UT 5 Pruebas de Identificación Parte 2 PDF

CFGS LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO MÓDULO: MICROBIOLOGÍA CLÍNICA UT 5 PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN PARTE 2 CONTENIDOS 1. SISTEMAS COMERCIALES MULTIPRUEBA 2. ESPECTRO DE MASAS 2.1 Los equipos MALDI 2.2 Procedimiento de trabajo a) Preparación de las muestra...

CFGS LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO MÓDULO: MICROBIOLOGÍA CLÍNICA UT 5 PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN PARTE 2 CONTENIDOS 1. SISTEMAS COMERCIALES MULTIPRUEBA 2. ESPECTRO DE MASAS 2.1 Los equipos MALDI 2.2 Procedimiento de trabajo a) Preparación de las muestras b) Uso del equipo 2.3 Aplicaciones en microbiología clínica 3. PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIBIOTICOS 3.1 Los antibióticos 3.2 La resistencia a antibióticos. 3.3 El antibiograma 3.3.1 técnicas para calcular la CMI 1) Técnicas de difusión - con disco - con tira 2) Método BLEE 3) Técnicas de dilución - Macrodilución - Microdilución 4) Métodos automáticos 1 Profesora: Helena Amigo González CFGS LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO MÓDULO: MICROBIOLOGÍA CLÍNICA 1. SISTEMAS COMERCIALES MULTIPRUEBAS Una opción muy utilizada para la identificación son los sistemas o equipos multipruebas, que consisten en dispositivos con entre 10 y 50 celdillas. En cada celdilla se desarrolla una prueba bioquímica distinta, lo cual permite realizar a la vez entre 10 y 50 pruebas. Es imprescindible aplicar rigurosamente las instrucciones del fabricante en lo que concierne a las características del inóculo, a la forma de inoculación, a las condiciones de cultivo... 2. ESPECTRÓMETRO DE MASAS La espectrometría de masas es una técnica que permite analizar con gran precisión la composición de diferentes elementos químicos al hacer la medición de iones separándolos en función de su relación masa/carga En microbiología se aplica la espectrometría de masas MALDI (Matrix Assited Laser Desorption/Ionization, o desorción/ionización láser asistida por matriz). La tecnología MALDI permite la identificación fenotípica de bacterias y hongos a nivel de género y especie, de forma muy fiable y en mucho menos tiempo que otras técnicas utilizadas en microbiología clínica diagnóstica. Mediante esta técnica se obtiene un espectro de masa compuesto por diferentes picos obtenidos tras la ionización/desorción (lo contrario a adsorción) de péptidos y pequeñas proteínas característicos de cada especie bacteriana. 2.1 LOS EQUIPOS MALDI-TOF El microorganismo presente en la muestra, mediante una reacción proporciona un espectro de masa diferente para cada género y especie; se trata de una huella química comparable a las huellas digitales ya que cada microorganismo tiene la suya. Comparando el espectro obtenido con los espectros de referencia que tiene almacenados el equipo en un software específico, se puede saber en pocos minutos qué microorganismo está presente en la muestra. Este sistema permite reducir tiempos en la identificación de microorganismos. Los equipos más utilizados en microbiología son del tipo MALDI-TOF, espectros de masa que incorporan un detector de iones (TIME OF-FLIGHT). Un ejemplo de equipo MALDI-TOF es el siguiente: 2 Profesora: Helena Amigo González CFGS LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO MÓDULO: MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Este sistema permite reducir tiempos en la identificación de microorganismos. 2.2. PROCEDIMIENTO DE TRABAJO La técnica se puede aplicar con todo tipo de muestras de importancia clínica, pero las más habituales son las que proceden de medios sólidos (colonias aisladas). Existen muestras que pueden procesarse directamente, sin hacer cultivo previo: sangre, orina o líquido pleural, sinovial y cefalorraquídeo (aunque necesitan un tratamiento previo). La limitación de la técnica para la identificación directa a partir de muestras clínicas tiene 3 dificultades: - La densidad de microorganismos: se necesitan muestras con alta densidad - La disponibilidad de suficiente muestra. - Tienen que ser muestras con un único microorganismo. 3 Profesora: Helena Amigo González CFGS LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO MÓDULO: MICROBIOLOGÍA CLÍNICA a) LA PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS En los laboratorios en los que se analizan cada día muchas muestras diarias con MALDI-TOF, éstas se preparan por grupos (exudados, hemocultivos, etc). Cada conjunto de muestras que se analizan en grupo se denomina Proyecto. Una limitación es que sólo da resultados óptimos con muestras que contengan un único tipo de microorganismo, por lo tanto, es necesario disponer de cultivos puros o aislamientos. El procedimiento para preparar las muestras puede ser: - Directo: a partir de colonias de bacterias u hongos. - De extracción: Con una metodología previa específica (muestras de hemocultivos positivos, micobacterias y hongos filamentosos en la que se eliminan artefactos. b) EL USO DEL EQUIPO Para cada Proyecto, independientemente de cómo se hayan preparado las muestras se aplica la siguiente pauta: 1) LA IDENTIFICACIÓN En primer lugar, es necesario la asociación de muestras y pocillos para poderlas identificar de forma inequívoca. Para ello se identifican en plantillas de papel y en el ordenador con filas y columnas numeradas. 2) LA CARGA DE LAS TARJETAS Se procede a llenar los pocillos con las muestras poniendo una pequeña cantidad con un palillo o el asa de siembra en cada pocillo. Para cada proyecto se introduce un pocillo un control comercializado con un microorganismo identificado. Se deja secar Se añade ácido fórmico y se deja secar ( en el caso de que sea necesario una lisis celular no para todas las muestras). Se añade la matriz fotosensible (recién preparada) y se deja secar. Una vez preparada la tarjeta la introducimos en el equipo y creamos el proyecto que contenga los números de muestras y las posiciones. Por último, desde el ordenador se activa la lectura. 3) EL RESULTADO 4 Profesora: Helena Amigo González CFGS LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO MÓDULO: MICROBIOLOGÍA CLÍNICA El programa muestra una tabla resumen con la información de todas las muestras del Proyecto. Los resultados de las muestras aparecen con una puntuación que indica el grado de correlación entre el espectro obtenido y un espectro almacenado en la biblioteca. Los Valores aparecen así: > 2: verde, resultado fiable a nivel de género y especie. >1.7-2: amarillo probable identificación. Fiable a nivel de género. < 1.7 Rojo: identificación poco fiable o sin identificación. 4) LOS REACTIVOS La preparación e incorporación de los reactivos se debe realizar con precisión para que los resultados obtenidos sean correctos. Necesitaremos la solución matriz, un control (que se comercializan liofilizados y que debemos reconstituir). LA SOLUCIÓN MATRIZ - La matriz y la muestra deben estar en proporción 1:1 - Existen varios tipos de matrices según las necesidades de cada laboratorio. - La reconstitución de la matriz se lleva a cabo en campana extractora y con guantes de nitrilo. - Tiene una elevada volatilidad y se debe conservar a Tª próxima a 20ºC y protegida de la luz. EL CONTROL - Es imprescindible usar un control positivo para calibrar el sistema y comprobar que los productos están en perfectas condiciones. 5) PRECAUCIONES DE USO Esta tecnología proporciona una lectura rápida: 100pocillos/ h y reconoce con precisión a más de 4000 microorganismos. Para alcanzar una buena sensibilidad hay que trabajar con las muestras de una forma muy exacta. Se debe aplicar las siguientes recomendaciones: 5 Profesora: Helena Amigo González CFGS LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO MÓDULO: MICROBIOLOGÍA CLÍNICA - En muestras sólidas la cantidad máx. 1µg y extenderla bien. - La matriz recién preparada da mejores resultados - Es necesaria una limpieza periódica de la fuente de ionización. - Se necesita una calibración diaria y otra específica tras la limpieza. 2.3 LAS APLICACIONES EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Los equipos MALDI-TOF realizan análisis de todo tipo de muestras clínicas, aunque pocas se pueden procesar directamente. Es de especial importancia en las situaciones en las que el tiempo desempeña un papel clave (hemocultivos, sospecha de meningitis…). Esta técnica está en pleno desarrollo y aún presenta debilidades: - No tiene una biblioteca de todos los microorganismos - No distingue los procedentes de pruebas polimicrobianas - Limitación con la identificación de especies próximas filogenéticamente - Los equipos son muy caros 3. LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS Las pruebas de sensibilidad a antibióticos determinar qué antibióticos serán más efectivos para tratar una infección concreta. 3,1 LOS ANTIBIÓTICOS Son sustancias que interfieren en el crecimiento y afectan a la supervivencia de las bacterias. Los mecanismos de acción son diversos, incluso un mismo antibiótico puede actuar a más de un nivel. Pero, de forma general, todos operan en alguno de estos niveles: - Impidiendo la síntesis de ácidos nucleicos, las proteínas o la pared celular. - Alterando la membrana celular de la bacteria Dependiendo de las consecuencias de su actividad, podemos distinguir entre: Antibióticos bacteriostáticos: Bloquen el desarrollo y multiplicación de las bacterias, pero no las lisan. Al retirar el antibiótico el efecto es reversible. Antibióticos bactericidas: Provocan la muerte bacteriana. Es un proceso irreversible. CLASIFICACIÓN DE LOS ANTIBIÓTICOS 6 Profesora: Helena Amigo González CFGS LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO MÓDULO: MICROBIOLOGÍA CLÍNICA La clasificación de los antibióticos puede realizarse teniendo en cuenta distintos criterios. La clasificación a partir de su estructura química es la más precisa,pero hay otros criterios de interés, como la zona de actuación: algunos antibióticos actúan de forma local y no pasan a la circulación, por lo que sus efectos se limitan a la zona de aplicación. Otros en cambio pasan al torrente sanguíneo y circulan por todo el organismo (antibióticos sistémicos). Otro criterio importante es el espectro de bacterias a que va dirigido un antibiótico. Según el espectro de bacterias a que va dirigido un antibiótico se distingue entre: 1. Antibióticos de amplio espectro, como el cloranfenicol o las tetraciclinas. Son aquellos que actúan sobre un gran número de bacterias distintas. 2. Antibióticos de espectro medio, como las penicilinas y los macrólidos (Eritromicina). Son aquellos que actúan sobre un tipo limitado de bacterias. 3. Antibióticos de corto espectro, como las polimixinas. Son aquellos que actúan sobre un solo tipo de bacterias, o sobre un número muy reducido de ellas CARACTERÍSTICAS DE LOS ANTIBIÓTICOS Se podría pensar que, ante cualquier infección, un antibiótico de amplio espectro es una buena opción de tratamiento, pero no es tan sencillo. Que un antibiótico sea de amplio espectro no significa que sea eficaz frente a cualquier bacteria. El uso generalizado de un antibiótico hace que las bacterias creen resistencia contra él, lo cual lo hace cada vez menos efectivo. En cuanto a la relación antibiótico-bacteria, en el triángulo de Davis se destacan dos conceptos: La sensibilidad: cuando una bacteria es sensible a un antibiótico, ello significa que este es eficaz contra ella. La resistencia: cuando una bacteria es resistente a un antibiótico, ello significa que este no es eficaz contra ella. 3.2 LA RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS La OMS establece que para considerar que una bacteria es resistente a un antibiótico previamente debe haber sido vulnerable a él. La aparición de cepas resistentes es un fenómeno que ocurre de forma natural, pero es importante tener en cuenta que el uso indebido de antibióticos acelera este proceso y propicia su propagación. 7 Profesora: Helena Amigo González CFGS LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO MÓDULO: MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Los mecanismos de resistencia son fundamentalmente: - Inactivación enzimática del antibiótico: la bacteria sintetiza enzimas que inactivan al antibiótico. Las más importantes son las betalactamasas, que muchas bacterias son capaces de producir. - Alteraciones en las barreras de permeabilidad: existen distintos mecanismos que pueden impedir o limitar la entrada del antibiótico en la célula bacteriana. - Alteración de la diana: cada antibiótico tiene una diana determinada en la célula bacteriana. Algunos mecanismos de resistencia se basan en alterar la diana, lo cual evita que el antibiótico se pueda unir a ella y actuar. Hay que tener en cuenta, además, que una misma bacteria puede desarrollar varios mecanismos de resistencia distintos frente a uno o varios antibióticos, lo cual complica el estudio de las resistencias. Cuando una bacteria se muestra resistente a dos o más antibióticos, hablamos de MULTIRRESISTENCIA. 3.3 EL ANTIBIOGRAMA Dada la problemática actual con la resistencia a antibióticos, las pruebas de sensibilidad antimicrobiana (AST) adquieren una gran importancia. Permiten establecer ante qué antibiótico es sensible la cepa bacteriana concreta que está presente en una infección. Racionalizan el uso de antibióticos, dirigiendo la prescripción hacia el más conveniente en cada situación. El ANTIBIOGRAMA es el procedimiento microbiológico que permite determinar la sensibilidad o resistencia de una cepa bacteriana frente a un grupo de antibióticos. La sensibilidad de una bacteria a un antibiótico se evalúa determinando la concentración mínima inhibidora. La CMI es la cantidad mínima de antibiótico que, en condiciones normalizadas, es capaz de impedir el crecimiento de una bacteria determinada. A partir de la CMI se determina que, frente a antibiótico testado, la cepa es: S: La cepa es sensible al antibiótico. En la dosis habitual, el antibiótico es una buena opción terapéutica. R: La cepa es resistente al antibiótico. Ese antibiótico no será efectivo como tratamiento a la infección. 8 Profesora: Helena Amigo González CFGS LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO MÓDULO: MICROBIOLOGÍA CLÍNICA I: La cepa es de sensibilidad intermedia al antibiótico. El antibiótico tiene un cierto efecto, pero no suficiente. 3.3.1TÉCNICAS PARA CALCULAR EL CMI 1) Técnica de difusión Se aplica generalmente utilizando discos impregnados con antibiótico, aunque también existen en forma de tiras. El medio habitual para estas técnicas es el agar Mueller-Hinton /M-H sangre en placa, ajustado a un pH de entre 7,2 y 7,4. La correcta preparación de las placas es imprescindible para obtener resultados fiables. Las técnicas de difusión no son aplicables a microorganismos de crecimiento lento ni a anaerobios, porque necesitan tiempos de incubación prolongados. Tampoco se aplica con antibióticos que difunden lentamente por el agar. a) Prueba con discos Se utilizan discos o multidiscos de papel de filtro impregnados con una cantidad específica del antibiótico, que se aplican sobre la superficie del medio una vez inoculado con el microorganismo. PROCEDIMIENTO 1) Coger de 3 a 5 colonias iguales de la placa de cultivo e introducirlas en 5ml de suero estéril hasta alcanzar una turbidez de 0,5 (MacFarland). 2) Sumergir un hisopo de algodón e inocular las placas de Mueller-Hinton y al retirarlo rotar varias veces contra la pared del tubo por encima del nivel del líquido para eliminar el exceso de inóculo. 3) Inocular las placas de Mueller-Hinton (MH o MHS), deslizando el escobillón por la superficie del agar tres veces, rotando la placa unos 60º cada vez y pasándola por último por la periferia del agar para conseguir una siembra uniforme. Dejar secar de 3 a 5 minutos antes de depositar los discos. 4) Con unas pinzas estériles, colocar el disco con el antibiótico sobre la placa. Esperar 15 minutos para que el antibiótico difunda en el gel.Para asegurarse que contacten perfectamente con la superficie del agar, presionar ligeramente sobre la superficie del agar. No deben situarse a menos de 15 mm del borde de la placa, y han de estar distribuidos de forma que no se produzca superposición de los halos de inhibición. 5) Incubar las placas invertidas (agar en la parte superior), en grupos no superiores a 5 placas, a 35°C en atmósfera aeróbica antes de que transcurran 15 minutos. 6) Incubar 18-24 horas a 35ºC. 9 Profesora: Helena Amigo González CFGS LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO MÓDULO: MICROBIOLOGÍA CLÍNICA 7) Leer el diámetro de las zonas de completa inhibición con un pie de rey o regla. Los halos de los medios transparentes se miden sobre el reverso de la placa y los medios que contienen sangre sobre la superficie del agar. b) Prueba con tiras de gradiente de CMI (Etest) Se trata de un gradiente estable predefinido de 15 concentraciones de antibióticos sobre una tira de plástico, que lleva impresa una escala de valores de CMI (en µg/ml). PROCEDIMIENTO 1.Realizar una suspensión 0.5 McFarland con la cepa problema, partiendo de cultivo puro, en una placa de MH o MHS según proceda. 2. Dejar secar entre 5-10 minutos. 3. Coger con una pinza limpia una tira de Etest por uno de sus extremos y dejar caer sobre el agar. La tira NO DEBE MOVERSE. No se puede recolocar la tira una vez ha entrado en contacto con el agar. La difusión del antibiótico es inmediata. 4. Incubar en función del microorganismo estudiado. Leer el resultado CMI en la parte inferior de la elipse de inhibición. 2) MÉTODO BLEE Las β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) son enzimas que fenotípicamente se caracterizan por conferir resistencia a penicilinas y cefalosporinas, incluyendo las de tercera y cuarta generación. Las cepas que producen BLEE, en su mayoría enterobacterias, y en particular Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli, son resistentes a todos los antibióticos β-lactámicos con alguna excepción. La detección de estas cepas resistentes se realiza mediante la utilización de inhibidores de b- lactamasas mediante el método conocido como MÉTODO SINERGÍA DOBLE DISCO. La técnica consiste en inocular una suspensión 0.5 McFarland de la cepa problema en una placa de MH para antibiograma (como un antibiograma habitual) y a continuación disponer en forma de cruz 5 discos, situando en el medio el de AMC (amoxicilina/ácido clavulánico), y dejando una distancia de 1.5 cm de borde a borde del disco (entre 2- 2.5 cm de centro a centro). La separación puede variar en función de la cepa. 10 Profesora: Helena Amigo González CFGS LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO MÓDULO: MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Resultados: POSITIVO: Se observa sinergia (zonas fantasmas) entre la actividad de la cefalosporina y el ácido clavulánico (imagen A), o distorsión del halo ampliando hacia el disco de AMC (imagen B) Imagen A Imagen B NEGATIVO: No sinergia, no distorsión de halo. Las limitaciones de la doble difusión con discos dependen de la pericia en la realización de la prueba (disposición de los discos) y de la interpretación de la sinergia. Para confirmar la presencia de enzimas BLEE se realiza también tiras E-test con la combinación en la misma tira del ácido clavulánico con otros antibióticos como cefotaxima o cefepime. En este caso los resultado se interpretan como positivos si hay reducción de la CMI 3 ó más diluciones dobles en presencia del clavulánico (primer etest) o presencia de zona fantasma y deformación del halo (segundo etest). NEGATIVO: Diferencia menor a 3 diluciones dobles. No presencia de sinergias o deformaciones. 3) TÉCNICAS DE DILUCIÓN 11 Profesora: Helena Amigo González CFGS LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO MÓDULO: MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Se basan en la preparación de una serie de tubos o pocillos con antibiótico en distintas concentraciones. Luego se inocula cada dilución con una suspensión estandarizada de la bacteria y se incuban durante 24 horas a 35º C. MACRODILUCIÓN Se realiza en tubos, preparando un banco de diluciones para cada antibiótico en estudio y añadiendo a cada uno un mismo volumen de la suspensión bacteriana. La interpretación del crecimiento bacteriano se realiza de forma visual. MICRODILUCIÓN La prueba se realiza en microplacas con pocillos con el fondo cónico o redondo. El principio es el mismo que la macrodilución, pero con un volumen de dilución de antibiótico y de suspensión bacteriana mucho menor en su pocillo. La lectura se realiza en este caso por medio de un autoanalizador (medición por turbidimetría o fluorometría). 4) MÉTODOS AUTOMÁTICOS La mayoría de estos métodos utilizan sistemas de microdilución en medio líquido sobre microplacas e interpretan el crecimiento bacteriano en los diferentes pocillos por medio de un autoanalizador. Utilizan puntos de corte o diluciones en concentraciones específicas que permiten diferenciar entre las categorías de interpretación. 12 Profesora: Helena Amigo González