Unidad 5: Técnicas antígeno - anticuerpo II PDF

Unidad 5: Aplicación de técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo primarias (II) Técnicas de inmunodiagnóstico Cu rso 2 02 4 -2 02 5 UNIDAD 05 Aplicación de técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo primarias (II) 1. Variantes de EIA 2. Fluoroinmunoanálisis (FIA) 3....

Unidad 5: Aplicación de técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo primarias (II) Técnicas de inmunodiagnóstico Cu rso 2 02 4 -2 02 5 UNIDAD 05 Aplicación de técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo primarias (II) 1. Variantes de EIA 2. Fluoroinmunoanálisis (FIA) 3. Luminoinmunoanálisis 4. Limitaciones del inmunoanálisis 5. Inmunocromatografía 6. Inmunofluorescencia 7. Técnicas de electrotransferencia  Clasificación de los inmunoanálisis Clasificación Según la necesidad de Según la separar los complejos Según el marcador Ag-Ac para medir la disponibilidad del empleado reacción inmunológica reactivo Homogéneos Heterogéneos Competitivo No competitivo Radioinmunoanálisis Enzimoinmunoanálisis Fluoroinmunoanálisis Lumioinmunoanálisis 1. Variantes de EIA Inmunoanálisis mediado por enzima (EMIT): homogéneo competitivo Inmunoanálisis donador de enzima clonada (CEDIA): homogéneo competitivo Inmunoensayo por micropartícula (MEIA): heterogéneo competitivo o no competitivo EMIT Homogéneo CEDIA EIA ELISA Unidad 4 Heterogéneo MEIA https://www.youtube.com/w atch?v=ERk0hwqhyDw  1.1. EMIT Homogéneo. No requiere la separación de la fracción ligada y la fracción libre. Se marca el Ag. Competitivo: Competición entre un Ag marcado con una enzima y el Ag presente en la muestra problema para unirse al Ac. + señal + muestra si el anticuerpo se une con el antigeno marcado la enzima no cataliza no se da la reacción la enzima detecta el sustrato y cataliza Cuanto más Ag problema, menos cantidad de Ag marcado se unirá al Ac y habrá más señal enzimática. Por tanto, más señal es más cantidad de Ag en la muestra. Monitoreo de fármacos y abuso de drogas a mas señal mas antigeno habra en la muestra 1.2. CEDIA Parte grande galcosidasa y parte pequeña, no se da la reacción añadir sustrato para que se de la reacción Homogéneo. No requiere la separación de la fracción ligada y la fracción libre. Competitivo Se basa en el uso de la β-galactosidasa fraccionada en dos partes inactivas: Una parte aceptora grande Una parte donadora pequeña unida al Ag a determinar La combinación de ambos fragmentos da lugar a la enzima activa. Si el Ac está unido al Ag unido a la parte donadora pequeña impide esa unión. Cuanto más Ag problema, menos cantidad de Ag con la parte donadora se unirá al Ac y habrá más señal enzimática. Por tanto, más señal es más cantidad de Ag en la muestra.  1.3. MEIA ELISA: a mas menos Heterogéneo. separar fracion ligada y libre Puede ser competitivo o no competitivo Los Ac están unidos a una superficie de fase sólida de pequeñas esferas de látex de menos de 0,5 micras de diámetro (micropartículas) y capaces de acelerar la unión del Ag problema. esferas de latex (microparticulas) solida como sopote solido recubiertas de anticuerpos y que se le unan los antigenos La separación entre el Ag libre y el unido se produce en una matriz de fibra de vidrio, que retiene de forma irreversible al segundo. En el no competitivo (Figura) se añade un segundo Ac marcado que se une al Ag unido al Ac de captura de las esferas de látex. Posteriormente se añade el sustrato y se mide la señal. Más señal, más Ag problema. a mas muestra más señal 2. Fluoroinmunoanálisis (FIA) Los FIA se basan en la utilización de compuestos fluorescentes para el marcado del inmunocomplejo. Los compuestos fluorescentes deben tener las siguientes características: Intensidad de fluorescencia elevada Diferenciable de la fluorescencia de fondo de las muestras biológicas Debe permanecer inalterable tras su unión al Ag o al Ac. Fluoroinmunoanálisis de polarización (FPIA) Inmunoanálisis de fluorescencia con Homogéneo sustrato marcado (SLFIA) Inmunoanálisis de transferencia de FIA energía fluorescente (FETI) Fluoroinmunoanálisis de disociación Heterogéneo aumentada por lantánidos (DELFIA) 2.1. FPIA Homogéneo. Competitivo (el antigeno el anticuerpo se encontrara en menor cantidad) Detección de analitos en concentraciones de hasta union antigeno anticuerpo rotacion mas lenta ng/ml: drogas de abuso, hormonas, vitaminas o aminoácidos. Competición entre Ag de la muestra y Ag marcado con fluoresceína para unirse al Ac. Sólo dará señal el Ag marcado con fluoresceína cuando esté unido al Ac. Más señal, menos Ag problema. porque es competitivo por como funciona su inmunoanalisis 2.1. FPIA Generación de la señal: Tres conceptos clave Fluorescencia: tipo de luminiscencia que caracteriza a la sustancias que son capaces de absorber energía en forma de radiación electromagnética y luego emiten parte de esa energía en forma de radiación electromagnética de diferente longitud de onda. La fluoresceína absorbe la energía a 490 nm y la libera a una longitud de onda de 520 nm. Rotación de moléculas de suspensión: las moléculas de mayor tamaño rotan más lentamente que las más pequeñas. Esto nos sirve para diferenciar una partícula pequeña (el Ag marcado con fluoresceína) de una más grande (el Ac unido al Ag marcado con fluoresceína) que rotará más lentamente. Luz polarizada: describe ondas solo en un plano del espacio. Cuando la luz polarizada es absorbida por una molécula pequeña (como el Ag marcado con fluoresceína), esta molécula gira antes de emitir la luz fluorescente, pero cuando el Ag marcado esta unido al Ac la molécula es más grande y girará más lentamente. Como consecuencia estas últimas si emiten luz. Más señal, más Ag marcado con fluoresceína estará unido al Ac y por tanto menos Ag habrá en la muestra problema. 3. Lumioinmunoanálisis Se basan en la utilización de sustancias luminiscentes para el marcado del inmunocomplejo. Uno de los sistemas luminiscentes mejor conocidos es el sistema luciferín-luciferasa presente en la luciérnaga. La enzima luciferasa cataliza la oxidación de luciferina en presencia de ATP y Mg+2 con la emisión de luz a 546 nm. Es más habitual el uso de luminol, isoluminol o derivados de acridina para marcar Ag o Ac. En presencia de compuestos oxidantes, como el peróxido de hidrógeno, el hipoclorito o el oxígeno, tiene lugar la emisión de luz a partir del producto excitado en la reacción de oxidación. oxidan- excita- desprenden Electroquimioluminiscencia Lumioinmunoanálisis Inmunoensayo magnético quimioluminiscente (CMIA) 3. Lumioinmunoanálisis Electroquimioluminiscencia utiliza el marcador de rutenio La emisión de luz tiene lugar como resultado de la oxidación de un compuesto marcador de rutenio en la superficie de un electrodo, en presencia de tripropilamida, para formar especies de rutenio (II) excitadas, las cuales vuelven a su estado basal emitiendo luz a 620 nm. https://youtu.be/z9kgFT_LR7w?si=avwgdogkvOh5dTiy Inmunoensayo magnético quimioluminiscente (CMIA) este se ha robotizado, lo hace la maquina Se emplean micropartículas magnéticas con anticuerpos de captura en su superficie para ligar el Ag a determinar y anticuerpos marcados para el revelado de la reacción, tratándose de un ensayo no competitivo similar a la electroquimioluminiscencia. Otros: https://youtu.be/QVg8OuRkjQs 4. Limitaciones del inmunoanálisis Limitaciones propias de la reacción Ag-Ac: 1. Los inmunoensayos han de ser exactos y precisos: - Exactitud: capacidad de medir la concentración correcta de un analito en una muestra. - Precisión: La combinación de reactivos y otros factores pueden dar resultados reproducibles. - Específico: capaz de generar resultados exactos y reproducibles sin falsos positivos. - Sensible: de forma exacta y reproducible no ocurren falsos negativos. 2. Calibrador: Son soluciones de concentración conocida que establecen la relación entre la señal producida y la concentración del analito. Si la calibración no es correcta, los resultados no serán correctos. Se han de usar en rango normal y patológico. 4. Limitaciones del inmunoanálisis Limitaciones propias de la reacción Ag-Ac: 3. Efecto matriz: Se define como el conjunto de alteraciones ocasionadas por los diversos componentes de la muestra, a excepción del analito a determinar. Cabe destacar los siguientes: - Complemento: Complejo grupo de proteínas que se elevan en procesos inflamatorios y que pueden bloquear el sitio de unión a anticuerpos. - Proteínas de unión endógenas: Por ejemplo, la albúmina, pueden ocasionar alteraciones en las medidas hormonales. - Autoanticuerpos: Ac contra el Ag a cuantificar que interfieren en la inmunoreacción. - Anticuerpos heterófilos: Constituidos por anticuerpos anti-IgG de animales empleados para la obtención de los reactivos del inmunoanálisis, tales como ratón, conejo, oveja, etc. Cabe destacar la interferencia por anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA), cuya incidencia está en ascenso debido al uso de anticuerpos monoclonales de ratón con fines diagnósticos (pruebas de imagen) o terapeúticos (antivirales, antineoplásicos, trombolíticos, etc.). 4. Especificidad del Ac: Falta de especificidad, reacciones cruzadas, o excesiva especificidad. 5. Efecto Hook (gancho): Se produce a veces cuando la concentración de Ag a determinar es elevada y uno o los dos Ac quedan saturados antes de que se forme el Sándwich, induciendo resultados falsamente disminuidos. Cuando se sospecha este efecto, se deben realizar diluciones seriadas dentro del intervalo de equivalencia. si se da este efecto lo que hay que hacer es diluir. 5. Inmunocromatografía La inmunocromatografía es una técnica muy sencilla para la detección de sustancias de carácter antigénico. Ejemplo: detección del Covid-19. Se puede usar con todo tipo de muestras. La muestra se diluye con un tampón de extracción que aumenta la fluidez de la muestra y facilita su recorrido a través de la membrana. Soporte: Tira de nitrocelulosa que suele ir dentro de una carcasa ej: test rapido de covid 5. Inmunocromatografía negativo positivo 3. Parte final, alejada del depósito de la muestra: Ac de cabra anti- Ac de conejo. 2. Parte media de la tira: se encuentran Ac frente al mismo Ag buscado fijados en la membrana. 1. Área cercana al lugar donde se deposita la muestra: Ac de conejo contra el Ag buscado. Estos Ac están marcados con una partícula de oro coloidal o látex (Ac*) siempre se necesita una banda de control positivo y negativo 5. Inmunocromatografía Si la muestra contiene los Ag, estos reaccionaran con los Ac libres marcados dando lugar a con¡mplejos Ag-Ac*. Estos complejos migran por capilaridad a través de la membrana y se encuentran con los Ac fijados en la parte media no marcados. Se forma un complejo Ac-Ag-Ac* visible como banda coloreada. Los Ac marcados libres (Ac*) siguen migrando por la membrana ya que están en exceso y se encuentran con la zona anti IgG de conejo, dando lugar a otra banda, que sirve de control. Si no hay Ag, el resultado será negativo en la primera banda, pero positivo para la banda control. 6. Inmunofluorescencia La técnica de inmunofluorescencia se basa en la búsqueda de antígenos en el suero o tejidos del paciente mediante su reacción con un anticuerpo marcado con fluorescencia. este permite detectar otras estructuras celulares, utiliza Ag Ac, usa fluorocromos para poder observar El Ac se une al fluorocromo, una molécula capaz de absorber energía a una longitud de onda característica entre 20-400 nm (región UV) y la emite a una longitud de onda del espectro visible (400-700 nm). La unión del fluorocromo no debe alterar la actividad inmunológica del anticuerpo. Los fluorocromos más utilizados son el isoticianato de fluoresceína (FITC) con fluorescencia verde y el la rodamina con fluorescencia de color rojo-anaranjado. El FITC es más utilizado porque la sensibilidad del ojo humano es mayor por el color verde y produce menos falsos positivos por autofluorescencia natural. 6. Inmunofluorescencia Positivas para el Ag Negativas para el Ag Se pueden marcar varios Ac que detecten Ag diferentes siempre y cuando el fluorocromo absorba y emita fluorescencia a longitudes de onda diferentes 6. Inmunofluorescencia  6. Inmunofluorescencia Inmunofluorescencia directa (IFD) Inmunofluorescencia indirecta (IFI) Se marca con fluorescencia el Ac monoclonal La reacción se realiza en dos etapas: específico contra el Ag. 1. Reacción del Ac específico sin marcar con el Ag de la muestra. Después de eliminar el Ac no unido se hace la 2. Se añade Ac secundario marcado con un lectura. fluorocromo. Más rápida y menos sensible a interferencias debidas a la reactividad cruzada de Ac que la IFI Es más barato marcar los Ac secundarios que los específicos contra el Ag (monoclonales), por lo que es más barata que IFD se une directamente al antigeno marcado 6.1. Microscopio de fluorescencia Para las técnicas de inmunofluorescencia se necesita siempre un microscopio de fluorescencia para realizar el análisis de los resultados. Característica: Sistema de iluminación especial y una fuente de luz en la región del espectro correspondiente al máximo de absorción de los fluorocromos utilizados. El microscopio que se utiliza habitualmente es el de tipo incidente o epi-iluminación: La luz de excitación entra en ángulo recto en el tubo del microscopio, se refleja en un espejo dicroico (que actúa como filtro de interferencias e incide sobre la muestra. La luz emitida por la muestra pasa a través de un espejo dicroico y del ocular. La muestra se debe congelar (para evitar la inactivación de los Ag) y se recubre con glicerina para evitar la disminución de la emisión de fluorescencia. 6.2. Aplicaciones de la inmunofluorescencia Campo de aplicación muy amplio. Permite el diagnóstico rápido de infecciones microbianas al localizar el agente causal en un determinado tejido o célula. Útil en enfermedades víricas: Los virus no se pueden observar al microscopio por su tamaño, pero al replicarse dan lugar a gran cantidad de proteínas que se emplearán para formar estructuras. Podemos detectar estas proteínas con Ac marcados con fluorocromos. Localización y/o marcaje de hormonas y enzimas: IFD: Técnica rápida y sencilla, pero de elevado coste por el uso de Ac monoclonales marcados. Se utiliza para el diagnóstico microbiológico, es decir, para ver si está un determinado microorganismo en la muestra del paciente. También para la detección de antígenos de diferenciación leucocitaria (CD) y antígenos de histocompatibilidad (HLA). IFI: Utilizada en citoquímica e histoquímica. Se utiliza para el diagnóstico microbiológico. También para la detección de Ac en pacientes con trastornos autoinmunes. 7. Técnicas de electrotransferencia La electrotransferencia o inmunoblot es una herramienta muy utilizada tanto en diagnóstico como en investigación. Combinación de tres técnicas 1. Separación mediante electroforesis de los componentes de la muestra, por ejemplo, proteínas. 2. Electrotransferencia 3. Identificación mediante enzimoinmunoensayo con Ac conocidos La ventaja es la inmovilización del antígeno separado electroforéticamente para evitar su difusión y hacerlo accesible para su identificación. anclar en base solida gracias a esta tecnica Existen varios tipos de técnicas dependiendo de la finalidad de la transferencia: Transferencia de ADN: Sothern Blot Transferencia de ARN Northern Blot Transferencia de proteínas: Western Blot  7. Técnicas de electrotransferencia El proceso se desarrolla en 6 pasos: 1. Solubilización del antígeno 2. Preparación del gel de poliacrilamida 3. Electroforesis vertical de la muestra 4. Electrotransferencia del Ag a un soporte de membrana 5. Bloqueo de los sitios de unión de proteínas libres en la membrana 6. EIA, RIA o QIA para identificar bandas antigénicas e interpretación de resultados 7. Técnicas de electrotransferencia 1. Solubilización del antígeno Sirve para conseguir su ruptura en componentes polipeptídicos de diferentes pesos moleculares. Estos polipéptidos contienen los epítopos del Ag y se mantiene su antigenicidad. Se reparten las cargas negativas de manera uniforme para que la separación electroforética se produzca únicamente por el peso molecular de cada péptido. Las condiciones varían desde 2 minutos a 100°C hasta 30 minutos a 25 °C. Ruptura, se tiene que se`parar por el peso que presenten Se degradan las proteinas, se añaden los peptidos 7. Técnicas de electrotransferencia 2. Preparación del gel de poliacrilamida El gel de poliacrilamida es una copolimerización de acrilamida y bisacrilamida. Esta última forma enlaces cruzados o crosslink. En el gel se definen dos parámetros: Reticulado (%T): la concentración total de monómeros. Dureza (%C): cantidad de bisacrilamida en el total de los monómeros. gel piliacrilamida +acrilamida - Los geles se pueden elaborar de forma continua, es decir que la concentración de acrilamida es la misma en todo el gel, o como un sistema discontinuo en el que hay dos concentraciones diferentes a lo largo del gel, lo que permite una mejor separación de los componentes y, por tanto, es el más utilizado. 7. Técnicas de electrotransferencia 3. Electroforesis vertical de la muestra Esta técnica se denomina PAGE (Polyacrilamide Gel Electrophoresis). Una vez preparado el gel en la cubeta, se realizan unos pocillos donde se colocan las muestras y los controles mezclados con un colorante que permite visualizar la migración y un compuesto que aporta densidad para facilitar la carga de los pocillos (tampón de carga). La cubeta de electroforesis se llena con el tampón adecuado y se pone en funcionamiento hasta que el colorante llegue al final del gel. 7. Técnicas de electrotransferencia 4. Electrotransferencia del Ag a un soporte de membrana (transferir) Membranas inmovilizantes: Puede ser de dos tipos: hidrofóbicas (nitrocelulosa) o iónicas. La nitrocelulosa fue el primer material utilizado y sigue siendo el más utilizado. Gran capacidad para fijar proteínas y los sitios de unión libres se pueden bloquear fácilmente. Debe manejarse con cuidado una vez se seca porque es muy quebradiza. Las membranas iónicas tienen igualmente gran capacidad de unión de proteínas, sin embargo, el bloqueo de los sitios de unión es más difícil. Electrotransferencia o electroblotting: Se usa para transferir las proteínas a una membrana (generalmente de nitrocelulosa) después de la electroforesis en gel. La secuencia en el cassete de transferencia es la siguiente (desde el cátodo (-) al ánodo (+)): 1. Esponja 2. Papel de filtro 3. Gel de electroforesis 4. Membrana 5. Papel de filtro 6. Esponja Se deja que fluya la corriente desde el cátodo al ánodo. 7. Técnicas de electrotransferencia 5. Bloqueo de los sitios de unión de proteínas libres en la membrana Sirve para evitar la fijación inespecífica de los Ac. Se incuba la membrana con una solución de proteínas (generalmente albúmina de suero bovino, BSA) con una pequeña fracción de detergente como Tween-20. Las proteínas ocupan los sitios de la membrana que no estén ocupados por las transferidas desde el gel. 7. Técnicas de electrotransferencia 6. EIA, RIA o QIA para identificar bandas antigénicas e interpretación de resultados Se incuba la membrana con el primer Ac (que puede ser comercial o los Ac de un paciente). Posteriormente se realiza un EIA, RIA o alguna otra técnica como la fluorescencia. En el EIA, después de la incubación con el primer Ac, se incuba con un segundo Ac contra el Ac primario marcado con peroxidasa de rábano (HRP). Al añadir un sustrato, este cambia de color al entrar en contacto con la HRP. En el RIA se incuba con sondas radioactivas. Este método es más caro, lento y conlleva unas complicaciones por el uso de sustancias radioactivas. También se puede marcar el segundo Ac con fluorocromos. Para detectar el Ac primario también se puede utilizar la técnica Golden Blot que emplea proteína A unida a partículas de oro, observándose manchas rojas en la zona de unión Ag-Ac. Interpretación de resultados: Técnica cualitativa. Las bandas visualizadas corresponden a distintas proteínas en función de los distintos pesos moleculares. Se deben tener en cuenta reacciones cruzadas de microorganismos que comparten determinantes antigénicos. 7. Técnicas de electrotransferencia El Western Blot es muy utilizado como prueba de confirmación en pacientes con resultado positivo en alguna prueba de detección primaria, por ejemplo, frente al VIH. Actividades para el portfolio 1. ¿Verdadero o falso? 1. La precipitación inmunológica consiste en la inmovilización del anticuerpo en un soporte sólido. 2. El RIA clásico es un tipo de método radioinmunológico heterogéneo no competitivo. 3. En el radioinmunoensayo, se utilizan isótopos radioactivos para marcar las moléculas. 4. El complejo Ac-Ag-Ac se produce en el IRMA competitivo. 5. El enzimoinmunoanálisis utiliza para marcar las moléculas, enzimas que al unirse al sustrato dan un compuesto coloreado. 6. La técnica ELISA que marca los antígenos se denomina ELISA directo. 7. El EMIT es un enzimoinmunoanálisis de tipo homogéneo competitivo. 8. En el FIA las moléculas se marcan con compuestos fluorescentes. 9. En el FIA uno de los sistemas luminiscentes mejor conocidos es el sistema luciferín-luciferasa. 10. De un EIA se dice que es específico cuando es capaz de general resultados exactos y reproducibles sin falsos positivos. 2. Explica brevemente las limitaciones de los inmunoanálisis propias de las reacciones Ag-Ac. Actividades para el portfolio 3. Qué es y cómo funciona la inmunocromatografía. 4. ¿Qué diferencias hay entre la IFD y la IFI y cuáles son las ventajas de cada una? 5. ¿Qué tres técnicas combina el Western Blot? 6. ¿En base a qué se separan las proteínas en la electroforesis del Western Blot? 7. ¿Por qué la parte del gel de poliacrilamida denominada ‘gel separador’ tiene una menor concentración de acrilamida que la parte inicial? 8. ¿Por qué se bloquean los sitios libres de unión de la membrana de nitrocelulosa en el Western Blot? ¡Gracias!