sexo opuesto, las célula hematopoyéticas se habían transformado en neuronas (es difícil controlar en que van a diferenciarse las células madre). IMPORTANTE PARA ENTENDER ESTA PARTE: en la médula ósea tenemos tanto células madre hematopoyéticas (CD34+) como estroma (lo que rodea tejido, y que es CD34-). Las positivas son las diferenciadas y las negativas están menos diferenciadas. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10458856 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  169 Bloque II. Biología Celular Mc Steamy URJC – 1º Medicina - PIEL ULCERADA Y PIE DIABÉTICO: Apligraf à fibroblastos y queratinocitos neonatales sobre colágeno (1998 y 2000, FDA). Se cogieron queratinocitos neonatales (más capacidad divisoria que los queratinocitos de una persona adulta, sobre todo se sacan de prepucio) y se ponen sobre colágeno (no es inmunogénico, no da rechazo pese a ser de otra persona), esto se usa mucho para tto de quemaduras, pero en Europa aún no está aprobado. Cuando esto se pone en cultivo se forma una “piel sintética”, no se busca que esta sustituya a la piel antigua, sino que se usa a modo de “parche” para que la piel crezca por debajo (ayuda en cicatrización) y cuando esta se ha regenerado el parche se cae. - PIEL EN QUEMADOS (lo que se hace en Europa): fibroblastos y queratinocitos autólogos sobre fibrina y agarosa (sustrato sintético). Los fibroblastos van formando colágeno y no hay rechazo porque los queratinocitos son del propio paciente. - EPIDERMOLISIS BULLOSA (1º caso): paciente 7 años, gran implante (0,8 m2), queratinocitos autólogos transgénicos para laminina. En la epidermólisis bullosa la piel se levanta solo con el roce, ya que el gen de la laminina está mutado (no tiene laminina) y no hay buenos contactos entre los estratos de la piel. Se sacaron queratinocitos del paciente y se transfectaron con un gen para laminina y los queratinocitos empezaron a sintetizar laminina, formando una “piel transgénica” (foto de la derecha, piel transparente). En marcaje fluorescente se ve de color verde. Cuando el paciente entró al hospital no tenía laminina (fotos con puntos suspensivos amarillos) pero dos años después su piel estaba regenerada (fotos de abajo y línea verde en marcaje fluorescente). - EPIDERMOLISIS BULLOSA (2º caso): transfección tópica ambulatoria de colágeno VII con virus herpes. Resultados + hasta 100 días. Esto se hizo en 2022, lo que fallaba en el paciente es que no había colágeno VII (falla lámina reticular de la lámina basal) y toda la piel se levantaba. Lo que se hizo fue meter gen de colágeno VII en virus inactivado, e infectar a la persona con este virus (vector), se hizo con ARN. Problema es que esto solo dura 3-4 meses y hay que estar haciéndolo cada varios meses, para que dure para siempre se podría hacer con ADN, pero podría meter en zonas no deseadas y producir mutaciones. Lo bueno es que este tto es más rápido que el anterior, resultados en menos meses. - CÓRNEA: pacientes quemados. Holocar à Células madre autólogas del limbo sobre soporte de fibrina. Fue el 1er producto aprobado en Europa (UE-EMA). Cogieron células madre del limbo corneal (donde están células madre de la córnea), si el paciente tiene dañado un ojo cojo las células madre del otro ojo (para transplante autólogo). - OTROS: cardiomiocitos (Cardiopatías), neuronas dopaminérgicas fetales (Parkinson), islotes de Langerhans (Diabetes), trasplante medular... DATO: algunas células madre adultas presentan GRAN PLASTICIDAD: capacidad limitada para diferenciarse a tejidos diferentes del propio. Como hemos visto ante donde las células hematopoyéticas se transformaron en neuronas, esto se da por la plasticidad celular, que es la capacidad de la célula para diferenciarse a cosas distintas a las que lo hace normalmente. - Diferenciación a distintos tipos celulares - Liberación de factores estimuladores a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10458856 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  170 Bloque II. Biología Celular Mc Steamy URJC – 1º Medicina 4 TEORÍAS SOBRE COMO OCURRE LA PLASTICIDAD CELULAR 1. MÚLTIPLES CÉLULAS MADRE: cuando metes cél madre en un paciente en un tejido pueden llegar a otro tejido e inducir a las células madre de ese tejido (que están inactivadas) para que se diferencien. Varios tipos de cél madre por tejido, no una solo. 2. FUSIÓN: casi descartado hoy en día, se ha visto in vitro que por ejemplo la célula madre hematopoyética de la donante se pudo fusionar con la neurona y por eso presentaba material genético del sexo opuesto. 3. TRANSDIFERENCIACIÓN: puede ir hacia atrás, volviéndose un poco pluripotente (se desdiferencia) y da otro tipo celular. 4. MULTIPOTENCIA: pese a no ser célula pluripotente sí que hay cierta capacidad pluripotente. CÉLULAS MESENQUIMALES (MSCS): CD34- Son las células madre adultas con más plasticidad encontrada hasta el momento, puede diferenciarse e inducir muchas cosas. Son células madre adultas porque están destinadas a forman todos los tejidos de origen mesenquimal (tej conectivo y todos sus derivados: hueso, cartílago, colágeno, adiposo…). DIFERENCIA CON CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICAS: son negativas para CD34 (CD34-), podemos encontrar estas MSC en M. ósea, sangre de cordón umbilical, sangre periférica, grasa, estroma umbilical, pulpa dental… Parece que el sitio original es el entorno de los vasos sanguíneos, por eso las CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES también se conocen como CÉLULAS MADRE PERIVASCULARES, ya que son células derivadas de pericitos y células adventicias (Perivascular Stem Cells, PSC). ¿QUÉ PASA CUANDO CULTIVAMOS MSC? - Si cultivamos IN VITRO: vemos que son capaces de diferenciarse a muchas cosas, lo normal sería que se diferenciaran a tejidos de la mesénquima, aunque también pueden diferenciarse a células pancreáticas, células parecidas a neuronas, a neumocitos del pulmón… - Si cultivamos IN VIVO (limitada): se diferencian a menos cosas. ** Cuando hablamos de congelar el cordón umbilical, lo que se congela es la sangre del cordón, que contiene células madre hematopoyéticas (CD34+) y mesenquimales (CD34-). Podemos tratar al donante con factor estimulante de colonias para poder coger células de sangre periférica (estimulamos que haya más en ella) para no tener que sacarlo de cresta ilíaca (hay más células pero conlleva ingreso del paciente en el hospital por varios días). SEGÚN ESTÍMULOS QUE RECIBAN LAS MSC SE DIFERENCIAN A UN TIPO CELULAR U OTRO 1. Diferenciación condroblástica: Western positivo para colágeno II (control con beta-actina). Con: TGF-b1, Sin suero: EGF; PDGF. 2. Diferenciación osteoblástica: Von Kossa o fosfatasa alcalina. Con: fibronectina; glicerolfosfato; dexametasona; ac. Ascórbico. Sin suero; EGF; PDGF. 3. Diferenciación adipogénica: Oil red, gen PPAR (metabolismo de los ácidos grasos). Con: suero de caballo. Sin: EGF; PDGF. 4. Diferenciación mioblástica: Con: 5-azacitidina; EGF; PDGF. Tras 24 h: sin (azacitidina); con (FBS). 5. Diferenciación endotelial: Con: VEGF (factor de crecimiento del epitelio vascular). CD34 +. Sin: suero; EGF; PDGF. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10458856 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  171 Bloque II. Biología Celular Mc Steamy URJC – 1º Medicina CRITERIOS MÍNIMOS PARA DEFINICIÓN DE CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES (EXÁMEN!!!) Como estas células salen de muchos sitios (cordón umbilical, grasa, pulpa dental…) va a haber una serie de criterios para distinguir células madre mesenquimales de otras: 1. Adhesión a la placa de cultivo. 2. Positivas para: CD 105, CD 73 y CD90. 3. Negativas para: CD 45, CD 34, CD 14 (CD11b), CD 79α (CD 19) y HLA-DR (complejo mayor de histocompatibilidad, la inmunidad de las células madre mesenquimales es baja, no hay casi rechazo en trasplante de células madre mesenquimales). 4. Capacidad de diferenciación in vitro a derivados mesodérmicos: osteoblastos (hueso), adipocitos (grasa) y condrocitos (cartílago). 5. También las podemos diferenciar a músculo o a células endoteliales (gran plasticidad celular). ENSAYOS EN LA CLÍNICA CON CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES COLUMNA IZQDA: donde podemos sacar células madre mesenquimales Estas células tienen EFECTOS PLEIOTRÓPICOS, es decir, cuando efecto va más allá de lo que podría parecer. Es un fenómeno por el cual un solo gen origina efectos fenotípicos o caracteres distintos no relacionados. Son capaces de: reducir inflamación (baja respuesta inmune), estimular la angiogénesis, además son capaces de liberar una serie de factores que inducen la diferenciación de otras células en el tejido en que se encuentran. A PESAR DE SU GRAN PLASTICIDAD NO SON CONSIDERADAS PLURIPOTENTES: porque no tenemos aún la garantía de que se puedan diferenciar a todo. Hay un grupo de células madre mesenquimales, aisladas en ratón de momento, las MAPC (célula adulta progenitora multipotente). MAPC: MULTIPOTENT ADULT PROGENITOR CELLS Son un grupo de células mesenquimales se ha visto su carácter multipotente porque al inyectarlas al blastocisto de un ratón sus descendientes han colonizado TODOS los tejidos del nuevo individuo. El ratón azul serían las MAPC, que han colonizado todo el individuo. Las MAPC de ratón salieron de médula del ratón, parece que se han encontrado en líquido amniótico humano (pero muy muy poca cantidad de estas células). Los marcadores embrionarios y telomerasa son los que permiten teñir al ratón de azul. Estas células se han encontrado en: - Cerebro - Hígado - Piel - Intestino delgado - Músculo estriado - Riñón - Miocardio - Bazo a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10458856 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  172 Bloque II. Biología Celular 160 Mc Steamy URJC – 1º Medicina COMERCIALIZACIÓN DE CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES Se intenta comercializar a modo de “engañabobos” diciendo que cremas tienen ADN o células madre mesenquimales, o incluso EGF, cuando si de verdad llevase ADN estaría entrando en tus células y formando organismo transgénico. O el EGF si de verdad entrase en la piel induciría crecimiento y formación de tumores. Otros ejemplos: crema antiedad con células madre de manzana, dicen que metemos células madre cuando si estas están en la crema están muertas y solo estarían vivas en cultivo (cosa que ya es difícil) por lo que lo venden engañando a la gente porque no hay estudios que demuestren que esto sirve para algo. Extracción de células madre mesenquimales de la pulpa dental: se dice que se cojan células madre de la pulpa dental cuando al niño se le caen los dientes, para guardarlas por si el niño necesita el día de mañana, no está demostrado que esto sirva todavía, no está claro que in vivo esto funcione o no. C´ELLE: se han encontrado células madre mesenquimales en líquido menstrual, por lo que se ha comercializado con esto también, diciendo que te guardan restos menstruales por si la mujer necesita células madre mesenquimales en un futuro, tampoco se sabe si estos sirven para algo. CRYOCELL: es una empresa que se dedica a congelar las células de la sangre del cordón umbilical. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10458856 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.