DNA Copy, Correction and Recombination 2024-2025 (PDF)

Αντιγραφή, επιδιόρθωση και ανασυνδυασµός του DNA Γιώργος Τζηµαγιώργης BSc PhD MD Καθηγητής Βιολογικής Χηµείας Τµήµα Ιατρικής, Σχολή Επιστηµών Υγείας, ΑΠΘ Ώρες επικοινωνίας: 12:00-01:00 pm, Τρίτη – Τετάρτη (κάθε εργάσιµη...

Αντιγραφή, επιδιόρθωση και ανασυνδυασµός του DNA Γιώργος Τζηµαγιώργης BSc PhD MD Καθηγητής Βιολογικής Χηµείας Τµήµα Ιατρικής, Σχολή Επιστηµών Υγείας, ΑΠΘ Ώρες επικοινωνίας: 12:00-01:00 pm, Τρίτη – Τετάρτη (κάθε εργάσιµη µέρα !!!) ΚΕΦΑΛΑΙΟ 29 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 29  Αντιγραφή DNA 1. Μηχανισµός 2. Ενζυµολογία 3. Βήµατα πολυµερισµού 4. Ευκαρυωτικά vs. προκαρυωτικά 5. Τελοµερή Ηµισυντηρητικός τρόπος αντιγραφής του DNA Κάθε κλώνος (αλυσίδα) χρησιµεύει Αρχικό γονικό µόριο ως εκµαγείο για τη σύνθεση του συµπληρωµατικού κλώνου (αλυσίδας) Θυγατρικά µόρια πρώτης γενιάς Θυγατρικά µόρια δεύτερης γενιάς  Προβλήµατα που προκύπτουν από την διπλή έλικα: 1. Αντιπαράλληλες αλυσίδες (opposite strands) 2. Δίκλωνα µόρια 3. Υπερελίκωση, ξετύλιγµα Ηµισυντηρητικός τρόπος αντιγραφής του DNA Ξετυλιγµένο Υπερτυλιγµένο  Διχάλα αντιγραφής Γονικό DNA ?  Το DNA αντιγράφεται από πολυµεράσες που καθοδηγούνται από εκµαγεία 2 1 1. Η DNA πολυµεράση καταλύει τη δηµιουργία φωσφοδιεστερικών δεσµών 2. Τα νουκλεοτίδια τοποθετούνται απευθείας σε ένα εκµαγείο* 3. Το εκµαγείο µπορεί να είναι µονόκλωνο ή δίκλωνο. Αν είναι µονόκλωνο, τότε πρέπει να συνδεθεί σε ένα εκκινητή** που διαθέτει ελεύθερο 3΄ΟΗ 4. Απαιτούνται dATP, dGTP, dTTP, dCTP, καθώς και Mg++ *Εκµαγείο-µια αλληλουχία DNA ή RNA η οποία κατευθύνει τη σύνθεση µιας συµπληρωµατικής αλυσίδας **Εκκινητής-το αρχικό τµήµα ενός πολυµερούς το οποίο επεκτείνεται και από το οποίο εξαρτάται η επιµήκυνση Η αντιγραφή ορισµένων ιών (ρετροϊοί RNA) καταλύεται από µια RNA-κατευθυνόµενη DNA πολυµεράση, που ονοµάζεται αντίστροφη µεταγραφάση  Όλες οι DNA πολυµεράσες έχουν κοινά δοµικά χαρακτηριστικά Δάκτυλα Αντίχειρας Μονάδα πολυµεράσης Polymerase unit Παλάµη E. coli DNA πολυµεράση I (θραύσµα Klenow) 3’->5’ ενεργότητα εξωνουκλεάσης (εξέταση/διόρθωση) (proofreading/correction) Εξωνουκλεάση Οι DNA πολυµεράσες καταλύουν τον σχηµατισµό των πολυνουκλεοτιδικών αλυσίδων 1. Ένζυµο που κατευθύνεται από εκµαγείο (εξαρτώµενο από τα ζεύγη των βάσεων) 2. Καταλύει την πυρηνόφιλη προσβολή του 3’-OH στο “a” φωσφορικό 3. Απαιτεί ένα εκκινητή µε ελεύθερο 3’-OH (RNA πολυµεράση ??)  Δύο δεσµευµένα µεταλλικά ιόντα συµµετέχουν στην αντίδραση πολυµεράσης Δάκτυλα Δεσµεύει DNA Αντίχειρας Ενεργή θέση (δύο µεταλλικών ιόντων) Παλάµη Εξωνουκλεάση  Δύο δεσµευµένα µεταλλικά ιόντα συµµετέχουν στην αντίδραση πολυµεράσης 1. Παρουσία δύο Mg++ στο ενεργό κέντρο 2. Σταθεροποιούνται µέσω δύο καταλοίπων Asp 3. Το ένα ενεργοποιεί την 3’-OH 4. Το δεύτερο σταθεροποιεί το (-) φορτίο Εκκινητής dNTP a-P 3΄-OH  To DNA αντιγράφεται µε υψηλή πιστότητα Ελεύθερη ενέργεια ζευγαρώµατος βάσεων: 1 στις 104 βάσεις µπορεί να είναι λανθασµένη Αντιγραφή: 1 στα 109 νουκλεοτίδια Η εξειδίκευση της αντιγραφής υπαγορεύεται από δεσµούς υδρογόνου και από τη συµπληρωµατικότητα του σχήµατος µεταξύ των βάσεων Επαρκούν οι δεσµοί υδρογόνου που συνδέουν δύο συµπληρωµατικές βάσεις για την προσθήκη του σωστού νουκλεοτιδίου?  To DNA αντιγράφεται µε υψηλή πιστότητα 1. Συµπληρωµατικότητα του σχήµατος των βάσεων Αδενοσίνη Ανάλογο που δεν έχει δυνατότητα σχηµατισµού δεσµών υδρογόνου στο ζευγάρωµα των βάσεων Παρά την αδυναµία σχηµατισµού δεσµών υδρογόνου, µπορεί να προσθέτει θυµίνη (Τ)  To DNA αντιγράφεται µε υψηλή πιστότητα µεγάλη 2. Αλληλεπιδράσεις µε την πλευρά της µικρής αύλακας µικρή ruler Δοµική µελέτη Κατάλοιπα αµινοξέων του ενζύµου σχηµατίζουν δεσµούς υδρογόνου µε την πλευρά της µικρής αύλακας του ζεύγους των βάσεων στο ενεργό κέντρο Κοινή γεωµετρία για τις τέσσερεις βάσεις  To DNA αντιγράφεται µε υψηλή πιστότητα 3. Επιλεκτικότητα σχήµατος ζεύγους βάσεων dNTP µέσα στη συµπαγή θήκη Η δέσµευση ενός dNTP στην DNA πολυµεράση επάγει µια αλλαγή στη στερεοδιαµόρφωση του ενζύµου, δηµιουργώντας µια συµπαγή θήκη για το ζεύγος των βάσεων  To DNA αντιγράφεται µε υψηλή πιστότητα 4. Μηχανισµός ανάγνωσης και διόρθωσης Λανθασµένη (ασθενής) δέσµευση Μετανάστευση Κλώνος- Διάσπαση στη θέση εκµαγείου εξωνουκλεάσης Ενεργό κέντρο εξωνουκλεάσης  To DNA αντιγράφεται µε υψηλή πιστότητα 1. Συµπληρωµατικότητα του σχήµατος των βάσεων 2. Αλληλεπιδράσεις µε την πλευρά της µικρής αύλακας 3. Επιλεκτικότητα σχήµατος ζεύγους βάσεων 4. Μηχανισµός ανάγνωσης και διόρθωσης  Διχάλα αντιγραφής Τοποϊσοµεράση II (DNA γυράση) (DnaB) (προσθήκη – υπερσπειραµάτων) Ελικάση (Πρωτεΐνη που προσδένεται σε µονόκλωνο DNA) Δοµή ολισθαίνοντος σφιγκτήρα εκκινητής Καθυστερών Προηγούµενος πολυμεράση κλώνος κλώνος DNA λιγάση Τµήµατα Okazaki  Έναρξη της αντιγραφής Εκµαγείο DNA Εκκινητάση (ή πριµάση) Από προέρχεται ο εκκινητής? RNA-εκκινητής (5 nt) DNA πολυµεράση Νέο DNA Μετά τη σύνθεση του DNA, η RNA αλληλουχία αποµακρύνεται µε υδρόλυση και αντικαθίσταται µε DNA  Διχάλα αντιγραφής Προηγούµενος Γονικό κλώνος DNA Καθυστερών κλώνος  Διχάλα αντιγραφής Προηγούµενος Γονικό κλώνος DNA Τµήµατα Okazaki ~1000 nt Εκκινητής Καθυστερών Αποµάκρυνση και σύνθεση κλώνος (DNA πολυµεράση I) DNA λιγάση Διχάλα αντιγραφής Καθυστερών κλώνος Προηγούµενος κλώνος “Βραχίονας τροµπονιού” Προσθήκη 1000 nt πριν την απελευθέρωση & την εµφάνιση νέας θηλιάς Τµήµατα Okazaki DNA πολυµεράση I Αποµάκρυνση εκκινητών (5’ -3’) Σύνθεση (fill in) DNA λιγάση  Διχάλα αντιγραφής Τοποισοµεράση II (DNA γυράση) (DnaB) (προσθήκη – υπερσπειραµάτων) Ελικάση (Πρωτεΐνη που προσδένεται σε µονόκλωνο DNA) Δοµή ολισθαίνοντος σφιγκτήρα εκκινητής πολυµεράση Καθυστερών Προηγούµενος κλώνος κλώνος DNA λιγάση Τµήµατα Okazaki  Η DNA λιγάση συνδέει άκρα DNA σε δίκλωνες περιοχές thermodynamically nucleophilic attack uphill rxn but no leaving group DNA λιγάση  Διχάλα αντιγραφής Τοποϊσοµεράση II (DNA γυράση) (DnaB) (προσθήκη – υπερσπειραµάτων) Ελικάση (Πρωτεΐνη που προσδένεται σε µονόκλωνο DNA) Δοµή ολισθαίνοντος σφιγκτήρα εκκινητής Καθυστερών Προηγούµενος πολυμεράση κλώνος κλώνος DNA λιγάση Τµήµατα Okazaki  Δοµή της βακτηριακής ελικάσης (PcrA) Δοµική περιοχή Β2 Δέσµευση ssDNA binding µονόκλωνου DNA Δοµική περιοχή Α2 Δοµική Δοµική περιοχή Β1 περιοχή Α1 Θηλιά P ATP (περιοχή δέσµευσης και υδρόλυσης  Διαχωρισµός των κλώνων του DNA απαιτεί ελικάσες και υδρόλυση ATP Μηχανισµός ελικάσης 1. Και οι δύο δοµικές περιοχές A1 και B1 δεσµεύουν µονόκλωνο DNA 2. Με τη δέσµευση ATP, η σχισµή κλείνει και η A1 απελευθερώνει DNA 3. Με την υδρόλυση της ATP, η σχισµή ανοίγει έλκοντας από την B1 DNA 4. Καθώς επαναλαµβάνεται η διαδικασία, το δίκλωνο DNA ξετυλίγεται 5. Κίνηση σε 3’ à 5’ κατεύθυνση  Οι τοποϊσοµεράσες είναι ένζυµα που καταλύουν την αλληλοµετατροπή τοποϊσοµερών DNA Τα ένζυµα αυτά αλλάζουν τον αριθµό των συνδέσεων του DNA καταλύοντας µία διεργασία τριών βηµάτων 1. Η διάσπαση του ενός ή και των δύο κλώνων του DNA, 2. Το πέρασµα ενός τµήµατος του DNA δια µέσω του ανοίγµατος που δηµιουργείται από τη διάσπαση και 3. Η ανασύνδεση του διασπασµένου DNA Οι τοποϊσοµεράσες τύπου Ι διασπούν µόνο τον έναν κλώνο του DNA, ενώ οι τοποϊσοµεράσες τύπου ΙΙ διασπούν και τους δύο κλώνους του DNA Σηµαντικό ρόλο στην αντιγραφή, τη µεταγραφή και τον ανασυνδυασµό του DNA  Οι τοποϊσοµεράσες τύπου Ι χαλαρώνουν υπερσπειρωµένες δοµές Δοµή ενός συµπλόκου µεταξύ ενός τµήµατος µιας ανθρώπινης τοποϊσοµεράσης Ι και DNA Οι τοποϊσοµεράσες τύπου Ι χαλαρώνουν υπερσπειρωµένες δοµές Μηχανισµός τοποϊσοµεράσης Ι Οι τοποϊσοµεράσες τύπου ΙΙ εισάγουν αρνητικά υπερσπειράµατα µε υδρόλυση της ATP  Οι τοποϊσοµεράσες τύπου ΙΙ εισάγουν αρνητικά υπερσπειράµατα µε υδρόλυση της ATP Τµήµα G Τµήµα Τ (G=gate) Μηχανισµός τοποϊσοµεράσης ΙΙ (T=transported)  Ο βαθµός συσπείρωσης του DNA καθορίζεται από τις αντίθετες δράσεις των τοποϊσοµερασών τύπου Ι και ΙΙ Αρνητικά υπερσπειράµατα εισάγονται από τις τοποϊσοµεράσες τύπου ΙΙ και χαλαρώνουν από τις τοποϊσοµεράσες τύπου Ι Οι ποσότητες των ενζύµων αυτών και οι δραστικότητές τους ρυθµίζονται για τη διατήρηση ενός κατάλληλου βαθµού αρνητικής υπερσπείρωσης  ΚΛΙΝΙΚΗ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ Η βακτηριακή τοποϊσοµεράση ΙΙ (DNA γυράση) είναι στόχος διαφόρων αντιβιοτικών, τα οποία αναστέλλουν το προκαρυωτικό ένζυµο περισσότερο από ό,τι το ευκαρυωτικό -νοβοβιοσίνη: αναστολή της δέσµευσης της ATP -ναλιδιξικό, σιπροφλοξασίνη: εµποδίζουν τη διάσπαση και την ανασύνδεση των αλυσίδων (θεραπεία λοιµώξεων του ουροποιητικού) -καµπτοθηκίνη: αντικαρκινικός παράγοντας, αναστέλλει την ανθρώπινη τοποϊσοµεράση Ι  Πού αρχίζει η αντιγραφή του DNA?? Στο βακτήριο E. Coli υπάρχει µια περιοχή έναρξης της αντιγραφής (origin of replication), µε µέγεθος 265 bp, που ονοµάζεται γενετικός τόπος oriC Θέσεις δέσµευσης της πρωτεΐνης Επάλληλη σειρά DnaA αλληλουχιών 13 nt (πλούσιων σε ΑΤ) Οµόφωνη αλληλουχία Η αντιγραφή DNA και των δύο κλώνων προχωρά γρήγορα από συγκεκριµένες θέσεις έναρξης (ή αφετηρίες) DnaAàoriC: Προετοιµασία για αντιγραφή Δέσµευση στις περιοχές µε ενεργότητα ATPάσης; Διάσπαση µε υδρόλυση ATP Σύµπλοκο προεκκίνησης  DnaAàoriC: 1 Προετοιµασία για αντιγραφή DnaB (εξαµερής ελικάση) + DnaC (ελικάση loader) SSB 2 “Σύµπλοκο προεκκίνησης” DnaG (πριµάση)  Ολοένζυµο DNA πολυµεράση III + 3 Σύµπλοκο προεκκίνησης Υδρόλυση ATP στην DnaA Αποδόµηση της DnaA (αποφυγή ενός νέου γύρου αντιγραφής από την αρχή !)  Η αντιγραφή του DNA χρειάζεται πολυµεράσες υψηλής επεξεργασιµότητας E. coli: 4.6x106 bp, αντιγραφή σε