Tema 2: Historia Clínica Infectológica - PDF

Medalternativa TEMA 2: HISTORIA CLÍNICA INFECTOLÓGICA. Santiago Tolosa Álvarez Gregorio Marañón fue un médico internista muy famoso, fundador de la sociedad española de medicina interna junto con el doctor Jiménez Díaz. Cuando al terminar...

Medalternativa TEMA 2: HISTORIA CLÍNICA INFECTOLÓGICA. Santiago Tolosa Álvarez Gregorio Marañón fue un médico internista muy famoso, fundador de la sociedad española de medicina interna junto con el doctor Jiménez Díaz. Cuando al terminar su carrera médica le preguntaron cuál creía que fue la innovación más importante de los últimos años, él respondió “la silla”, alegó que es una herramienta que nos permite sentarnos al lado del paciente, escucharlo y explorarlo. Desde la medicina del doctor Marañón hasta la medicina que ejercemos hoy y a la del futuro, existe un gran paso hacia una medicina digitalizada y donde priman las nuevas tecnologías. Sin embargo, desde la silla del doctor Marañón hasta la medicina actual y lo que se prevé que sea la medicina del futuro, no hay que olvidar la HISTORIA CLÍNICA. La historia clínica supone el primer encuentro del médico con el paciente. La forma de hacer una historia clínica va desde una exploración a través de una anamnesis corta o una aproximación a una historia clínica en una consulta telefónica. La importancia de la historia clínica en la patología infecciosa es que nos supone una aproximación clínica a conocer un poco más sobre las infecciones. La historia clínica debe de estar compuesta por las siguientes partes: la anamnesis, la exploración física, las pruebas complementarias y con ello llegaremos a un diagnóstico para poner un tratamiento bien dirigido o bien empírico. 1. ANAMNESIS En cuanto a la anamnesis habrá que preguntar sobre las alergias medicamentosas, sobre los antecedentes personales y familiares, es decir, sobre las enfermedades que tenga el paciente y las más importantes en su familia (de padres, hermanos, motivos de algún fallecimiento). Además, preguntar por factores de riesgo cardiovascular, la diabetes, la HTA, la dislipemia, la obesidad, los hábitos tóxicos, las intervenciones quirúrgicas, la situación vital y el soporte socio familiar. Una vez con la información previa hay que indagar hacia el motivo de la consulta, qué le pasa, preguntar por los síntomas que han aparecido, cuándo y sobre todo de qué fenómenos se acompañan. Una vez con todos estos síntomas nos tenemos que quedar con un síntoma guía que nos pueda orientar en el diagnóstico diferencial y principalmente en las enfermedades infecciosas el síntoma guía es FIEBRE. Además, tenemos que conocer la epidemiología, es decir, todo aquel entorno que rodea a los síntomas guías que comenta el paciente. Con una simple anamnesis le daremos respuesta a las tres principales preguntas: - Qué le pasa - Desde cuándo - A qué se puede atribuir 1  Medalternativa Una vez con esa información, pediremos un estudio con pruebas complementarias dependiendo de nuestra sospecha. En cuanto a la EPIDEMIOLOGÍA (IMPORTANTE): tenemos que conocer tanto las enfermedades crónicas que tiene el paciente como aquellos procesos agudos recientes. Hay que tener cuenta: Medicación previa y actual que pueda estar relacionada. Existencia de otros casos similares en el entorno. Profesión, viajes al extranjero, correcta vacunación, hábitos dietéticos y los tóxicos. La ingesta de productos sin control sanitario (como agua de pozos, conservas caseras, alimentos de huerto, carnes de matanza). Hábito y conducta sexual (en caso de sospecha de enfermedad de transmisión sexual). Contacto con animales domésticos, silvestres, naturaleza o mundo rural → en el caso de que sospechemos de una zoonosis. Es importante conocer la epidemiología porque estos factores de riesgo pueden marcar el pronóstico de muchas enfermedades. Por ejemplo, la mayoría habrá pasado la COVID-19 de una manera leve y donde tan solo se habrá requerido tratamiento sintomático, y simplemente con presentar estas comorbilidades: patología cardiovascular, la diabetes, la HTA, la obesidad, y EPOC → ensombrece y empeora el pronóstico de los pacientes. Por tanto, a medida que aparecen factores de riesgo y factores de riesgo priorizados al igual de otros inconvenientes que vayan apareciendo durante el ingreso, el algoritmo de tratamiento se va complicando donde aparecen nuevos fármacos y protocolos. De este modo, hay que resaltar que la aparición de estos factores de riesgo y comorbilidades, es lo que va a marcar nuestra actitud terapéutica. En resumen: conocer los antecedentes, los factores de riesgo y detectar factores de riesgo priorizados; nos va a ayudar a marcar nuestra actitud terapéutica Por ejemplo: no es lo mismo una infección que se produzca dentro de un mismo hospital, donde tendremos que pensar en gérmenes nosocomiales o de una infección de un paciente que venga de la calle, donde pensaremos en gérmenes comunitarios. Al igual no es lo mismo un paciente inmunocompetente que uno inmunodeprimido por un trasplante o por el uso de inmunosupresores. 2. EXPLORACIÓN CLÍNICA En cuanto a la exploración física tenemos que prestar atención al estado general, exploración neurológica, cardiopulmonar, abdominal, genitourinaria; pero en el caso de enfermedades infecciosas hay que destapar al enfermo, darle una mayor importancia a la exploración cutánea, a la palpación de adenopatías y a revisar vías venosas. Exploración neurológica: lo primero que hay que revisar es el estado de alerta, es decir, si está estuporoso, vigil, somnoliento, si está orientado. También revisar los pares craneales (de la sensibilidad y fuerza en los miembros), la coordinación, las simetrías, fuerza, marcha y el equilibrio. Además, si tenemos sospechas de proceso infeccioso a nivel del sistema nervioso central hay que pensar en los SIGNOS MENÍNGEOS. 2  Medalternativa Los principales signos meníngeos son la rigidez de nuca (si intentamos flexionar la cabeza, el paciente flexiona cabeza y tronco en un mismo bloque), signo de Kernig (conforme elevamos la pierna de forma extendida, el paciente la flexiona de manera refleja) y el signo de Brudzinski (al levantar la cabeza, es decir, al doblar la nuca se dobla las rodillas de manera refleja). Exploración pulmonar: revisaremos si hay ruidos respiratorios como roncus, sibilancias, de ruidos de secreciones de vías altas → lo que nos haría sospechar de un proceso infeccioso a nivel pulmonar como una infección respiratoria o bien una neumonía. En el caso de presentar estridor nos llevaría a pensar patología de vía aérea superior como tráquea o laringe. Exploración cardiaca: en el caso de un paciente con fiebre, o de un soplo de nueva aparición, podemos sospechar de endocarditis. Una endocarditis es una infección en la que se produce una vegetación, es decir, como una verruga microorganismos normalmente bacterianos (aunque también pueden ser por hongos), que destruye todo el aparato valvular. Al igual que presentar roce pericárdico nos haría sospechar de una pericarditis. 3  Medalternativa Exploración abdominal: tendremos que tener en cuenta los signos de irritación peritoneal (como el Blumberg, signo de Rovsing), el signo de Murphy (nos orienta a patología de vía biliar, donde habría que cubrir con antibióticos contra gram negativos desde el inicio), detectar abdomen agudo e importancia de síntomas anorrectales (proctitis, colitis de etiología infecciosa, ETS → que debutan con sintomatología anorrectal). Exploración genitourinaria: dar importancia a la presencia de exudado uretral, vaginal, a la presencia de lesiones cutáneas (úlceras genitales, aftas y mucosas). Además de las micosis, los intertrigos y sobre todo, darle importancia a las enfermedades de transmisión sexual. IMPORTANTE EXPLORAR LA PIEL, PARTES BLANDAS, ACCESOS VENOSOS Y PALPAR ADENOPATÍAS. A la derecha tenemos una úlcera indolora genital como puede ser chancro que no es más que la manifestación de la sífilis primaria. Sin embargo, la sífilis secundaria puede debutar como un exantema maculopapuloso generalizado en tronco o incluso con evolución a máculo-pápula o pústulas en la sífilis plantar (forma de sífilis secundaria). En la foto de la izquierda de lesión eritematosa vesicular en un labio pensaremos en un herpes simple, pero en el caso de que encontremos estas vesículas en otras zonas y que se distribuyan de manera conjunta siguiendo una metámera nerviosa, sospecharemos de un herpes varicela zóster. 4  Medalternativa Como ya hemos comentado hay que darle gran importancia al contacto con el mundo rural por el contacto con animales que puedan provocar zoonosis o enfermedades transmitidas por vectores como las garrapatas. Nos encontramos ante el eritema crónico migrans típico de la Enfermedad de Lyme, se trata de una enfermedad transmitida por garrapatas y provocada por la Borrelia Burgdorferi. Muchas veces no se ve tan claro ese eritema anular, pero si lo vemos como una zona donde la picadura de la garrapata con un halo eritematoso alrededor y si nos fijamos sí podremos llegar a ver esas zonas blanquecinas en el centro, aunque no se distribuya como el eritema anular tan típico que aparece en esta foto. Muy importante la REVISIÓN DE VÍAS VENOSAS porque muchas veces los pacientes tienen fiebre y el foco se encuentra en esa vía. Se deben de realizar urocultivos, análisis de orina y sacar hemocultivos, pero también revisar la vía porque se puede haber creado una flebitis en uno de los accesos venosos. Exploración física: palpar adenopatía, ya que existen causas tumorales, autoinmunes, pero la mayoría suelen ser causas infecciosas o incluso reactivas. Teniendo en cuenta la distribución de las cadenas ganglionares en el organismo, tendremos que palpar las principales cadenas que sean accesibles como las del cuello, las axilas y las ingles. 5  Medalternativa 3. PRUEBAS COMPLEMENTARIAS Una vez realizada la anamnesis y la exploración física, será necesario realizar las pruebas complementarias de forma escalonada en función de la sospecha clínica y los hallazgos: 1. Empezar por la analítica general sanguínea donde incluiremos parámetros que nos indiquen cuando están elevados en sospecha de infección de inflamación como VSG, PCR (proteína C reactiva,) procalcitonina. También en la analítica general encontramos elevación de otros reactantes de fase aguda: leucocitos, neutrófilos, fibrinógeno → nos orientará hacia la presencia de un proceso infeccioso. 2. Sacar sistemático de orina o sedimento→ nos indicará si existe infección o no, así como otras alteraciones como pueda ser la proteinuria (en el caso de sospecha de alguna patología renal). 3. Cultivo microbiológico dependiendo de sospecha clínica: hemo, urocultivos de orina, exudados de úlceras, exudado de nasofaríngeo, cultivo de líquido ascítico y LCR. 4. Hacer serología vírica y bacteriana → nos indicarán dependiendo de la positividad o no de IgG o IgM si existe algún proceso involucrado. 5. Con las pruebas de inmunología podemos ver inmunoglobulinas, proteinograma, interleucinas, subpoblaciones linfocitarias. 6. Hacer Rx, TC, RM, ecografía. 7. De medicina nuclear: podemos utilizar el PET-TC (nos habla de la actividad de los diversos órganos, es decir, del metabolismo glucídico), gammagrafía. 8. Anatomía patológica en el caso de que se tomen muestras para biopsia. 9. Otras: PCR (para citomegalovirus, el Clostridium difficile) y secuenciación genómica (se suele dar en casos más raros). 4. ESTRATEGIA DIAGNÓSTICA Dx de presunción: ○ Localización del síndrome infeccioso. ○ Síndrome febril no localizado. Dx etiológico : ○ Para demostración del agente causante. Con toda la información llegaremos a un diagnóstico de presunción, es decir, nosotros podemos pensar que es un síndrome infeccioso de foco abdominal y podemos actuar con una terapia empírica o un síndrome febril sin foco. Una vez nosotros conozcamos cual es el microorganismo causante, podremos ponerle el tratamiento dirigido. Esta demostración del agente causal puede ser a través de procesos microbiológicos (cultivos), seroinmunología, métodos genéticos como la PCR o la secuenciación genética. 6 1. RESPONSABILIDADES DEL CLÍNICO FRENTE A LAS PRUEBAS DE LABORATORIO Conocer la batería de pruebas disponibles. También debemos conocer cómo son las pautas de recolección (útiles para recogerlas) y transporte de muestras Incorporarlas a la historia clínica: hay que dejar todo registrado, no vale sólo con pedirlo, tiene que constar en la historia. Ayudar a definir los agentes a estudiar de rutina. Por ejemplo, en las meningitis de líquido claro hay que pedir el virus del West Nile. Alertar al laboratorio cuando se sospeche de alta contagiosidad en la manipulación de la muestra: sobre todo en las fiebres hemorrágicas, ébola, fiebre de Crimea Congo...En Extremadura, ante una alerta por la fiebre hemorrágica Crimea Congo (transmitida por la garrapata) hay que aislar al paciente y tomar muestras que se envían al Centro de Microbiología Nacional situado en Majadahonda. Priorizar solicitudes si la muestra es limitada. Por ejemplo: infección en la columna vertebral, hay que coger una muestra del hueso mediante una aguja guiada por TC. Comunicar cuando se requiera una prueba especial. Hay un catálogo de pruebas de rutina, pero a veces sospechamos cosas que no son las habituales y las tienen que mandar fuera argumentando por qué las solicitas, como en casos de enfermedades emergentes. En 2017 un chico de 38 años que vuelve de la República Dominicana con mucha fiebre, que parecía viral, empieza a deteriorarse durante los 20 días de UCI y no encontraban diagnóstico. Al hablar con microbiología para ver que se le podía pedir y el bote que le sacaban en la uci no era el que necesitaban. 2. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO Siempre lo pregunta a) Directo: detectando el agente causal. Ocurrió a partir del invento del microscopio en 1897. i) Se puede cultivar, hacer crecer e identificar. ii) Detectando componentes del agente (Ag, ác nucleicos) b) Indirecto: detección de la respuesta específica del hospedador. 2.1. DIRECTO Nos permite obtener resultados rápidos, nos da mayor seguridad y es la que más se ha desarrollado en los últimos años. Detectamos antígenos y nos ayuda a detectar el agente causal, buscando la bacteria, el virus o el parásito en la muestra). Ocurrió a partir del invento del microscopio en 1897. Visualizando el agente (macroscópico/microscópico). Cultivando el agente (crecimiento e identificación, permite realizar pruebas de sensibilidad). Detectando componentes del agente (Ag, ác nucleicos).  2.2. INDIRECTO Por la imposibilidad de obtener cultivos. Su interpretación es conflictiva Reacción antígeno-anticuerpo (agregación, marcadores, neutralización, fijación complemento) Es cuando no se pueden hacer cultivos. El gold standard es la serología (detectar anticuerpos que el cuerpo ha creado frente a la infección). Habitualmente una elevación de las IgM es indicativo de una infección aguda e IgG de infección pasada. No obstante, hay pacientes en los que la IgM puede estar activa durante meses o años, es decir, no es mandatario que IgM sea infección aguda e IgG infección crónica. Tinciones: de izquierda a derecha: Gram, Ziehl-Neelsen (M. Tuberculosis), Giemsa (más empleada para los parásitos, el Plasmodium se observa como una gota g ruesa). Detección de antígeno: Tests rápidos para Streptococcus, Plasmodium, Gripe Aviar, H.Pylori Detección de proteómica: MALDITOF (Matrix Assisted Laser Desortion/Ionization Time-of- Flight Mass Spectrometry). Es una técnica usada mucho en el hospital y, desde hace poco, en urgencias. Se basa en la espectrometría de masas mediante ionización suave, realiza un análisis de las proteínas que componen cada patógeno (detección de proteómica). Se utiliza comparando con una base de datos y nos da un % de similitud. Características: - Coste muy bajo. - Buena concordancia con los métodos convencionales: elevada sensibilidad y especificidad. - Se puede realizar el análisis sobre las propias colonias, tanto las crecidas en medio de cultivo sólido como las crecidas en material clínico (no necesita amplificación previa de la diana). - Disminución radical en el tiempo de respuesta: desde unos minutos a 2h. Cuando está depositada la colonia y se ha dejado en la matriz, se da un pulso de láser que hace que dentro del tubo de vacío asciendan las partículas, lleguen a un detector y aquellas que tienen un mayor peso molecular llegarán después que las de menor peso molecular. Se crea un espectro y se compara con el espectro que tiene la base de datos, la cual es muy amplia, lo que nos permitirá detectar bacterias/levaduras/hongos, excepto los virus. Detección de ácidos nucleicos: PCR. 3. IMPORTANCIA DEL DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO DON'T COVER… DISCOVER!! Si tras la historia clínica hay un diagnóstico presuntivo de infección procedemos al llamado rastreo microbiológico, que es lo que le llega a los microbiólogos. Según el diagnóstico clínico presuntivo, este rastreo será un esputo, muestra de orina, torunda, muestra de sangre, heces, biopsia de tejido, aspirados anaerobios... Dentro de la muestra de orina, podemos distinguir entre la muestra normal o el urocultivo, donde se recogería una muestra más pequeña. Las muestras de anaerobios no son muy habituales, ya que los anaerobios en los cultivos convencionales se pierden mucho, por lo que si se prevé que la infección puede estar causada por estos agentes utilizamos envases especiales donde si entra oxígeno se marca una línea azul (no sería válida la muestra). En la consulta de infecciosas lo más utilizado son las torundas, el medio puede o no contener gel; el primero de ellos tiene una torunda más fina y permite que el virus se permita intacto para que el microbiólogo pueda sacar el ADN del mismo. Las PCR de ETS son útiles dado que en muchas de ellas se tienen que buscar por dónde ha entrado el agente causal (boca, ano…), utilizando una torunda muy fina. 4. KAHOOT 2024, este año no las ha dado 1. Joven de 20 años con presíncope. Lleva 1 semana con molestia lumbar derecha y 2 días con fiebre de 39º. a. Urocultivo y hemocultivo b. Test de Ag sars-cov-2. Hay mucho covid c. Ab y se vuelve a ver en una semana. d. Cultivo esputo. Le duele al toser. 2. ¿Cómo se extraen los hemocultivos? a. Un frasco de cada brazo b. Seis frascos de la misma extracción c. Dos tres tandas de 2 frascos separados en tiempo y lugar de extracción. d. Como diga enfermería. 3. Mujer de 50 años en hemodiálisis que lleva dos meses con tos seca, 50% tórax con infiltrado en LSD. a. Cultivo de esputo que incluya estudio de micobacterias b. Levofloxacino y revisión clínico radiológica en 1 semana c. Furosemida. seguro que es sobrecarga hídrica d. Cultivo bacteriológico de esputo último 4. Joven de 20 años, usuarios de sisones chilis con consumo de “mefe”. Tiene una fisura anal desde hace un mes. a. No se qué son chills: mezclas de drogas, sexo y alcohol. b. Sin fiebre no tiene sentido solicitar pruebas microbiológicas. c. Derivaría a Cirugía General d. No se qué es “mefe”: droga china intravenosa 5. Busca chills y mefe en Google y en la exploración palpas adenopatías inguinales y ves una úlcera a las 6h. a. Frotis de la úlcera con torunda tapón azul. No es esta porque las ITS son muy poco cultivables, y la torunda de tapón azul se emplea para cultivos. b. Biopsia de las adenopatías. c. Coprocultivos y parásitos. d. Frotis úlcera medio líquido y cribado de ITS. 6. Señor sospecha de meningitis al que le prácticas punción lumbar. ¿En qué frasco envías el LCR? a. Tubo estéril. b. En cualquiera. c. En el de heces mismo. d. Que acabe ya la clase.  Los Testosterona TEMA 4: NUEVAS TÉCNICAS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO 1. INTRODUCCIÓN Es muy difícil tratar a los pacientes cuando no sabemos lo que tienen. Saber lo que le ocurre es un proceso muy importante en cualquier procedimiento clínico. En el campo de las enfermedades infecciosas, sin duda, el diagnóstico microbiológico tiene un valor añadido muy específico, pues es esencial para poder optimizar el tratamiento antimicrobiano de forma certera y precoz. En 1980, sólo se habían publicado 1.800 especies bacterianas validadas, mientras que más de 500 nuevas especies se describen anualmente. Antiguamente, esto se debía principalmente a que los métodos de microbiología para establecer el diagnóstico se basaban principalmente en el agar; agar sangre para muestras grampositivas, agar MacConkey para bacilos gramnegativos y agar chocolate para todos los microorganismos. Otros más específicos, como agar BCYE para Legionella… El gran caballo de batalla del diagnóstico microbiológico siempre ha sido su dependencia del cultivo, lo que exige el inamovible período de incubación de al menos 16-18 horas desde la recepción de la muestra. La necesidad clínica de obtener información de resultados en las primeras horas de atención al paciente, choca con esta realidad. Utilizando la tinción con diferentes colorantes (gram, KOH, lactofenol, tinta china, Kinyoun…) llegamos al diagnóstico presuntivo. Una vez que tenemos el cultivo podemos hacer un estudio de susceptibilidad a los distintos antimicrobianos. De forma manual, usando discos o tiras de tests, o técnicas más automatizadas. No obstante, necesitamos 72h para tener los resultados desde que se grabó la muestra en el laboratorio. Otras infecciones han permitido el desarrollo de técnicas serológicas: antígeno-anticuerpo. Existen 2 situaciones límites que llevan a una implementación de nuevas técnicas de diagnóstico microbiológico. 1. Aumento de microorganismos emergentes y reemergentes: 1  Los Testosterona El auge de las sacudidas sociales que producen las epidemias a lo largo de la historia (en 1981; VIH, en 1997; influenza aviaria (H5N1), en 2014; ébola, en 2019; COVID, en 2022; monkeypox) ha mostrado la fragilidad e interés por las enfermedades infecciosas 2. El aumento de la tasa de infecciones graves causadas por microorganismos resistentes a los antimicrobianos que ocasiona una alta probabilidad de error en el tratamiento empírico. Artículo científico: En 2021, estimamos que 4,71 millones de muertes estuvieron asociadas con la resistencia a los antimicrobianos (RAM). De 2022 a 2050, se estima un fuerte aumento en el número de muertes por RAM de 69,6%: 39 millones de muertes. A pesar de una disminución de la mortalidad mundial por sepsis, la mortalidad mundial por RAM aumenta. Las enfermedades infecciosas no son un proceso estático, sino un proceso dinámico, tal y como lo comentó Anthony Fauci, que fue el director del instituto de enfermedades infecciosas americano, que decía que “las enfermedades infecciosas no terminan hasta que terminan, pero nunca terminan”. 2. IMPLEMENTACIÓN DE LAS NUEVAS TÉCNICAS DE DX MICROBIOLÓGICO. En los últimos años, el desarrollo de la proteómica y la genómica junto con el avance tecnológico, están dibujando un nuevo escenario en el dx de enfermedades infecciosas. Tenemos 2 variantes: PCR → laboratorio de Biología Molecular. Diagnóstico rápido y específico. ○ Ampliación isotérmica de ácidos nucleicos: LAMP ○ Espectrometría de masas: MALDI-ToF (análisis de las proteínas de los patógenos) y ESI-ToF. Secuenciación con sistemas de próxima generación y medicina personalizada → laboratorio de secuenciación genómica. Suelen tardar más tiempo. Se utilizan para genomas completos de patógenos y el análisis del microbioma (metagenómica). Todas estas nuevas técnicas complementan a la microbiología tradicional. Aportan sensibilidad y especificidad (certeza), además de rapidez en la obtención de resultados. Estas técnicas mejoran los valores diagnósticos: alta especificidad al utilizar identificadores genéticos y alta sensibilización por detectar muy bajas concentraciones del patógeno target. Además, proporcionan menor duración de los procesos, mejorando tiempo de respuesta e inmediatez en la comunicación de los resultados microbiológicos al clínicos para que impacte en la correcta evolución del paciente. 2.1. FUNDAMENTO DE LA PCR. Es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN mediante ciclos repetidos en los que la secuencia es copiada fielmente. La idea básica es sintetizar muchas veces un fragmento de ADN utilizando una polimerasa que trabaja a altas temperaturas que proviene de la bacteria Thermus aquaticus (que vive a 79-85ºC) de ahí su nombre comercial taq polimerasa. Importante conocer bien la estructura y el genoma del microorganismo a buscar porque en función de ello se van a desarrollar los primers o iniciadores moleculares, constituyendo un proceso extremamente crítico para el éxito del PCR. Proceso: 1. Desnaturalización a 95°C. 2  Los Testosterona 2. Anillado a 55°C. 3. Extensión a 72°C. 2.2. COMPONENTES DE LA PCR.  DNA molde o templado: contiene la región que queremos amplificar.  Primers: secuencias cortas de DNA (oligonucleótidos) que delimitan la zona que queremos amplificar. Deben ser complementarios a cada uno de los extremos de la región a amplificar. Se sintetizan in vitro de un modo preciso para que a partir de su región 3´, la polimerasa inicie la síntesis en dirección correcta.  Mezcla de los 4 deoxirribonucleótidos trifosfato que componen el DNA.  DNA Polimerasa: polimerasa capaz de resistir elevadas temperaturas (TaqPol).  Termocicladora: una máquina que haga ciclos controlados de temperatura (Máquina de PCR, PCRra). Los termocicladores incorporan lectores de fluorescencia y están diseñados para poder medir, en cualquier momento, la fluorescencia emitida. Tipos: o Tecnología molecular Filmarray® (Nested-PCR y PCR múltiple): 20 minutos-1 hora, más caras. Todas las etapas de extracción, purificación, amplificación y detección, están integradas en monotest y en un solo equipo. o Tecnología molecular GenXpert (RT-PCR): 20-50 minutos. Muy usado en el SARS-CoV 2 (gen N y E), gripe, VRS, VIH, VHB, VHC, infección por Mycobacterium tuberculosis MR o por Clostidrioides difficile, detección de streptococcus agalactiae. 2.3. TIPOS DE LA PCR. o PCR múltiple: PCR tradicional, pero con más de 2 primers para amplificar varias regiones al mismo tiempo. o PCR anidada o nested: altamente específica, donde el producto de amplificación se usa como molde para realizar una segunda amplificación con iniciadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. o PCR in situ: PCR sobre secciones histológicas o células (biopsias) utilizando hibridación convencial con sondas de ADN/ARN, pudiéndose detectar pequeñísimas cantidades de material genético. o PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR): utiliza como molde inicial ARN y se requiere una transcriptasa inversa para convertir ese ARN en ADN y comenzar la reacción de amplificación y detección. o PCR en tiempo real (q): es una variante que amplifica y simultáneamente cuantifica de forma absoluta el producto de amplificación de ADN. 2.4. ESTANDARIZACIÓN DE LA TOMA DE MUESTRAS PARA CADA SÍNDROME. Está basada en signos y síntomas clínicos indicativos de afectar a algún órgano en particular. Presenta gran interés para poder detectar varios patógenos a la vez. Si tenemos una infección respiratoria o neumonía se hace frotis nasofaríngeo y se analiza en el film arrays. ➔ Meningitis / Encefalitis → LCR 200 uL ➔ Neumonía → Esputo /LBA 3  Los Testosterona ➔ Infección respiratoria → Nasofaríngeo 300 uL ➔ GI → Heces 200 uL Nos permite distinguir entre una meningitis bacteriana, viral o fúngica. Incluso en la meningitis neonatal es capaz de distinguir los microorganismos que la causan (Escherichia Coli K1 y Streptococcus Agalactiae). En los adultos son: Con respecto a los síndromes respiratorios: En los síndromes gastrointestinales: 3. SHOCK SÉPTICO/SEPSIS. La detección de la bacteriemia y la fungemia constituyen una de las prioridades del Servicio de Microbiología Clínica, dado su importancia diagnóstica y pronóstica. Es importantísimo que el diagnóstico se haga rápido. Por cada hora de retraso en el inicio del tratamiento antibiótico, la mortalidad aumenta un 8%. Cada 3,5s en el mundo se produce una muerte por sepsis. Estos procesos se asocian a una mortalidad elevada, que puede oscilar entre el 10% y el 30%. 48.900.000 personas padecen un episodio de sepsis cada año. 4  Los Testosterona 3.1. AMPLITUD DE PATÓGENOS TESTADOS EN SOSPECHA DE SEPSIS POR FILMARRAY. Aparte del filmarray, como este necesita genes de resistencia que no siempre se expresan en el paciente, usamos la CMI. Usa una sonda específica para diferentes patógenos y nos permite tanto confirmar la especie como para hacer un diagnóstico de sensibilidad. Ejemplo de bacteriemia por Staphylococcus spp. 3.2. MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-Of-Flight Mass Spectrometry) Técnica de espectrometría de masas mediante ionización suave. Se puede hacer directamente sobre la placa, sobre el cultivo o sobre una botella de hemocultivo o sobre la prueba muestra directa. Es un análisis proteómico que se puede realizar tanto a partir de colonias crecidas en medios de cultivo sólido como en material clínico (no necesita amplificación previa de la diana).  Disminución radical en el t de respuesta: resultado en minutos (15-60 minutos).  Bajo coste: 1,43 euros/15 euros.  Buena concordancia con los métodos convencionales: elevada S y E. 5  Los Testosterona Un espectro es una forma del microorganismo que se compara automáticamente con una base de datos para la identificación a nivel de género y especie. A continuación, como los iones más pequeños viajan más rápido que los iones grandes, los analitos son separados para crear un espectro de masascon intensidades variables. Finalmente, se realiza un bombeo de pulsos de láser breves. Las moléculas ionizadas se aceleran a través de un campo electrostático y son expulsadas a través de un tubo de vuelo de metal sometido a vacío hasta que alcanzan un detector. 4. TECNOLOGÍA MOLECULAR ACCELERATE PHENO SYSTEM (HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU: FISH MÁS MICROSCOPÍA AUTOMATIZADA). En cada ensayo, la señal de una sonda específica se compara con la señal de las sondas universales bacterianas y eucarióticas. La localización conjunta de la señal de la sonda específica y la señal de la sonda universal permite confirmar la presencia y la identidad del microorganismo, diferenciando al mismo tiempo los posibles contaminantes y las infecciones polimicrobianas. Nos permite realizar estudios de sensibilidad a los antibióticos mediante CMI midiendo los cambios morfocinéticos en la célula y el crecimiento de las colonias en presencia de concentraciones específicas de antibióticos. Los patrones de crecimiento se comparan con los perfiles de crecimiento de referencia correlacionados con las CMI obtenidas mediante microdilución en caldo. Después, los resultados se interpretan en función de los puntos de cortes y sus reglas. En 1 hora tenemos el diagnóstico microbiológico y en 7 horas la sensibilidad antimicrobiana por CMI. 6  Los Testosterona 5. VITEK REVEAL: ANTIBIOGRAMA RÁPIDO PARA INFECCIONES DEL TORRENTE SANGUÍNEO El sensor de AST de Reveal, es un sensor de Moléculas Pequeñas (Array SMS) que responde a volátiles metabólitos liberados por los microorganismos durante el crecimiento, con cambio en el color. De esta forma, el aparato nos dice ante qué microorganismos estamos presentes y, además, también nos permiten en 3,5h empezar a tener datos. ¿CUAL ES EL PROBLEMA DE ESTAS DOS TÉCNICAS MOLECULARES? Necesitamos 48-72 horas para obtener el nombre del microorganismo y el antimicrobiograma, pero conel filmarray o el accelerate, en una hora tenemos el nombre del bicho y en 7 horas tenemos la CMI. Siempre es necesario que el incubador diga que la muestra es positiva, no se puede hacer directamente sobre la sangre extraída del paciente, es decir, no sirve con una sangre sospechosa. 6. TECNICA MOLECULAR T2MR (RT-PCR y RM de nanopartículas paramagnéticas) Utilidad de técnicas que detectan etiología de bacteriemia y fungemia sin necesidad de que pasen 24- 72 horas al crecimiento de la botella del hemocultivo tradicional, sino directamente de la sangre extraída al paciente con sospecha de sepsis. 7  Los Testosterona Se está probando en muchos laboratorios de España. Mínima manipulación: menos de 1 minuto. 4 ml de sangre directa del paciente. Test completo en un solo cartucho. Resultados en 3-5 horas. S 100% y E 97%. Solo detecta ADN de microorganismos íntegros, no ADN libre. Muy caro aún. 7. LAMP. AMPLIFICACIÓN ISOTÉRMICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS La técnica LAMP, al igual que PCR, tiene la capacidad de amplificar fragmentos específicos de ADN, lo que permite la detección altamente sensible de patógenos. La efectividad de LAMP se basa en el diseño de primers que deben ser muy específicos. A diferencia de PCR, LAMP requiere de 4 a 6 primers. Estos 4 primers reconocen 6 regiones distintas del gen target. El método utiliza una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena 5` → 3`. Esta propiedad de amplificación por desplazamiento no requiere el paso de PCR para desnaturalizar (90ºC). Es isotérmica, es decir, la reacción ocurre a una misma temperatura 60ºC en forma continua, lo que es importante ventaja sobre PCR tradicional. Presenta una alta eficiencia de amplificación: ADN se amplifica 109-1010 veces en 15 a 75 minutos. Una de las grandes ventajas está relacionado con la mayor tolerancia a inhibidores. Las ventajas de LAMP son: - Mayor sensibilidad y especificidad que PCR. - Económica. - Simple. - Funciona sin termociclador. Duración: 30 minutos. 8  Los Testosterona LAMP PCR Reacción isotérmica (60 a 65ºC) Reacción cíclica Usa de 4 a 6a primers Temperatura Variable - Denaturación (95 ºC) - Alineamiento/extensión (50-60ºC) Primers “loop” aceleran la reacción e Usa solo 2 primers incrementan la especificadas (reconocimiento de 2 sitios adicionales) Simple, equipo de alta tecnología, menor costo Requiere termociclados (heating and cooking) Menos interferencia causada por inhibidores Utiliza sondas en el Real-time PCR que permite mayor especificidad LAMP-Bioluminiscencia permite una fácil detección (puede detectar la amplificación durante la reacción). 7.1. NEUMONÍA POR PNEUMOCYSTIS JIROVECII Se suele utilizar LAMP para su diagnóstico. Presenta un patrón intersticial de vidrio deslustrado. Hacemos una PCR que será positiva y el tratamiento es muy sencillo, poner cotrimoxazol. Ocurre en pacientes muy deprimidos, fumadores que han recibido muchos corticoides y con patologías de base. 9  Los Testosterona 8. SECUENCIACIÓN Secuencia de una molécula de DNA consiste en determinar en qué orden se disponen los 4 nucleótidos que componen la molécula. El método químico de Sanger somete la molécula de DNA a distintos métodos de ruptura. Cada método escinde la molécula allí donde haya un nucleótido específico mediante ADN polimerasa, utilizando 4 tubos y electroforesis en gel. Es bastante laborioso y, hoy en día, ha sido sustituido por métodos enzimáticos. Este proceso , actualmente, se ha mejorado y se ha automatizado: Los ddNTP terminadores de cadena están marcados fluorescentemente, cada uno con un fluoróforo distinto desarrollándose la reacción en un sólo tubo. Se sustituye la ADN polimerasa por la Taq-polimerasa. De este modo es posible automatizar el proceso como si se tratara de una PCR. La separación de los fragmentos se realiza mediante electroforesis capilar, que es más rápida que la electroforesis en gel. Los fragmentos de distintos tamaños llegan al final del capilar, donde son excitados con un láser y se detecta la fluorescencia emitida por el ddNTP terminal. El gráfico resultante se denomina electroferograma. 9. NSG. NEXT GENERATION SEQUENCING DATA. Es considerada la segunda generación en lo que respecta a la secuenciación del DNA. Surgieron a partir de 2005. Es un grupo de tecnologías diseñadas para secuenciar gran cantidad de segmentos de DNA de forma masiva y en paralelo, en menor cantidad de tiempo y a un menor costo por base. La forma de secuenciar puede ser en un sentido de la doble hebra del ADN o en ambos (más recomendable en microbiología, porque permite obtener fragmentos más largos, de casi 600 pb). Existen una serie de aplicaciones NGS en la microbiología clínica: mNGS/WWS WGS 10  Los Testosterona Se utilizan para: El diagnóstico (detección del patógeno o microbiota) Detección de genes AR o predicción AR Tipificación de cepas o epidemiología Nos permite amplificar y secuenciar por PCR el virus en fragmentos para posteriormente reconstruir su genoma. La aplicación de la secuenciación masiva, además de reducir costes y el tiempo de análisis, genera tal cantidad de información que está cambiando el modo de realizar investigación en microbiología y demanda la aplicación de la bioinformática en el diagnóstico microbiológico. 10. SARS-COV-2 La secuencia del genoma del SARS-CoV 2 a gran escala es la clave y la llave para comprender cómo se propaga el virus. En un esfuerzo por monitorizar la evolución genómica del virus a tiempo real se ha creado una iniciativa global en donde todos los genomas secuenciados son depositados en la base de datos pública @GISAID. Adicionalmente, la plataforma @nextrain recopila los genomas de GISAIS y analiza detalladamente la evolución y dispersión del virus a lo largo del mapa del mundo. La información filogenética obtenida a partir de los genomas completos muestra la evolución temporal del virus y divergencia en clados diferenciados: son grupos o familias de virus que comparten su historia evolutiva y que poseen un antepasado común. 10.1. EPIDEMIOLOGÍA GENÓMICA DEL SARS-COV-2 EN EL MUNDO La información filogenética obtenida a partir de los genomas completos muestra la evolución temporal del virus y divergencia en clados diferenciados: son grupos o familias de virus que comparten su historia evolutiva y que poseen un antepasado común. 11  Los Testosterona Así han evolucionado las variantes y subvariantes de SARS-Cov2: Omicron y los hijos de los hijos de Omicron. 10.2. EPIDEMIOLOGÍA GENÓMICA DEL MPOX EN EL MUNDO Existen dos clados virales diferentes: CLADO I: + relacionado con el brote de 2022. CLADO II: en relación con el brote actual. 11. VENTAJAS DE ESTAS NUEVAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO. - Complementa a la microbiología tradicional. - Aportan sensibilidad y especificidad: certeza. - Aportan rapidez en la obtención de resultados. Mejorando los valores diagnósticos: Alta especificidad al utilizar identificadores genéticos y alta sensibilidad por detectar muy bajas concentraciones del patógeno target. Menor duración de los procesos mejorando tiempo de respuesta e inmediatez en la comunicación de los resultados microbiológicos al clínico para que impacte en la correcta evolución del paciente. 12. DESVENTAJAS DE ESTAS NUEVAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO. Existe un aumento de los costos para el laboratorio. Al menos a corto plazo por la inversión inicial y la desaparición de las técnicas más tradicionales, pero minimizadas en los análisis de coste-efectividad en términos de eficacia y salud, ya que la rapidez con que se ofrecen los resultados permite actuaciones precoces con la implantación de medidas terapéuticas que mejoren el pronóstico del paciente. Raymond C. Bartlett es un infectólogo muy conocido que ha fallecido hace poco y decía que “Nuestra tecnología se excede de la capacidad de ser aplicada eficaz y económicamente a los problemas humanos, por ello hay que integrar lo que es técnicamente posible con lo que es clínicamente importante…”. “Prudencia, sensatez y responsabilidad: Sostenibilidad de nuestro sistema sanitario.” 12  Los Testosterona 13. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO CORRECTO. Toda la información diagnóstica que el laboratorio de microbiología puede proporcionar, depende de la calidad de la muestra recibida. Una toma mal seleccionada, mal realizada, pobremente recogida o mal transportada determinará un posible fallo en la recuperación de los agentes patógenos, pudiendo inducir a errores diagnósticos e incluso a un tratamiento inadecuado del paciente. Hay que intentar obtener el volumen necesario de muestra, intentar recoger muestras asépticamente y antes de instaurar tratamiento antimicrobiano. La relación cercana entre el laboratorio y la clínica es esencial para: - La elección de las pruebas diagnósticas a realizar y la interpretación de sus resultados, especialmente en las muestras de obtención dificultosa o alta significación clínica. - Rápida transmisión de la información microbiológica que derive en diagnósticos certeros y pautas de tratamientos precoces. El trabajo en equipo siempre debe sumar en el manejo de las infecciones 14. CONCLUSIONES. La diversidad de patógenos emergentes supone un reto continuo para los especialistas en patología infecciosa. Un diagnóstico temprano y certero de las infecciones es el mejor camino para pauta un tratamiento precoz que permita un correcta evolución de nuestro pacientes Este diagnóstico se debe hacer desde una perspectiva multidisciplinar, siendo necesario la buena comunicación y trabajo en equipo de todos los especialistas implicados. Aunque presenta baja sensibilidad, los métodos diagnósticos tradicionales basados en el cultivo son indispensables para el aislamiento del microorganismo y la determinación de la sensibilidad antimicrobiana. Las nuevas técnicas de diagnóstico microbiológico, basadas en sistemas moleculares complementan a la microbiología tradicional, disminuyendo la duración del procesamiento y mejorando tanto la certeza como el tiempo de respuesta por parte del laboratorio. Todo ello repercute en una atención personalizada de calidad tal como merecen nuestros pacientes. 13 14