UT 5: Urocultivo, coprocultivo PDF

UT 5: Urocultivo, coprocultivo, esputo y hemocultivo Introducción a las muestras biológicas usadas en microbiología. En microbiología clínica, se estudian muestras biológicas siguiendo normas de conservación y transporte. El tipo de muestra y la enfermedad guían el análisis, ya que en cada una pue...

UT 5: Urocultivo, coprocultivo, esputo y hemocultivo Introducción a las muestras biológicas usadas en microbiología. En microbiología clínica, se estudian muestras biológicas siguiendo normas de conservación y transporte. El tipo de muestra y la enfermedad guían el análisis, ya que en cada una pueden encontrarse distintos microorganismos. En general, para identificar al agente patógeno causante de la infección se hace lo siguiente: ​ Observación macroscópica. ​ Observación microscópica: tinción de Gram,... ​ Siembra en medios de cultivo según los tipos de bacterias esperadas ​ Pruebas bioquímicas y cultivos adicionales, si son necesarios. ​ Antibiograma. Urocultivos. Es el cultivo de una muestra de orina para identificar microorganismos. Puede ser cualitativo o cuantitativo. El tracto urinario es estéril, excepto el tercio final de la uretra. Las infecciones urinarias son más comunes en mujeres por su uretra corta y cercana al ano. Factores como actividad sexual, embarazo y menopausia aumentan el riesgo. Un 20% de las mujeres tendrá al menos una infección urinaria en su vida, con mayor incidencia en edades avanzadas. La solicitud de urocultivos se realiza para diagnosticar infecciones urinarias. Los microorganismos que con más frecuencia nos podemos encontrar son: ​ Enterobacterias (bacilos gram -): E. coli, Klebsiella spp, Enterobacter spp, Serratia spp y Proteus spp. ​ BNNF (bacilos gram - no fermentadores): Pseudomonas spp y Acinetobacter spp. ​ Cocos gram +: Enterococus spp, Staphylococus spp y, en el caso de las mujeres embarazadas, estreptococos del grupo B. ​ Hongos: Candida spp. Se siembra la orina en medios de cultivo y se cuentan las colonias, expresando el resultado en UFC/ml. Para saber si hay infección, se evalúa si hay bacteriuria o no según la cantidad de bacterias teniendo en cuenta que es una muestra que se contamina fácilmente por ello el encontrar microorganismo no es indicativo siempre de bacterias. Se usa el medio CLED y asas calibradas (0,01 o 0,001 ml). La orina debe mezclarse suavemente antes de tomar la muestra. Luego, se incuba a 37°C por 24 horas y se analiza el crecimiento bacteriano según criterios específicos. Criterio clásico: ​ Recuento mayor o igual a 100.000 UFC/ml → Infección ​ Recuento entre 10.000 y 100.000 UFC/ml → Dudoso (repetir el análisis) ​ Recuento menor o igual a 10.000 UFC/ml → Probable contaminación Criterio actual: Gram - (enterobacterias): Se sigue el criterio clásico. Gram +: Se considera infección si el recuento está entre 10.000 y 100.000 UFC/ml en cultivo puro. Candida: Más de 1.000 UFC/ml indica infección. Excepciones: ​ Misma bacteria en varias muestras con 10.000 UFC/ml es significativa. ​ S. aureus en cultivo puro es significativo sin importar la cantidad. ​ En niños, pacientes con sonda, en tratamiento antibiótico, con alta ingesta de líquidos o con obstrucción urinaria, cualquier recuento ≤100.000 UFC/ml puede ser relevante. Procesamiento de la muestra para urocultivo. Toma de la muestra. Para obtener resultados fiables, es clave recoger y conservar bien la orina: ​ Mujeres: Separar los labios vaginales para evitar contacto con genitales. ​ Hombres: Retraer el prepucio antes de orinar. ​ Recoger la micción media en un bote estéril, evitando contaminación. ​ Si no se analiza de inmediato, conservar en nevera (2-8°C) por máximo 2 días. Observación aspecto macroscópico. La orina normal es clara y amarilla. La turbidez puede indicar infección o cristales de fosfatos. Observación al microscopio. Examen del sedimento en fresco al microscopio: Se centrifugan 5 min 10 ml de orina, se descarta el sobrenadante y se examina el sedimento al microscopio entre porta y cubre.  ​ Leucocitos: Más de 10 por campo (40x) sugiere infección, pero no siempre es exacto, lo normal es 1-3 ​ Células epiteliales: Indican posible contaminación de la muestra. Tinción de Gram. Siembra de la muestra en medios de cultivo: urocultivo. El urocultivo puede realizarse con unos sistemas de cultivo comercializados en una especie de kit o sembrándolos en distintos medios de cultivo. Sistemas comercializados para el urocultivo: Los laboratorios venden kits con lengüetas que tienen CLED (para todos los microorganismos) en un lado y MacConkey (para bacterias Gram -) en el otro. Para hacer el urocultivo, se introduce la lengüeta en la orina, se escurre el exceso y se incuban. Luego, el recuento se hace comparando con una escala de colores que incluye el fabricante. Estos sistemas incluyen siempre: ​ MEDIO GENERAL: como el CLED donde crecen todos los microorganismos para ver si la bacteriuria es significativa o no ​ MEDIO SELECTIVO: MacConkey: Solo crecen bacterias Gram -. ​ Otros medios especiales como agar cetrimida (Pseudomonas), Chapman (Staphylococos), Sabouraud-cloranfenicol (Candidas). Siembra en distintos medios: si no se tiene un sistema comercial preparado, se siembra la orina con un asa calibrada en un medio CLED para ver si la bacteriuria es significativa. Se siembran dos placas, se incuban a 37°C y al día siguiente se cuenta el número de colonias en UFC/ml. Si la bacteriuria es significativa, se siembra la muestra en otros medios: ​ Agar MacConkey: Para bacterias Gram -. Incubando a 37º 24h ​ Si se sospecha de un microorganismo específico, se siembra en medios como cetrimide (para Pseudomonas) o Sabouraud-cloranfenicol (para Candida). Pruebas bioquímicas. Si hay crecimiento solo en CLED, indica que los microorganismos son Gram +. ​ Staphylococcus y Streptococcus se diferencian con la prueba de catalasa: positiva para Staphylococcus y negativa para Streptococcus. ​ Para diferenciar S. aureus de S. epidermidis y S. saprophyticus, se usa la prueba de coagulasa (positiva para S. aureus). ​ La prueba de hemólisis ayuda a diferenciar especies de Streptococcus. Si hay crecimiento en CLED y MacConkey, los microorganismos son Gram -.  ​ Lo más probable es que sea una enterobacteria. ​ Para confirmar si es Pseudomonas, se hace la prueba de oxidasa (+). ​ Si es oxidasa -, se usa un enterotube para confirmar la bacteria. ​ Si es oxidasa + y crece en Cetrimide, es Pseudomonas. Antibiograma: a los microorganismos aislados, probando los antibióticos adecuados para ver cuál es más efectivo contra ellos. Coprocultivos. Se solicitan coprocultivos para diagnosticar infecciones gástricas o intestinales, causadas por bacterias, virus o parásitos. Las heces de una persona sana tienen una gran cantidad de bacterias normales del intestino. En casos de diarrea, es difícil identificar la causa, por lo que se enfoca el estudio en los patógenos más comunes o en uno sospechoso según los síntomas. Se buscan principalmente las bacterias patógenas que puedan estar presentes en las heces. Las principales bacterias patógenas en heces: ​ Bacilos gram -: enterobacterias (sobre todo Salmonella, Shigella, Yersinia y E. coli). ​ Bacilo gram - exigente: Campylobacter spp. ​ Otros bacilos gram -: Vibrio spp y aeromonas mesófilas. ​ Bacilo gram +: Bacillus cereus. ​ Coco gram +: Staphylococcus aureus. ​ Bacilos gram + anaerobios: Clostridium difficile y Clostridium perfringens. Se buscan bacterias como Bacillus cereus, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus en casos de intoxicaciones alimentarias, y Clostridium difficile en diarreas persistentes. El diagnóstico se facilita si se consideran factores como edad, antecedentes de salud, alimentos, viajes y síntomas. Si la causa es una toxina, la incubación es corta y con poca fiebre. Si es una infección bacteriana, el periodo es más largo y hay fiebre. El coprocultivo detecta el agente en un 60-80% de los casos, por lo que es importante que el médico oriente al laboratorio para simplificar la búsqueda. Procesamiento de la muestra para coprocultivo. Toma de la muestra. Es importante recoger las heces correctamente para obtener resultados fiables. La muestra debe ser tomada de las áreas más significativas (como pus o sangre) y en un bote estéril. Si no se puede procesar de inmediato, se puede guardar en la nevera por hasta 2 días (2-8ºC). Observación aspecto macroscópico. Al recibir la muestra, se debe observar su consistencia, color, olor y si contiene sangre, pus o moco. Estos detalles pueden ayudar en el diagnóstico. Por ejemplo, heces líquidas con grumos como granos de arroz pueden indicar una infección por Vibrio cholerae, y la presencia de sangre y pus sugiere una infección por Shigella. Observación al microscopio. Si las heces son sólidas, se diluyen con suero fisiológico, enfocándose en la parte mucosa y sanguinolenta. Con una tinción de azul de metileno de wright, se observa la flora y la presencia de leucocitos. Si hay leucocitos, sugiere una infección (por ejemplo, Salmonella, Shigella o E. coli). Si no hay leucocitos, puede ser una causa vírica o una intoxicación. La tinción de Gram ayuda a ver el equilibrio entre bacterias Gram + y Gram -, así como la presencia de levaduras. Siembra de la muestra en medios de cultivo: “coprocultivo”. Se toma la parte de las heces con peor aspecto (mucosa y sanguinolenta), donde están los patógenos. Las muestras contaminadas con orina no se procesan. Como las heces contienen muchas bacterias, se usan medios selectivos y de enriquecimiento según el patógeno que se busque, lo que depende de la orientación clínica. En caso de heces sólidas, se diluyen con suero fisiológico estéril. Si son líquidas, no se diluye. Luego se siembra en las placas con un asa, usando técnicas de aislamiento. Si las heces son muy líquidas, se siembran dos placas con el mismo asa. Los medios que podemos emplear: ​ Agar Mac Conkey: para descartar entre Gram + y Gram -. ​ Agar Salmonella Shigella: descarta entre Salmonella y Shigella. Tras 24 h de incubación, observamos las colonias lactosa + (rosa) no interesan. Las colonias lactosa - interesan, tanto las incoloras (Salmonella y Shigella), como las incoloras con el centro negro o negras en su totalidad (Salmonella). ​ Agar Chapman manitol: para Staphylococcus aureus. Crece formando colonias amarillas. ​ Agar agar CIN (Cefsulodina, Irgasan y Novobiocina): para buscar spp de Yersinia. ​ Agar TCBS (tiosulfato, citrato, bilis y sacarosa): para buscar Vibrio en el que las colonias de V. cholerae son amarillas y las de V. parahaemolyticus son verde azuladas. ​ Agar Sabouraud cloranfenicol: para buscar Cándida con colonias abultadas, cremosas y muy blancas. Pruebas bioquímicas. Para diferenciar Salmonella y Shigella, se les hace un Kligler: Salmonella (glucosa +, lactosa - y SH2) y Shigella (glucosa - y lactosa -). También se puede hacer un UMI (urea, movilidad e indol): urea -, indol - y movilidad +, sería sospechoso de Salmonella y urea -, indol -, movilidad - sería sospechoso de Shigella. O se hace un enterotube. Se puede confirmar que se trata de Staphylococcus aureus haciendo la catalasa, coagulasa y DNasa. (es catalasa +, coagulasa + y DNasa +). Se puede confirmar que se trata de Yersinia con oxidasa -, AHK (no coliforme) o un enterotube. Se puede confirmar que se trata de E. coli enteropatógeno con oxidasa -, AHK (coliforme), indol +, Enterotube,... Se puede confirmar que se trata de spp de Vibrio con oxidasa + y catalasa +. Test del collar: a una gota de desoxicolato sódico al 5% se le añade una colonia sospechosa de V. cholerae. Una vez mezclada, se forma una suspensión viscosa que forma un collar al ser levantada con el asa. Antibiogramas. A los microorganismos aislados, se les hará un antibiograma utilizando los antimicrobianos indicados. Hemocultivos. La sangre es estéril, así que la presencia de cualquier microorganismo en ella indica infección. Por ello, el hemocultivo es una técnica importante en el diagnóstico de las septicemias. La septicemia es una situación grave, con frecuencia mortal, por lo que la rapidez en su detección es factor clave en el éxito o fracaso terapéutico. Los microorganismos que se detectan con mayor frecuencia en la sangre son: 1)​ Staphylococcus aureus. 6)​ Pseudomonas aeruginosa. 2)​ Escherichia coli. 7)​ Streptococcus pneumoniae. 3)​ Estafilococos coagulasa negativa. 8)​ Streptococos viridans. 4)​ Klebsiella pneumoniae. 9)​ Streptococcus pyogenes. 5)​ Enterococcus spp. 10)​Candida albicans. Procesamiento de la muestra para hemocultivo. Toma de la muestra y realización del hemocultivo. Para el estudio microbiológico de la sangre, las muestras se deben tomar en condiciones de asepsia y en frascos especiales para hemocultivo, en los que se realiza la recogida e incubación. Estos frascos contienen medio de cultivo y anticoagulante, y una atmósfera interior controlada. Son de vidrio o plástico para que se pueda ver su interior. Frasco aerobio,con volumen del inóculo entre 5 y 10 cm3. Suelen llevar un tapón azul. Frasco anaerobio, con volumen del inóculo de entre 5 y 10 cm3. Suelen llevar un tapón rojo. El momento para la toma de la muestra de sangre depende de: ​ En bacteriemias continuas, cualquier momento es bueno para las tomas. ​ En bacteriemias intermitentes y transitorias, lo ideal es cuando comienza la fiebre. ​ En situaciones de urgencia vital, tomar un set de hemocultivo en cada brazo, antes de instaurar el tratamiento (de inmediato). ​ En pacientes con antibioterapia intermitente, justo antes de la dosis de antibiótico. La muestra para hemocultivo se debe tomar con técnicas asépticas y de diferentes venopunciones, inoculando la sangre rápidamente en frascos anaerobios y aerobios. Normalmente se toman tres muestras con intervalos de al menos una hora entre ellas. Si es urgente, el intervalo puede ser de 15 minutos. Las muestras deben enviarse al laboratorio lo antes posible y se deben conservar a temperatura ambiente o entre 35-37°C. Los frascos se incuban en una estufa especial, y el crecimiento bacteriano suele ocurrir entre 18 y 72 horas, aunque algunas bacterias pueden tardar más. Es importante revisar los cultivos frecuentemente para detectar el crecimiento y comenzar el tratamiento lo más rápido posible. Detección del crecimiento bacteriano. De manera visual. Para detectar el crecimiento bacteriano en hemocultivos, el medio es transparente al principio. Después de la incubación, si se deja reposar verticalmente durante 12 horas, los glóbulos rojos se sedimentan y se observa el sobrenadante. Si hay crecimiento, el sobrenadante se torna turbio o hemolizado; si no hay crecimiento, permanece transparente. La inspección debe hacerse entre 6 y 12 horas después de la incubación y repetirse diariamente. Con sistemas automatizados: Los sistemas automatizados detectan el crecimiento bacteriano midiendo los niveles de CO2, cambios en la turbidez, color, hemólisis o burbujas de gas. Son precisos y pueden detectar el desarrollo microbiano desde las 36 horas de incubación. Algunos sistemas, como el Bactec-9240 y el BacT/Alert 3D, realizan un seguimiento continuo de los frascos y notifican los resultados positivos de inmediato. Tinción y cultivo en medios específicos. Si hay crecimiento en el hemocultivo, se aspiran 3 a 5 ml del contenido y se realiza una tinción de Gram para examinar las bacterias. También se hace un antibiograma preliminar para empezar el tratamiento de inmediato, sin esperar la identificación completa del microorganismo. Es habitual realizar la siembra del líquido aspirado del frasco positivo en distintos medios: ​ En agar sangre, a 35-37 ºC durante 24 horas en atmósfera aerobia. ​ En agar chocolate, a 35-37 ºC durante 24 h en una atmósfera con 5% de CO2. ​ En agar sangre enriquecido, a 35-37 ºC durante 48-72 h en anaerobiosis. Además, se hacen los cultivos adicionales necesarios según los hallazgos al microscopio. Normalmente, sobre todo cuando persista la sintomatología que hace sospechar septicemia, aunque los cultivos primarios no indiquen crecimiento aparente, se deben realizar subcultivos ciegos, que se efectuarán a las 24 horas de incubación para muestras aerobias y 48-72 horas para las anaerobias. Pruebas bioquímicas. Las necesarias en función de la bacteria patógena aislada. Antibiogramas. A los microorganismos aislados, se les hará un antibiograma utilizando los antimicrobianos indicados. Esputo. El esputo es una mezcla de secreciones de las vías respiratorias superiores e inferiores. Puede contaminarse fácilmente con flora de la boca, por lo que se recomienda enjuagarsela antes de la toma. Los microorganismos hallados pueden ser contaminantes, ya que muchos están en las vías respiratorias superiores. El analista debe identificar el germen causante de la infección, ya que en las neumonías bacterianas agudas, el germen suele estar casi en su totalidad en el cultivo. Los microorganismos frecuentes en una muestra de esputo son: ​ Cocos Gram +: ○​ Estaphilococos: S. aureus y S. epidérmidis. ○​ Estreptococos: S. neumoniae y S. pyogenes.  ​ Cocos Gram -: Neisseria meningitidis y Acinetobacter spp. ​ Bacilos Gram +: Mycobacterium tuberculosis y Corynebacterium dipteriae. ​ Bacilos Gram -: Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis y Legionella. ​ Otros: Micoplasma pneumoniae y Hongos (candida, histoplasmas, …). Procesamiento de la muestra de esputo. Toma de la muestra. Se recomienda tomar el primer esputo de la mañana, después de lavarse la boca con solución salina. La muestra debe guardarse en un envase estéril y, si no se envía rápido al laboratorio, conservarse en la nevera a 4ºC por un máximo de dos días. Observación aspecto macroscópico. Pudiendo observarse en la muestra saliva, pus, moco, sangre,... Observación al microscopio. Seguidamente se homogeneiza o se toma la parte más purulenta, y se realiza la observación al microscopio tras una tinción para ver la presencia de leucocitos y de células epiteliales. Una vez aislada la bacteria patógena se hace un Gram o, si se sospecha de una micobacteria, una tinción de Ziehl-Neelsen. También se puede hacer la tinción de auramina que se usa para diagnóstico de micobacterias. Si se confirma la presencia de M. tuberculosis, se pasa a la sección específica para su estudio. Siembra de la muestra en medios de cultivo. La siembra de esputo se hace en campana de flujo laminar tipo 2 para evitar contagio con Mycobacterium tuberculosis. Las siembras se realizan en: ​ Agar MacConkey para los patógenos Gram -. ​ Agar sangre para visualizar microorganismos hemolíticos (Streptococcus). ​ Agar chocolate para visualizar microorganismos anaerobios. ​ Agar Sabouraud cloranfenicol para visualizar hongos. ​ Agar Chapman o Chapman manitol para visualizar estafilococos. Pruebas bioquímicas (las indicadas) y Antibiogramas (con antimicrobianos indicados)