T4-Reticle-endoplasmàtic PDF

T4-Reticle-endoplasmatic.pdf FarmaHero_05 Biología Celular 1º Grado en Farmacia Facultad de Farmacia y Ciencias de la Alimentación Universitat de Barcelona Reservados todos los derechos. No se permite la explotaci...

T4-Reticle-endoplasmatic.pdf FarmaHero_05 Biología Celular 1º Grado en Farmacia Facultad de Farmacia y Ciencias de la Alimentación Universitat de Barcelona Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10859939 TEMA 4: El Reticle Endoplasmàtic i la Biosíntesi de proteïnes 1. ESQUEMA HIPOTÈTIC DE L’ORIGEN EVOLUTIU DEL R.E. Fa m.a., les archeobacteries van formar invaginacions que es van expandir a dins de la cèl·lula, formant una xarxa de tubs seguida d’un embolcall nuclear. Per tant, es veu com l’embolcall nuclear és part del RE ja que conforma una xarxa tubulo-vesicular de la cèl·lula. Explicació: Les archeobacteries s’havien d’alimentar i ho feien enviant enzims digestius a l’exterior a través de proteïnes translocadores. En invaginar-se la membrana, aquestes proteïnes es van començar a sintetitzar al RE, igual que els enzims digestius (per ser transportats per endosomes i lisosomes). ➔ Funció actual RE: síntesi de proteïnes, d’enzims, d’hormones i d’altres molècules que han de ser secretades a l’exterior. 2. MORFOLOGIA Com el podem observar? a) Immunodetecció indirecta: utilitzant un anticòs secundari amb fluorescència per detectar les proteïnes de la membrana del RE. Gràcies a les proteïnes fluorescents es pot observar in vivo i a temps real. S’observa: - El RE forma una xarxa intracel·lular que ocupa quasi tot el citoplasma. - La dinàmica del RE i de les proteïnes→ constantment es creen noves estructures i tubulacions a la vegada que se’n destrueixen. b) Microscopi electrònic (ME): per observar a nivell ultraestructural. S’observa: - Els ribosomes estan al RE rugós i al citosol, produint la síntesi de proteïnes. Com ho fan? 1. El ribosoma s’uneix a la cadena de RNA (la qual pot presentar un pèptid senyal per la unió amb la membrana del RE, SPR, o no) i la comença a traduir per l’extrem N-terminal, en sentit 5’→3’, fins a l’extrem C-terminal. 2. Altres ribosomes s’hi poden unir i traduir el mateix RNA simultàniament = polirribosoma. DEFINICIÓ: Laberint de cisternes i tubs interconnectats que comparteixen un mateix espai o lumen. DOMINIS DEL RE: 1) Embolcall nuclear→ és continu en tota la xarxa i pot presentar ribosomes en la seva membrana externa. 2) Domini rugós→ duu a terme el control de qualitat, és a dir, el procés post-traduccional perquè les proteïnes surtin del RE. 3) Domini llis: a. Dominis especialitzats en la formació de cossos lipídics (lipid droplets): - Homeostasi lipídica = quan la cèl·lula rep àcids grassos, els esterifica amb enzims i forma lípids neutres (acilglicèrids, diacilglicèrids, triacilglicèrids) i aquests cossos lipídics els emmagatzemen. - Lipòlisi = desfà el procés anterior per enviar els àcids grassos als mitocondris i oxidar-los per obtenir ATP. b. Dominis especialitzats en crear vesícules de transport: Permeten enviar molècules fins a la seva destinació. 4) MCS (Membrane Contact Sides)→ llocs del RE on hi ha contacte entre la membrana del RE i un compartiment per facilitar el transport de molècules, sobretot fosfolípids. MAM (Mitochondria Associated Membrane): llocs del RE on hi ha contacte entre la membrana del RE i la dels mitocondris, degut a la inexistència de vesícules de transport entre aquests dos compartiments. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10859939 3. FRACCIONAMENT CEL·LULAR: Homogeneïtzació i centrifugació diferencial Tècniques per estudiar les proteïnes dels diferents compartiments: a. Obtenir un teixit i separar una cèl·lula d’aquest b. Homogeneïtzació mecànica→ Trencar la MP de la cèl·lula per aïllar-ne els seus compartiments, utilitzant un homogeneïtzador (tampó i èmbol que, per fricció mecànica, ens permeten trencar la cèl·lula a 4ºC). Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. c. Centrifugació diferencial→ Separar els compartiments segons les seves densitats. Alguns sedimenten a una velocitat i uns altres a una altra velocitat. - També es trenquen les membranes del RE però en dissolució aquosa es tornen a tancar i es formen microsomes (llisos del RE llis o rugosos del RE rugós), els quals també podem separar segons la seva densitat. Experiment: Es van aïllar microsomes rugossos i van ser cultivats amb AA radioactius (aa*), com la metionina. Aquesta, es va incorporar a proteïnes (que es troben al RE, dins els microsomes) i es va poder observar, gràcies al seu caràcter radioactiu, que al RE és on es sintetitzen aquestes. 4. ELECTROFORESI EN GELS D’ACRILAMIDA EN SDS S’utilitza per separar les proteïnes d’un compartiment. 1) Barrejar proteïnes solubilitzades amb detergents o altres productes. 2) Incubar la barreja, escalfant-la, en una solució determinada d’agents reductors per reduir els ponts disulfur: - Les subunitats proteiques es separen - Les estructures es trenquen - Les proteïnes es despleguen. 3) Afegir SDS a la barreja per a marcar totes les proteïnes negativament. ➔ SDS = detergent iònic amb càrrega negativa que s’uneix a les regions hidrofòbiques de les proteïnes. 4) Col·locar un tampó, un càtode i un ànode als extrems del gel d’acrilamida (polímer més compacte o més laxe, segons la quantitat d’acrilamida, i que actua com a conductor entre els pols). 5) Aplicar corrent, que viatja del pol negatiu al pol positiu, per a que les proteïnes es desplacin cap al pol positiu, travessant les escletxes del gel d’acrilamida. Es divideixen en bandes segons el seu pes molecular, unes viatgen més ràpid que les altres en funció de la seva mida. 6) Observar, per espectrometria de masses, les proteïnes que hi ha. Les proteïnes es poden transferir a una membrana de paper, per treballar amb elles més fàcilment: 7) Amb un tac de transferència, aplicar corrent sobre el gel (partit per una membrana de paper), per a que les proteïnes es desplacin i quedin retingudes en les fibres de cel·lulosa. 8) Incubar la membrana i detectar les proteïnes amb anticossos. 5. SUBDOMINIS DEL RETICLE ENDOPLASMÀTIC Tu ex no te dejó las cosas claras, pero nosotros la rutina sí. Biología Celular Banco de apuntes de la a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10859939 Els diferents dominis són imprescindibles. Per exemple, el RE rugós de les cèl·lules hepàtiques, les UDLs (lipoproteïnes de transport importants). 6. TRANSPORT DE PROTEÏNES TRANSPORT POST-TRADUCCIONAL (trans-membrana) Proteïnes que es sintetitzen al citoplasma però que han de ser transportades amb un mecanisme determinat fins a un teixit específic perquè puguin realitzar la seva funció. Les proteïnes, a més, han d’estar amb estructura terciària. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. Aquestes proteïnes es tradueixen i, després, arriben al reticle: 1. Les xaperones mantenen la proteïna desplegada i la transporten fins al translocon (canal Sec63) del RE. 2. El canal s’obre i permet l’entrada de la proteïna 3. A la llum del RE, les BiP faciliten l’entrada de la proteïna→ És possible perquè són similars a les proteïnes citosòliques i perquè tenen funció ATPasa. TRANSPORT CO-TRADUCCIONAL En aquest transport, la traducció de l’ARN i la incorporació de les proteïnes al RE es fa simultàniament. És possible gràcies a les seqüències senyals (SS) = està a l’extrem N-Terminal i té un nucli de 10 AA hidrofòbics. 1) La SS és reconeguda per una partícula de reconeixement de senyal, SRP = 6 unitats proteiques + ARN (ribonucleoproteïna). 2) Les SRP creen un domini que s’acomoda a la regió hidrofòbica de la proteïna que es va traduint. La SRP s’uneix a la SS i el ribosoma la transcriu. - Té molts AA hidrofòbics que es poden unir a SS - Té metionina = AA flexible que permet l’acomodació del domini a certes SS 3) El complex (SRP + ribosoma + ARNm) viatja fins a la membrana del RE, on hi ha el receptor que interacciona amb l’SRP. El complex queda situat al costat del translocon. 4) Quan el receptor i el complex estan units a GTP, el complex pot arribar a la membrana. Quan interaccionen s’activa l’activitat GTPasa i s’inicia la hidròlisi de GTP a GDP. 5) El receptor i el complex deixen d’interaccionar. SS queda lliure i interacciona amb l’interior del translocon. El ribosoma continua amb la traducció mentre s’incorpora al compartiment diana. 6) Les peptidases hidrolitzen el segment final de la proteïna (part hidrofòbica) i, així, la proteïna passa a ser soluble. Tu ex no te dejó las cosas claras, pero nosotros la rutina sí. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10859939 7) S’acaba de transcriure i pot ser: - Resident del RE o altres compartiments (AG, lisosomes...) = hi accedeix per transport vesicular - De secreció = s’allibera a l’exterior per transport vesicular (hormones, enzims digestius...) 7. FORMACIÓ DE PROTEÏNES TRANSMEMBRANA 1) En produir-se la síntesi de la proteïna, es forma una regió hidrofòbica important a la SS. 2) Quan la regió hidrofòbica arriba al translocon, interaccionen fortament i s’atura el pas de la proteïna. La síntesi de la proteïna finalitza al citosol. 3) Quan acaba la síntesi, el canal s’obre i, si la SS no pertany a la proteïna s’elimina (quedant adherida a la membrana) i queda una regió citosòlica de la proteïna transmembrana. L’extrem C-Terminal pot quedar a la llum del RE o a la cara citosòlica de la membrana. L’orientació depèn de la posició dels AA propers a la juxtamembrana (regió transmembrana): Si els AA es troben en aquest extrem i són positius: afavoreixen la interacció amb fosfolípids negatius de la cara citosòlica i queden situats en aquesta. Si els AA es troben en l’extrem N-Terminal: la proteïna queda al revés. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10859939 Proteïnes multipas = Es conformen en la seva manera característica ja que tenen varies regions hidrofòbiques: una regió d’aturada i una de continuació. 8. MODIFICACIONS POST-TRADUCCIONALS La gran majoria de proteïnes transmembrana es sintetitzen al RE rugós. En aquest cas, és important que madurin correctament (pateixin canvis post-traduccionals) per poder ser funcionals. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 1. Oligomerització: Unió de les diferents subunitats de la proteïna sintetitzades al reticle per a conformar l’estructura quaternària. Té lloc al reticle endoplasmàtic. Ex: CATALASA - tetràmer de 4 cadenes polipeptídiques 2. Ponts disulfur: Formació de ponts-disulfur entre cisteïnes properes perquè la proteïna pugui plegar-se correctament donant lloc a l’estructura terciària, gràcies a l’enzim disulfat-isomerasa. Es duu a terme al reticle gràcies al seu ambient oxidant, que permet l’oxidació d’hidrògens units a sofres i a la cisteïna de les proteïnes (C-SH). ➔El citosol al ser un ambient reductor NO permet la formació de ponts disulfur. 3. Proteòlisi: Perquè es pugui dur a terme la maduració de les proteïnes, les peptidases eliminen seqüències senyals de la proteïna que no han de ser-hi. Es duu a terme al reticle endoplasmàtic i acaba en altres compartiments. Ex: Les proteïnes que tenen ancorades GPI. A la llum del RE, les proteases trenquen les proteïnes perquè puguin unir- se covalentment a un GPI. Després, viatgen fins a la membrana plasmàtica i es situen a la cara citosòlica. Tu ex no te dejó las cosas claras, pero nosotros la rutina sí. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10859939 4. Glicosilació: Aquest procés afavoreix el correcte plegament de les proteïnes. A la llum del RE, una proteïna que presenta una Asparagina i davant té un AA qualsevol (excepte prolina) i una Serina o Treolina és reconeguda per les glicosil- transferases. Aquestes glicosil-transferasas incorporen 14 sucres (2 N-acetilglucosamina + 9 manoses + 3 glucoses) al grup NH de Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. l’asparagina quan la proteïna es tradueix. ➔Els primers 7 sucres s’afegeixen gràcies al lípid dolicol que està a la membrana del RE. Objectiu: La interacció de la proteïna amb la calnexina (xaperona), que s’encarrega de plegar el polipèptid perquè passi a ser una proteïna. La majoria de proteïnes que arriben a la membrana plasmàtica estan glicosilades (Ex. receptors). La glicosilació fa que augmenti l’afinitat entre el receptor i l’hormona. - Reticle: N-glicosilació. Els 14 sucres s’uneixen al grup NH de l’asparagina. - Aparell de Golgi: O-glicosilació. Els 14 sucres s’uneixen al grup OH de l’asparagina. 5. Plegament: Modificació que permet a la proteïna adquirir la seva morfologia correcta. Estructura primària // Estructura secundària // Estructura terciària // Estructura quaternària Tipus 1: Les xaperones de la llum del RE (les BiP, calnexina i calreticulina soluble), retenen la proteïna de forma desplegada perquè altres enzims puguin plegar-la correctament per així madurar. Tipus 2: a. Les proteïnes glucosidasa 1 i 2 hidrolitzen les glucoses terminals dels sucres i la proteïna queda monoglicosilada. b. Així, la proteïna pot interaccionar amb la calreticulina (proteïna soluble) i la calnexina (proteïna transmembrana resident, té calci) i aquestes la retenen. c. Els enzims UDP actuen i la pleguen correctament mitjançant ponts disulfur. d. Hi pot haver 2 situacions: - Proteïna plegada correctament = viatja fins al compartiment diana o és excretada Tu ex no te dejó las cosas claras, pero nosotros la rutina sí. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10859939 - Proteïna plegada incorrectament = la glucosiltransferasa interacciona amb SS de la proteïna que són accesibles degut a la seva errònia conformació (senyal de reconeixement) i li afegeix una glucosa. Aquesta és reconeguda per la calnexina i el procés es repeteix fins que és plegada correctament. Abans que la proteïna surti del reticle, és necessari un control de qualitat. ERAD (ER associated degradation) Molt sovit, en el RE hi ha proteïnes que mai arriben a adoptar la seva conformació correcta. Si aquestes s’acomulen produeixen l’estres d’aquest orgànul i, per tant, impedeixen el correcte funcionament d’aquest. Per evitar-ho, aquestes proteïnes han de ser eliminades. Ho fan mitjançant l’ERAD. Procediment: 1. Les proteïnes plegades incorrectament són reconegudes per l’ERAD. 2. A través d’aquest, les proteïnes són reconegudes per altres com pel sistema de proteïnes EDEM. ➔A la llum del RE, les manosidases (↓ concentració), escurcen les manoses de les proteïnes, deixant aquestes amb pocs d’aquests sucres i, per tant, conformant un senyal de reconeixement pel sistema EDEM. 3. Les proteïnes s’envien al citosol a través del translocons i allà són deglicosilades i reconegudes per les ubiquitin- lligases. 4. Després, són ubiquitinitzades i eliminades pel proteosoma. UPR (Unfolded Protein Response) La resposta ERAD ve englobada per a resposta UPR. La resposta UPR intenta: - Sintetizar xaperones augmentant així la seva concentració per evitar o ajudar a formar proteïnes correctament (a plegar- les com cal). - Reduir la síntesi de proteïnes - Degradar les proteïnes mal plegades - Sintetitzar proteïnes que intervenen en la resposta ERAD La cèl·lula pot prendre 4 respostes quan hi ha un conjunt de proteïnes mal plegades. Cadascuna d’aquestes respostes necessita d’uns receptors de la membrana RE que permeti la detecció del problema i l’activació de la UPR. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10859939 1. Activació de la resposta EDEM (receptor IRE-1): És una ribonucleasa transmembrana, una proteïna transmembrana monomèrica que s’activa quan s’uneix a un altra d’igual (amb regió citosòlica, regió transmembrana i regió a l’interior del RE) que s’uneix a les xaperones BiP: Les xaperones BiP s'uneixen a les proteïnes mal plegades i hi queden ancorades. Les BiP deixen d’interaionar amb l’IRE-1 i aquest queda lliure per unir-se amb un altre IRE-1 per així formar un dímer activat. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. Aquesta unió permet l’activació ribonucleasa de les IRE-1 i aquestes eliminen els introns de molècules de RNAm. En canvi, els exons dels mRNA es lliguen entre ells formant l’ARN correcte i es tradueix. Dóna lloc al factor de transcripció XBP-1 (proteïna). Aquest factor viatja fins el nucli, s’uneix a un DNA i activa l’expressió de gens que codifiquen la formació de xaperones i proteïnes que activen la resposta ERAD. Per tant, es sintetitzen noves xaperones 2. Activació de noves xaperones que pleguin correctament les proteïnes (receptor ATF-6): Quan la proteïna transmembrana ATF-6 es troba al RE és retinguda per una proteïna transmembrana i s'alliberen les BiP. Aquestes viatgen fins a l’Aparell de Golgi per activar-se. Un cop hi arribem, les proteïnes ATF-6 es tallen amb un enzim o s’hidrolitzen. La seva porció citosòlica actua com a factor de transcripció que viatja fins el nucli on activa l’expressió gènica i inicia la formació de xaperones i proteïnes ERAD. 3. Disminució de la síntesi proteica general de la cèl·lula (receptor PERK o PEK): La proteïna PERK o PEK fa que el reticle endoplasmàtic treballi menys. És una quinasa que es troba al RE i quan s’activa, fosforila els seus substrats. De normal, les proteïnes PERK o PEK interaccionen amb les xaperones BiP Quan hi ha un excés de proteïnes mal plegades, les xaperones BiP alliberen les PERK o PEK i queden lliures. D’aquesta manera, aquestes proteïnes poden unir-se a una altra PERK o PEK per formar un dímer. Aquesta unió fa que s’activi l’activitat quinasa d’aquests receptors i aquests fosforilen el eIF-2 (Factor iniciador de la traductor d’eucariotes). Tu ex no te dejó las cosas claras, pero nosotros la rutina sí. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10859939 ➔L’eIF-2 facilita el reconeixement del codó que codifica per la metionina (ATG = AUG = metionina), que és el primer aminoàcid (AA) de totes les proteïnes. Aquesta fosforilació inhibeix la formació de metionina i, per tant, provoca la disminució de la síntesi proteica perquè el RE tingui més temps per resoldre el problema. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. Aquests 3 sensors actuen simultàniament per resoldre el problema del RE. Tot i això, és necessari un CONTROL DE QUALITAT molt restrictiu. Això vol dir que, fins que la proteïna no s’hagi sintetitzat correctament, el RE no la pot enviar al seu destí. En resum, si tot aquest procés no funciona la cèl·lula morirà per apoptosi (s’haurà d’eliminar). EXEMPLE: Fibrosi quística (malaltia causada per l’alta restrictivitat) La fibrosi quística és una malaltia autosòmica recessiva que es desenvolupa en 1 de cada 2000-4000 nadons i és degut al mal funcionament del canal de la CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). El canal de la CFTR es troba a la membrana apical de les cèl·lules epitelials i s’encarreguen d’alliberar calor cap a la llum de les cèl·lules per provocar l’alliberació d’aigua en aquesta zona (hidratació). Aquesta hidratació permet el moviment dels cilis i la neteja d’aquesta zona, per on passa la circulació. Tu ex no te dejó las cosas claras, pero nosotros la rutina sí. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10859939 Quan el canal de la CFTR no funciona, no s’allibera calor cap a la llum de les cèl·lules i es forma un mucus que impedeix que els cilis natejin la zona. Per tant, afavoreix les infeccions bacterianes i quístiques i el teixit queda malmès. A més, el funcionament de transport d’ions Cl- i Na+ no es duu a terme correctament, provocant una acumulació d’ions a la cèl·lula. El mal funcionament d’aquest canal normalment és degut per la presència d’una mutació en la CFTR (ΔF508-CFTR) A aquesta li falta un AA (la fenilalanina 508). Això fa que no es plegui correctament i,→ per tant, és detectada per l’ERAD i és eliminada pel proteosoma. La patologia es produeix perquè la proteïna continua sent funcional però no pot ser degradada i el mucus és tant espès que fa que: a. L’intercanvi de gasos sigui menys eficaç b. Augmentin les pobabilitats d’infecció pulmonar Tractament de la malaltia “estratègies farmacològiques”: - Fàrmacs que rebaixin el control de qualitat restrictiu del RE o fàrmacs inhibidors de les ubiquitin-ligases. - Fàrmacs inhibidors de les PDE ja que són les proteïnes que fosforilen els AMPc, els quals activen les PKA, proteïnes responsables de millorar l’activació de les CFTR en fosforilar-les. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.