Bioquímica I - Tema 8a - Metabolismo del ADN - Transcripción (PDF)

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t8a.pdf mmmariadg Bioquímica I 1º Grado en Medicina Facultad de Ciencias Biomédicas y de la Salud Universidad Europea de Madrid Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5188563 María Díaz M18 Tema 8a – Metabolismo del ADN. Transcripción Las funciones del ARN son: 1. Almacenamiento de la información. 2. Transmisión de la información. 3. Catálisis. Transcripción: consiste en obtener una cadena de ARN complementaria a partir de un segmento de ADN de doble cadena (excepción: genomas de ARN de ciertos virus). Clases de ARN - ARN mensajero (ARNm): codifica la secuencia de aas de uno o más polipéptidos. - ARN de transferencia (ARNt): lee la información codificada en el ARNm y transfiere el aa adecuado a la cadena polipeptídica en crecimiento. - ARN ribosómico (ARNr): forma parte de los ribosomas. - Otros ARN especializados: con función reguladora, catalítica o precursores de los ARN anteriores. Transcripción por la ARN polimerasa en E. coli La transcripción requiere un molde de ADN (una de las hebras), ATP, GTP, UTP, CTP, Mg2+ y Zn2+. La dirección de síntesis es 5’→3´. El mecanismo catalítico es semejante al de las ADN polimerasas. 1 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5188563 María Díaz M18 - El grupo 3’-OH actúa como nucleófilo. - El Mg2+ facilita el desplazamiento del pirofosfato (PPi) y el ataque por el grupo 3’-OH. Para la selección del nucleótido se siguen las interacciones de Watson y Crick: A (en el ADN molde) → U (en el ARN). La ARN polimerasa no necesita primer, tiene que ser capaz de reconocer una secuencia específica, el Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. promotor. Cuando se une a él, se coloca el primer residuo. El primer nucleótido de 5´, en vez de 1 fósforo va a tener 3. Esto se debe a que es el primer nucleótido y nadie ataca su 3P porque no se necesita la liberación de energía de este enlace. Es decir, no se corta el grupo 5’-3P del primer residuo (no se libera PPi). La nueva cadena de ARN se aparea temporalmente con el ADN molde, formando una doble hélice híbrida ARN-ADN de 8pb. Cuando el ARN se “despega”, se restablece el dúplex de ADN. Burbuja de transcripción: la ARN polimerasa mantiene unos 17 pb desenrollados. El híbrido ARN- ADN se encuentra en esta región. Velocidad de elongación: 50-90 nucleótidos. El movimiento de las burbujas de transcripción provoca una rotación de las hebras de ADN, formando vueltas superhelicoidales. Por detrás de la burbuja se forman vueltas helicoidales negativas, y por delante positivas. Las topoisomerasas eliminan las vueltas superhelicoidales positivas y regulan el nivel de superenrollamiento negativo. Cadenas molde y no molde del ADN La secuencia codificante de un gen determinado puede estar situada en cualquiera de las dos hebras del cromosoma. La hebra que sirve de molde para el mensajero se denomina hebra molde / hebra sin sentido (los codones no codifican nada). La otra hebra se denomina hebra no molde / hebra con sentido / hebra codificante, porque tiene la información idéntica a la del ARNm (excepto en el cambio de T por U). Los promotores se analizan en 5´de la hebra codificante, aunque sea la hebra no codificante la que se tome de molde para la formación de ARNm. 2 Abre tu Cuenta NoCuenta con el código WUOLAH10 y llévate 10 € al hacer tu primer pago Bioquímica I Banco de apuntes de la a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5188563 María Díaz M18 ARN polimerasa de E.coli (dependiente de ADN) La ARN polimerasa es una enzima compleja y de gran tamaño que tiene 6 subunidades: 5 subunidades núcleo (α2ββ’ω) y 1 subunidad sigma (σ). Esta última se une de forma transitoria formando la holoenzima. Dirige al enzima núcleo hacia sitios específicos en el ADN y se encarga de identificar el promotor. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. Se pueden identificar distintas holoenzimas según el tipo de subunidad sigma (σ). La más común es σ 70 (70s). La ARN polimerasa no actividad exonucleasa 3’→ 5’. Promotores La ARN polimerasa, gracias a la subunidad sigma, se une a secuencias específicas del ADN denominadas promotores. En una secuencia de alrededor de 200 pb, y solo algunas inician la transcripción. Existe una secuencia promotor consenso, y cuanto más se parezca el promotor a la secuencia consenso, mayor afinidad y mayor número de nucleótidos se transcriben. Promotor de la ARN polimerasa en E. coli: Se extiende desde -70 a +30. + → pb a continuación del sitio de inicio de la transcripción. - → pb que preceden al sitio de inicio de la transcripción. Los sitios de interacción para σ70 son: - Secuencia consenso en -10 → (5’) TATAAT(3’). - Secuencia consenso en -35 → (5’)TTGACA(3’). Secuencia UP (upstream promoter): entre -40 y -60. Es rico en AT. Estimulan fuertemente la transcripción en los promotores que los contienen (no está en todos). Los promotores típicos de E. coli son reconocidos por la holoenzima que contiene σ70. La eficacia de unión y de inicio de la transcripción depende de estas secuencias consenso: de su presencia, del espacio entre ellas y la distancia al inicio de la transcripción. Los cambios en las secuencias en -10 y -35:  Alteran la función del promotor.  Afectan a la eficiencia de la unión de la ARN polimerasa.  Afectan al inicio de la transcripción. La secuencia del promotor determina el nivel de expresión basal de los diferentes genes de E. coli (si encuentro un promotor en 5´significa que hay un gen y que a partir de ahí va a empezar la transcripción). 3 Abre tu Cuenta NoCuenta con el código WUOLAH10 y llévate 10 € al hacer tu primer pago a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5188563 María Díaz M18 Fases de la transcripción 1. INICIACIÓN Consta de 2 partes: unión e inicio. La ARN polimerasa se une al promotor en el ADN. Se forma un complejo cerrado donde el ADN promotor no está desenrollado. Una región de 12 a 15 pares de bases (-10 a +2/+3) se desenrolla, cerca de la secuencia -10, formando un complejo abierto. Es entonces cuando empieza la transcripción dentro del complejo. Una vez sintetizados los primeros 8 o 9 nucleótidos, la subunidad σ es liberada. La ARN polimerasa abandona el promotor para elongar el ARN. CICLO SIGMA σ Para el inicio de la elongación, la proteína NusA se une a la ARN polimerasa y compite con la subunidad σ, desplazándola, de forma que la ARN polimerasa pueda elongar. Al completarse el proceso, NusA se disocia y la ARN polimerasa se separa del ADN. Así, un factor σ se puede unir a la enzima para iniciar un nuevo ciclo de transcripción. La ARN polimerasa está constantemente repitiendo este ciclo: se une a σ para transcribir y se une a NusA para elongar (moverse). E. Coli tiene otras clases de promotores que son reconocidos por las holoenzimas de la ARN polimerasa mediante diferentes factores σ. Ejemplo: el promotor de los genes del choque térmico solo se activa si σ70 es reemplazada por σ32. Solo se activan si E. coli ha sufrido un aumento brusco de la temperatura. Tiene 7 subunidades σ diferentes. La utilización de éstas permite que la célula coordine la expresión de conjuntos de genes implicados en importantes cambios de la fisiología celular. 2. MODELO DE LA ARN POLIMERASA DURANTE LA FASE DE ELONGACIÓN 4 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5188563 María Díaz M18 3. TERMINACIÓN Síntesis de ARN procesiva: una ARN polimerasa libera un transcrito prematuramente, es decir, se cae y no se engancha en cierto punto, debe empezar de nuevo (es incapaz de reanudar la síntesis de ese mismo ARN). La ARN polimerasa introduce un gran número de nucleótidos en la cadena de ARN en crecimiento antes de disociarse. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. Esto se debe a que no hay mecanismos de reparación y que solo transcribe ciertos trozos, a diferencia de la replicación. Ciertas secuencias de ADN producen una pausa y en algunas se produce la terminación. E. coli posee dos clases de señales de terminación: - Terminadores dependiente de ρ (es un factor proteico): carecen de AAA en la hebra molde. A veces contienen secuencia rica en CA denominada elemento Rut. La proteína ρ se une al ARN en lugares específicos. Migra en dirección 5’→3’ y se encuentra el complejo de transcripción detenido, lo que facilita la liberación del transcrito. Posee actividad ARN- ADN helicasa dependiente de ATP. - Terminadores independientes de ρ: poseen dos características: 1. Región en el transcrito de ARN con secuencias autocomplementarias, fabricada por la misma ARN polimerasa, formando una horquilla para que sea más fácil de cortar y se produzca la terminación. 2. Serie muy conservada de 3 aas AAA en la hebra molde, que transcriben a residuos UUU cerca del extremo 3’ de la horquilla. Cuando la ARN polimerasa llega a un sitio de terminación con esta estructura, se detiene. La formación de la estructura en horquilla en el ARN disocia varios pb A-U en el segmento híbrido ARN-ADN, y puede desorganizar interacciones importantes entre el ARN y la ARN polimerasa, facilitando la disociación del transcrito. 5 Abre tu Cuenta NoCuenta con el código WUOLAH10 y llévate 10 € al hacer tu primer pago a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5188563 María Díaz M18 Regulación de la transcripción La transcripción está regulada cuidadosamente para suministrar los productos génicos en las proporciones requeridas. Cualquiera de las etapas puede ser regulada. En condiciones normales, depende del promotor: su similitud con la secuencia consenso y de si hay inhibición al promotor. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. - Los activadores facilitan la unión de la polimerasa u otra etapa del inicio (proteína receptora de AMPc: enz. metab. azúcares). - Los represores bloquean la actividad de la polimerasa (represor Lac). ARN polimerasas eucariotas ARN polimerasa I: se encarga de la síntesis de ARN prerribosómico (18S, 5,8S y 28S). Sus promotores varían de una especie a otra. ARN polimerasa II: se encarga de la síntesis de ARNm y ARN especializados. Reconoce miles de promotores con secuencias diferentes pero características comunes. Existe la caja TATA, que es la secuencia de separación situada a -30 (en E.coli existen 2). Está formada por 12 subunidades. Es más compleja que su equivalente bacteriana, pero muy conservada su estructura, función y mecanismo. La subunidad grande RBP1 está en el extremo carboxilo terminal. Tiene una larga cola formada por múltiples repeticiones de una secuencia consenso de 7 aas: YSPTSPS (tyr-ser-pro-thr-ser-pro-ser). (Está llena de residuos fosforilables como la tirosina, serina, prolina y treonina). ARN polimerasa III: se encarga de la síntesis de ARNt, ARNr 5S y ARN especializados. Sus promotores están bien caracterizados, y poseen: secuencias reguladoras localizadas dentro del propio gen, y secuencias reguladoras localizadas corriente arriba del sitio de inicio. Transcripción en eucariotas Requiere muchas más proteínas para formar el complejo de transcripción activo. Son los factores de transcripción, que ayudan a la ARN polimerasa II. UNIÓN DE LA ARN POLIMERASA Y LOS FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN EN EL PROMOTOR 1. La formación de un complejo cerrado comienza cuando la proteína de unión a TATA (TBP) se une a la caja TATA. 2. El factor de transcripción TFIIB se une a su vez a TBP y al ADN, a ambos lados de TBP. TFIIB, junto a TFIIA, ayuda a estabilizar el complejo TBP-ADN. 3. El complejo TFIIF–Pol II, formado por el complejo de transcripción TFIIF y la ARN polimerasa II, se une al complejo TFIIB-TBP. TFIIF contribuye a dirigir a la ARN polimerasa II hacia sus promotores. 4. Finalmente se unen TFIIE y TFIIH, para completar el complejo cerrado. La actividad ADN helicasa de TFIIH (abre el ADN por la caja TATA) convierte el complejo cerrado en complejo abierto. Se necesitan más de 30 polipéptidos para formar este complejo activo. 6 Abre tu Cuenta NoCuenta con el código WUOLAH10 y llévate 10 € al hacer tu primer pago a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5188563 María Díaz M18 INICIO DE LA HEBRA DE ARN Y DESALOJO DEL PROMOTOR 1. La actividad quinasa de la TFIIH (fosforila el carboxilo terminal de la subunidad grande RBP1 de la ARN polimerasa II), provoca un cambio de conformación del complejo. 2. La polimerasa abandona el promotor y empieza la transcripción. 3. TFIIH y TFIIE se separan. ELONGACIÓN TFIIF permanece asociado a la ARN polimerasa II durante la elongación. Los factores de elongación ayudan a elongar (actividad polimerasa). También, suprimen las pausas durante la transcripción y coordinan la interacción entre complejos responsables de la maduración postranscripcional del ARNm. TERMINACIÓN Y LIBERACIÓN Existen proteínas que ayudan a la liberación y terminación: - ARN polimerasa I y III: realizan una función parecida a dependiente de rho. - ARN polimerasa II: es liberada, desfosforilada y reciclada. Se acopla a la maduración del ARN, proteína Rat1. Otras funciones de TFIIH La reparación del ADN dañado es más eficiente cuando los genes están siendo transcritos y en la hebra que actúa como molde. Si la ARN polimerasa II se detiene en una lesión de ADN, TFIIH actúa como componente esencial del complejo autónomo de reparación por escisión de nucleótidos. Síndrome Cockayne: las células presentan una alteración específica en la vía de reparación acoplada con la transcripción (TCR), un subtipo de la NER implicada en la reparación de las lesiones de DNA inducidas por los rayos UV en los genes activamente transcritos. X. pigmentosum. Regulación de la transcripción en eucariotas Es un proceso complejo en el que intervienen una serie de proteínas reguladoras que interaccionan con factores de transcripción y con la ARN polimerasa II. Inhibición de la ARN polimerasa El ARN es más reactivo que el ADN, no solo por estar más expuesto por ser monocatenario, sino porque su ribosa tiene un -OH en el C2 (el ADN tiene desoxirribosa con un -H en el C2). Actinomicina D y Acridina La porción plana de la molécula se intercala en el ADN, entre pares G-C sucesivos. Esto provoca la deformación del ADN, impidiendo el desplazamiento de la ARN polimerasa. 7 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5188563 María Díaz M18 Rifampicina Se une a la subunidad β de ARN polimerasa bacteriana e impide el desalojo del promotor, por lo que no se puede replicar el material genético. α-Amanitina Bloquea la ARN polimerasa II, que se encarga de transcribir los ARNm, por lo que evita la formación Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. de nuevas proteínas. A altas concentraciones también bloquea a la ARN polimerasa III, por lo que no lleva aminoácidos a los ribosomas para la formación de proteínas. 8 Abre tu Cuenta NoCuenta con el código WUOLAH10 y llévate 10 € al hacer tu primer pago