Translasyon Sonrası İşlemler ve Gen İfadesinin Kontrolü (İrfan) PDF

Translasyon ve Sonrası İşlemler ve Gen İfadesinin Kontrolü Prof. Dr. Ali İrfan GÜZEL BŞEÜ-Tıp Fakültesi (Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı) 19 Ocak 2024 Öğrenim Hedefleri Translasyon sırasındaki (Translasyonel) ve sonrasındaki (Posttranslasyonel) önemli olayları açıklar. Yanlış protein katlanmaların nede...

Translasyon ve Sonrası İşlemler ve Gen İfadesinin Kontrolü Prof. Dr. Ali İrfan GÜZEL BŞEÜ-Tıp Fakültesi (Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı) 19 Ocak 2024 Öğrenim Hedefleri Translasyon sırasındaki (Translasyonel) ve sonrasındaki (Posttranslasyonel) önemli olayları açıklar. Yanlış protein katlanmaların neden olabileceği sorunları irdeler. Gen ifadesini tanımlar. Gen ifadesi kontrol düzeylerini sayar ve açıklar. Aktivatör, represör, indücer, co-represör terimlerini açıklar. Operan kavramını açıklar. Lac Operonu örneğinde negatif ve pozitif kontrolü açıklar. Transkripsiyon düzeyini etkileyen dizileri sayar ve etkilerini açıklar. Kromatin yapısının transkripsiyonla ilişkisini açıklar. Translasyonel kontrol mekanizmasını ferritin ve transferrin örnekleri ile açıklar. Translasyon Sırasındaki (Translasyonel) ve Sonrasındaki (Posttranslasyonel) Önemli Olaylardan Bazıları 1. Hem prokaryot hem de ökaryotlarda, sentezlenen proteine translasyon süresince ve sonrasında, doğru bir şekilde katlanma (üç boyutlu yapı kazanma) oluncaya kadar Şaperon (Chaperone) olarak adlandırılan proteinler eşlik eder. ER ve Mitokondriyel şaperonlar da benzer şekilde görev yaparlar. Şaperonların yokluğunda katlanmamış veya kısmen katlanmış polipeptid zincirleri hücre içinde kararsız bir halde kalır. Alzheimer, Parkinson ve Tip 2 diyabet gibi birçok hastalık doğru katlanmamış proteinlerin birikmesiyle ilişkilidir. Bu hastalıkların her birinde özgün proteinler hatalı katlanarak amiloid adı verilen fibröz kümeler oluşturmaktadır. Amiloid fibriller, proteinlerin normal globüler konformasyonlarına karşılık β tabaka yapısı ile karakterize bir durumdadır. 5 2. Translasyon sonrası üç boyutlu yapının oluşumunda ve protein stabilizasyonunda önemli bir yeri olan disülfit bağlarının oluşumu da ancak Protein Disülfit İzomeraz (PDI) olarak adlandırılan bir enzim varlığında (doğru bir şekilde) gerçekleştirilir. 3. Üretilen ve doğru bir şekilde katlanmış olan proteinler taşıdıkları sinyallere göre uygun hücre içi hedeflerine yönlendirilir (tasnif edilir). ER’a hedeflenme: Polipeptit zincirindeki sinyal dizisi SRP tarafından tanınarak translasyon kompleksinin (mRNA + ribozom + tRNA) ER üzerindeki SRP reseptörüne yönlendirilmesini ve üretilen proteinin ER lümenine aktarılmasını sağlar. Bazı durumlarda ise protein serbest ribozomlarda (stoplazmada) sentezlenir ancak taşıdıkları başka bir sinyal dizisi bunların ER’a yönlendirilmesini sağlar. ER zarına ve hücre zarı yapısına katılacak proteinler alfa heliks yapıları ile ER zarına yerleştirilir. Sinyal dizisi Signal peptidase tarafından kesilir. ER’da sentezlenen bir takım proteinler GPI (Glycosyl phosphadidyl inosito) çapaları (anchors) ile zara tutturulur. GPI http://vcell.ndsu.nodak.edu/animations/protei nmodification/movie-flash.htm Lizozomal proteinlerin Golgide işlenmesi: karbonhidrat grupları (özellikle de mannoz 6-fosfat) ilavesi. Proteinlerin ilk modifikasyonları (ör. Glikozilasyon) ER’da yapılır. Gen İfadesinin Kontrolü Hücrelerin taşımış olduğu genetik talimatlar RNA ve protein moleküllerine dönüştürülerek uygulanmaktadır. Bilindiği gibi, genetik talimatların RNA ve protein moleküllerine dönüştürülmesi olayı genel anlamıyla Gen İfadesi (ekspresyonu) olarak tanımlanmaktadır. Hücrelerin davranışlarının primer belirleyicisi taşımakta oldukları genler ve bunların kontrollü bir şekilde ifade edilmesidir. Bir hücrenin davranışının belirlenmesinde yalnızca taşımakta olduğu genetik talimatlar (genler) değil, aynı zamanda bu genlerin hangisinin, ne zaman, ne miktarda ve ne kadar süreyle ifade edileceğini kontrol eden içi ve dış sinyaller gibi birtakım faktörler de etkilidir. Gen ifadesinin kontrolü hücrelerin çevresel değişimlere uyumu ve çok hücreli canlılarda hücre farklılaşmaları sonucu oluşan doku ve organlar ve buralara özgün gen ekspresyonlarının düzenlenmesini de sağlamaktadır. Ör. Kas ve karaciğer hücreleri aynı genoma sahiptir ancak her iki dokudaki hücrelerde eksprese olan gen paternleri oldukça farklılık göstermektedir. Her bir genin kontrolü transkripsiyon aşamasından aktif bir ürün elde edilinceye ve arkasından da aktif ürünün hücre içinde kalış süresine kadarki her aşamada doğrudan veya dolaylı olarak bir takım mekanizmalar tarafından kontrol altında tutulmaktadır. Genetik bilginin taşıyıcısı olan DNA moleküllerinin hücre içindeki durumları bile gen aktivitelerinin kontrolünde başlı başına bir etken olmaktadır. Ör. ökaryotik hücrelerde DNA moleküllerinin çekirdek içinde histon ve nonhiston proteinleri ile kompleks oluşturarak kompakt/sıkı (heterokromatin) veya gevşek (ökromatin) gibi çeşitli organizasyon düzeylerinde bulunuşu o bölgelerdeki çok sayıda genlerin inaktif veya aktif oluşunu da belirlemektedir. Ökaryotik hücrelerdeki bu durumu (heterokromatin ve ökromatin) bir tarafa bırakarak (ayrı bir konu olarak daha sonra bahsedilecek) bireysel anlamda gen/gen gruplarının aktivite kontrollerine baktığımızda, gen kontrol mekanizmaları genel anlamda prokaryotlarda üç, ökaryotlarda ise dört düzeyde incelenebilmektedir: 1.Transkripsiyonel kontrol 2.Post-transkripsiyonel kontrol (prokaryotlarda yok) 3.Translasyonel kontrol 4.Post-translasyonel kontrol Prokaryotlarda gen ekspresyonu kontrol düzeyleri Transkripsiyonel Bakterilerdeki kontrol/regülasyon (aktiviteyi açma-kapama) çoğunlukla bu düzeydedir. Regülatör proteinler (transkripsiyon faktörleri) DNA’ya bağlanarak transkripsiyon miktarını kontrol eder. Attenüasyonda (enfeksiyoz özelliğinin ısı ile zayıflatılması), transkripsiyon faktörlerinin yapısının bozulmasından dolayı transkripsiyon başlayamaz. Translasyonel Translasyonel baskılayıcı proteinler mRNA’ya bağlanır ve translasyonun başlamasını engeller. Antisens RNA mRNA’ya bağlanır ve translasyonu engeller. Post-translasyonel Feedback inhibisyonda; bir metabolik yolağın ürünü yolaktaki ilk enzimi inhibe eder. Protein yapısındaki kovalent madifikasyonlar proteinin fonksiyonunu değiştirebilir. Ökaryotlarda gen ekspresyonu kontrol düzeyleri Transkripsiyonel Düzenleyici transkripsiyon faktörleri transkripsiyonu aktive veya inhibe eder. Kromatinin yapısal durumu (sıkı veya gevşek oluşu) transkripsiyonu etkiler. DNA metilasyonu (genellikle) transkripsiyonu engeller. Post-transkripsiyonel (RNA İşlenmesi) Alternatif splayzing ekzon seçimlerini değiştirir. RNA editing işlemi mRNA’nın baz dizilimini değiştirir. Translasyonel miRNA’lar mRNA’nın translasyonunu engeller. Translasyon başlatma faktörelerinin fosforilasyonu translasyonu düzenleyebilir. mRNA’nın 5’ ucuna bağlanan proteinler translasyonu düzenler. mRNA stabilitesi RNA’ya bağlanma özelliği olan proteinlerle korunabilir. Post-translasyonel Feedback inhibisyonu ve kovalent modifikasyonlar proteinin işlevini düzenler. Gen regülasyonlarının moleküler mekanizması genellikle Negatif ve Pozitif kontrol olarak iki şekildedir. Hem prokaryot hem de ökaryotlarda transkripsiyon kontrolü genel olarak represör (baskılayıcı) ve aktivatör (aktifleştirici) denilen regülatör proteinler tarafından sağlanmaktadır. 1- Represör proteinler: Bunlar RNA polimerazın promotor bölgesine bağlanmasını engelleyerek gen aktivitesinde negatif kontrol sağlarlar 2- Aktivatör proteinler: RNA polimerazın DNA’ya bağlanmasını teşvik ederek (transkripsiyon oranını arttırarak) gen aktivitesinde pozitif kontrol sağlarlar. Negatif Kontrolde/Regülasyonda; Transkripsiyon başlama bölgesine (promotor dizilerine) bir represör (baskılayıcı) protein bağlanana dek gen aktiftir. Bu tür regülasyon represör proteine bağlanabilen ilave ajana göre idüklenebilir (inducible transcription) veya baskılanabilir (repressible transcription): – İndükleyici ajan represöre bağlandığında represör inaktif hale gelir ve transkripsiyon engeli kaldırılır (inducible). İndükleyici ajan represör proteine bağlanma eğilimindedir. Katabolik yolakların çoğunda başlangıçtaki substrat indükleyici ajan olarak görev yapar. Substrat olmadığı zaman enzim sentezlenmez. – Diğer durumda ise represöre bir co-represör bağlanmasıyla aktif bir represör protein oluşur (repressible). Buradaki Co-represör genellikle Anabolik yolaktaki son üründür. Ortamdaki son ürün konsantrasyonu belli bir düzeyin altına düştüğünde engelleme ortadan kalkar. – Aktivatör, represör, indükleyici ve co-represör gibi moleküller çok çeşitli olup gen/gen grupları için farklı olabilir. Pozitif Regülasyonda; Transkripsiyon başlama bölgesine bir aktivatör protein bağlanıncaya dek gen transkripsiyonu yoktur (gen kapalıdır). Aktivatör proteine ilave bir ajan (inhibitör) bağlandığında ise aktivitesi durur. Canlı bir hücrede aslında bu iki tür regülasyon iç içedir ve oldukça da karmaşıktır. Aşağıda represör ve aktivatörlere birtakım ilave moleküllerin bağlanması durumunda bunların aktivitelerine olan etkileri gösterilmektedir: Inducer (indükleyici) Molekül: İndüklenebilir genlerin transkripsiyonuna yardımcı olan küçük bir molekül (ajan) olup etkisini iki şekilde gösterir (a ve b): a) Represöre bağlanır ve onun DNA’ya bağlanmasına engel olur. b) Aktivatöre bağlanır ve onun DNA’ya bağlanmasını sağlar. Corepresör/İnhibitör (engelleyici) Molekül; baskılanabilir genlerde ise, iki çeşit küçük molekül (ajan) olup iki şekilde etki göstererek transkripsiyonu engeller (c ve d): c) Corepresör, represörün DNA’ya bağlanmasını sağlar ve bu şekilde transkripsiyonu engeller (baskılar). d) İnhibitör, aktivatöre bağlanır ve onun DNA’ya bağlanmasını ve dolayısıyla transkripsiyonu engeller (baskılar). Operon Kavramı Operon, birbirine birkaç nükleotitlik aralıklarla bağlı genlerin oluşturduğu gen grubunun adıdır. Prokaryot genomlarının ökaryotlardan farklı bir özelliği operonların varlığıdır. Diğer bütün hücresel faaliyetlerde olduğu gibi gen ifadesinin kontrolüyle ilgili ilk bulgular da bakterilerdeki operonlar ile yapılan çalışmalarından elde edilmiştir. Operondaki genler aynı promotor kontrolündedir ve tek bir mRNA olarak eksprese edilirler. Yani bir genin açılması operandaki diğer genlerin de açılması demektir. E. Coli ’de yaklaşık 600 operon bulunmaktadır. Operondaki genler çoğunlukla ortak bir metabolik görev için işlev görürler fakat bazen de her bir gen bağımsız bir işleve sahip olabilir. Genlerin kontrol mekanizmalarını alamaya örnek olarak en iyi çalışılmış olan iki operon örneği laktoz ve triptofan operonlarıdır. Tipik bir bakteriyel operon; – bir promotör, – bir operatör bölge, – yapısal genler ve bir de – regülatör gen (ör. bir represör protein) olmak üzere dört bölgeden oluşur. İndüklenebilir Operon (Inducible Operon): Lactoz (Lac) Operonu Ortamda laktoz varlığı (allolaktoz) operonun çalışmasını sağlar. Allolaktoz bu operanda inucer (indükleyici, yani laktoz katabolizmasında görev alan genlerin üretilmesine yardımcı) olarak görev alır. http://vcell.ndsu.nodak.edu/animations/lacOperon/movie-flash.htm Baskılanabilir Operon (Reppressible Operon): Triptofan (Trp) Operonu Ortamda triptofan varsa operon çalışmaz. Operondaki genler triptofan biyosentezini gerçekleştiren genlerdir. Triptofan bu operonda co-represör (ortak baskılayıcı) olarak işlev görür. Tipik bir E. coli operon örneği ilk keşfedilen ‘Lactoz (Lac) Operonu’ dur. Laktoz operonu bir disakkarit olan laktozun glukoz ve galaktoza parçalanmasından sorumlu üç gen içermektedir. E. coli, barsak florasında bulunan bir bakteri olup öncelikli olarak glikozu ve gerektiğinde de bir disakkarit olan laktozu ve diğer birtakım molekülleri besin olarak kullanabilmektedir. Ortamda yeterli glikoz yok ancak laktoz varsa operon çalıştırılır, diğer durumda bakteri bu operonu pek de çalıştırmaz. Ör. bir bardak süt içtiğimizde, E. coli hemen laktoz parçalayıcı enzimleri kodlayan genlerini aktive etmekte ve bu şekilde laktozu besin kaynağı olarak kullanabilmektedir. Operonda bulunan üç gen de birlikte eksprese olur ve üç farklı enzim koordineli bir şekilde çalışarak laktozu bakteri tarafından kullanılabilir hale getirir. Operon promotorunun hemen önünde bulunan ve transkripsiyonun başlamasını kontrol eden bölge operatör olarak adlandırılmaktadır. Transkripsiyon represör ve aktivatör proteinler aracılığı ile kontrol edilmektedir. Lac operonu (Laktoz metabolizmasında yer alan genler) ve lacI geni (regülatör/düzenleyici gen) lacI P o lacZ lacY lacA Laktoz metabolizmasını yürüten enzimleri kodlayan genler bir gurup oluştururlar. LacZ (β-Galaktozidaz): Laktozu Galaktoz ve Glukoza parçalar LacY (Laktoz permeaz): Laktozu hücre içine taşıyan bir enzimdir. LacA (Transasetilaz): Rolü netleşmemiştir. lacI geni: Represör bir protein kodlar (düzenleyici bir gendir). Buradaki repressör allosterik bir proteindir yani konformasyonu değiştiğinde fonksiyonu da değişir. Represör, promotorun hemen önünde bulunan operatöre bağlanır. Lac operonunun negatif kontrolü Negatif kontrol: Laktoz yok, represör aktif, operon kapalı (allosterik bir proteindir) Negatif kontrol; Çalışabilen bir sistemin durdurulmasıdır. Lac operonunu durduran faktör lac represörüdür. Represör, operatörü işgal ettiğinde RNA polimerazın promotora bağlanması ve hareketi engellenir. Promotora bağlı RNA polimeraz promotora dizi üzerinde ilerlemez ise operonun yapısal genleri de transkribe edilmeyecektir. Ortamda yeterli glikoz varsa (ve laktoz da yoksa) lac operonunun baskılanması gerekecektir: Bu olay lac operonunun negatif kontrolüdür Laktoz var, represör inaktif: Operon Açık Laktozun varlığında lac operonu üzerindeki baskılama kalkar Laktoz parçalanırken bir kısmı allolaktoza dönüştürülür. Allolaktoz (indükleyici ajan), lac represöre bağlanır. Allolaktoz ile etkileşen lac represörün konformasyonu değişir ve operatöre bağlanma yeteneğini kaybeder: Lac operonundan transkripsiyon gerçekleşir. Bu durum lac operonundaki genlerin gerekli miktarda eksprese olması için yeterli değildir. Operonun aktive edilmeye de ihtiyacı vardır. Lac Operonu Döngüsü (uyarımı ve baskılanması) Lac operonunun pozitif kontrolü Pozitif kontrol negatif kontrolün tersidir. Pozitif kontrolde bir faktör lac operonunun daha fazla çalışmasına neden olur. Laktozun varlığında, lac operonunun negatif kontrolü üzerindeki baskı kalkar ama pozitif bir kontrol mekanizması yoksa yeterli miktarda ekspresyon gerçekleşmez. Ortamda glikoz ve laktoz varlığında Lac operonunun pozitif kontrolü glikoz konsantrasyonuna bağlıdır. Glikoz konsantrasyonu düşerse lactoz operonunun pozitif kontrolü aktive olur, şöyle ki; ‐ Glikoz konsantrasyonunun azalması siklik AMP (cAMP) konsantrasyonunun artmasına neden olur. ‐ cAMP, CAP (catabolic activator protein) veya CRP (cAMP reseptör protein) proteinine bağlanarak bir kompleks oluşturur. ‐ cAMP-CAP kompleksi lac promotoruna bağlanır ve RNA polimerazın promotora bağlanmasını teşvik ederek lac operonunu aktive eder: Bu durum lac operonunun pozitif kontrolü olarak adlandırılır. Bakterilerde ATP’yi cAMP’ye çeviren adenilil siklaz enzimi, glikoz düzeyi düştüğünde cAMP düzeyinin artmasını sağlar. Daha sonra cAMP, katabolit aktivatör protein (CAP) denilen ve trankripsiyonu kontrol eden bir proteine bağlanır ve oluşan kompleks RNA polimerazın promotöre bağlanmasını sağlar. Böylece laktoz operonu aktive olarak laktoz parçalayıcı enzimleri kodlayan genler transkribe edilir. Bakteri hücresinde glikoz miktarının düşmesi cAMP miktarının artmasına neden olur. cAMP lac operonunun aktivasyonunu tetikler.  Allolaktoz represör proteini inaktive eder. Glikoz konsantrasyonu yüksekse cAMP konsantrasyonu düşük olacaktır. RNA polimerazın lac promotoruna tercihli bağlanması yok. Represör protein allolaktoz tarafından inhibe edilir (ortamda hem glikoz hem de laktoz vardır). cAMP olmadığı için CAP proteini inaktifdir. Sonuç: Lac operonunun pozitif kontrolü yok. Özetle; Ortamda laktoz yoksa; represör protein operatöre bağlanır ve RNA polimerazın promotora bağlanmasını önler. Böylece gen transkribe olmaz yani baskılanır (enzim sentezlenmez). Ortamda laktoz varsa; laktoz, represör proteine bağlanarak onun yapısını değiştirir ve operatöre bağlanmasını önler, dolayısıyla RNA polimeraz promotora bağlanır ve gen transkribe olur (enzim sentezlenir). Represör protein negatif kontrol mekanizmasının bir parçasıdır, çünkü laktoz metabolizmasıyla ilgili genlerin transkripsiyonunu önlemektedir. Ortamda laktoz bulunmadığı zaman represör protein, operatör bölgeye bağlanır ve genin transkripsiyonunu bloke eder. Sonuç olarak; gerekli olmadığı zaman (ortamda laktoz yoksa) laktoz parçalayıcı enzimleri ekprese eden genler de üretilmez. Ökaryotik Hücrelerde Gen İfadesi Kontrol Düzeyleri Ökaryotik hücrelerde gen ekspresyonu primer olarak üç düzeyde gerçekleşir: 1) Transkripsiyonel düzeyde kontrol 2) Post-transkripsiyonel (prosessing, işleme) düzeyde kontrol 3) Translasyonel düzeyde kontrol 1. Transkripsiyonel Kontrol Ökaryotik hücrelerde gen ekspresyonun kontrolü, bakterilere göre çok daha karmaşık olmakla birlikte, aynı temel ilkeler burada da geçerlidir. Ökaryot genlerinin ekspresyonu, transkripsiyon esnasında düzenlenmekle birlikte, öncelikle transkripsiyonun başlama aşamasında kontrol edilmektedir. Bakterilerde olduğu gibi ökaryotik hücrelerde de transkripsiyon, özgün düzenleyici DNA dizilerine bağlanan ve RNA polimerazın aktivitesini ayarlayan proteinler (transkripsiyon faktörleri) tarafından kontrol edilir. Prokaryotik ve ökaryotik hücreler arasında, transkripsiyonun düzenlenmesi açısından önemli bir fark; ökaryot DNA’sının kromatine paketlenmesi sonucu, transkripsiyon için kalıp olarak kullanılabilirliğinin sınırlanmasıdır. Bu nedenle kromatin yapısındaki değişiklikler, ökaryotik hücrelerde transkripsiyon kontrolünde anahtar rol oynamaktadır. Transkripsiyon Düzenleyici Proteinler ve Dizileri: Konunun başında aktivatör ve represör olmak üzere iki tip transkripsiyon düzenleyici proteinden bahsetmiştik. 1- Aktivatör Proteinler: Bu proteinler genellikle DNA’ya bağlanma bölgesi ve aktivasyon bölgesi olmak üzere iki bölgeden oluşurlar. Transkripsiyonel aktivatörlerin işleyişi Ökaryotik aktivatörler transkripsiyonu iki mekanizma ile uyarırılar: Mediatör proteinler ve genel transkripsiyon faktörleri ile etkileşime girerek transkripsiyon kompleksi oluşumunu hızlandırır, Kromatin yapısını modifiye ederek transkripsiyonu kolaylaştıran yardımcı aktivatörlerle etkileşime girer. DNA’ya bağlanma bölgesi, transkripsiyon faktörünün doğru yere sıkıca bağlanmasını sağlar. Transkripsiyonu uyarır Genel transkripsiyon faktörleri ve mediatör protein 2- Represör proteinler: Ökaryotik hücrelerde gen ekspresyonu, transkripsiyon aktivatörleriyle olduğu kadar, represör proteinlerle de düzenlenmektedir. Represörler, özgün DNA dizilerine bağlanarak transkripsiyonu iki şekilde A) Bazı represör proteinler, genin inhibe edebilirler. promotor ya da güçlendirici dizilerine bağlanarak, aktivatör proteinlerin bu bölgelere bağlanmasını engellerler. Sonuçta RNA polimerazın promotor bölgeye bağlanması engellendiği için transkripsiyon bloke edilir. B) Birçok represör protein, protein-protein etkileşimleri yoluyla transkripsiyonu inhibe eder. Burada represör, genin promotor bölgesine bağlanır ve DNA’ya bağlanmış olan diğer transkripsiyon faktörlerine tutunarak proteinprotein etkileşimleri yoluyla transkripsiyonu engeller. Transkripsiyon Düzeyini Etkileyen Diziler Aşağıda ökaryotik gene ait promotor dizileri görülmektedir. Memeli hücrelerindeki genlerin çoğu bu dizilere ilave birtakım düzenleyici diziler tarafından kontrol edilmektedir. a) Enhancers (Güçlendiriciler) b) Silencers (Susturucular/Zayıflatıcılar) Bu diziler promotor bölgesinin her iki tarafında ve uzak mesafelerde (10 Kb gibi) yerleşmiş olabildiği gibi yönleri de farklı olabilmektedir. Enhancer dizilerine aktivatör proteinler, silencer dizilerine ise represör proteinler bağlanır Gen Aktivasyonu Gen Baskılanması Enhanserların Transkripsiyona Etkisi Enhenserların etkisi Enhenser olmadığı durumlarda gen düşük bir miktarda transkribe olur. Enhenserların gen bölgesinin illaki upstream’de olması gerekmez, kilobazlarca uzaklıklarda ve upstream veya downstream’de olması ve yönü önemli değildir. DNA’nın halka/ilmik (loop) oluşturması Uzak mesafelerdeki enhanser dizilerine bağlanan aktivatör proteinler DNA’nın ilmik (loop) oluşturmasıyla promotor bölgesindeki bazal transkripsiyon faktörleri ile etkileşime girebilir. Bu durumda transkripsiyon faktörlerinin promotor bölgesinin yakın veya uzağına bağlanmış olması da fark etmez. Her bir enhancer kendi hedef geninin promotoruna özgündür. Kromatin Yapısının Transkripsiyonla İlişkisi Ökaryotlarda aktivatör ve represör proteinlerin her ikisi de transkripsiyonu, yalnız transkripsiyon sisteminin diğer bileşenleri ile etkileşerek değil, aynı zamanda kromatin yapısında oluşturdukları değişikliklerle de düzenlemektedirler. Ökaryot hücre DNA’sı nükleus içerisinde histon ve non-histon proteinleri ile kompleks haldedir. Bu yapıda histon proteinleri özellikle önemlidir. Kromatinin temel yapısal birimi nükleozomdur. Kromatin daha sonra, büyük DNA ilmekleri oluşturmak üzere, üst düzey katlanmalarla daha ileri düzeyde yoğunlaşır (heterokromatin yapı). Ökaryotik DNA’nın kromatine paketlenmesi, transkripsiyon için kalıp olarak kullanılabilme koşullarını önemli ölçüde etkilediğinden, kromatin yapısı ökaryot hücrelerde gen ekspresyonunun önemli bir düzeyidir. Ökromatin Heterokromatin Ökaryotik hücrelerde çok sayıda genler kromatin düzeyinde aktive/inaktive edilebilmektedir: Ökromatin (Eukromatin -E-): Kromatin ağının gevşek olduğu ve üzerindeki genlerin aktif olduğu (ekspreseyonun yapıldığı) yerler. Hetrokromatin (H): Kromatin ağının sıkı olduğu (üzerindeki genlerin eksprese edilmediği) ve bu nedenle de daha fazla boyanarak koyu renk aldığı yerler. Her dokunun hücrelerinde ökromatin/heterokromatin dağılımı farklıdır. Histon proteinlerinin asetillenmesi net pozitif yükünü azaltarak, hem DNA’ya bağlanmalarını hem de diğer proteinlerle etkileşimlerini zayıflatabilir. Ayrıca histonların asetillenmesi, transkripsiyon faktörlerinin DNA’ya bağlanmasını kolaylaştırmaktadır. Kromatinin transkripsiyonel aktivitesi, histon kuyruklarındaki özgül amino asitlerin asetillenmesine ek olarak, metillenmesi ve fosfatlanmasıyla da etkilenir. Histon Asetil Transferaz (HAT): Histonlara asetil grupları ilave ederken deasetilaz (HDAC) asetil gruplarını uzaklaştırır. Kodlamayan RNA’ların Kromatin Oluşumuna Katkısı; Barr Cismi Örneği Kodlamayan RNA’ların, bazı kromozom bölgelerinde kromatin yoğunlaşmasına ve heterokromatin oluşumuna öncülük eden bir histon modifikasyonuna neden olarak, transkripsiyonun baskılanmasında önemli rol oynadığı gösterilmiştir. X kromozomuna özgün bu heterokromatin oluşumu ve kromozom inaktivasyonu, kodlamayan RNA’ların memelilerdeki gen ekspresyonunun düzenlenmesinde oynadıkları role bir örnektir. X kromozomu XIC bölgesinde bulunan Xist olarak adlandırılan düzenleyici bir genden kodlanan xistRNA’lar X kromozomu üzerine bağlanıp onu kaplayarak hemen hemen tamamının inaktif hale gelmesine neden olurlar (Barr Cismi oluşur). (Barr Body) DNA Metillenmesi Transkripsiyonun kontrolünde kromatin yapısı ile ilişkili diğer bir mekanizmadır. DNA’daki Sitozin (C) nükleotidleri, 5. karbon pozisyonuna metil gruplarının takılmasıyla modifiye edilebilir. DNA zincirinde G’lerden önce yer alan C’ler spesifik olarak metillenir (CpG dinükleotidleri). Bu metillenme, promotorların yakınlarında yüksek sıklıkta CpG dinükleotidi içeren genlerin transkripsiyonel aktivitelerinin azaltılması ile ilişkilidir. Metillenme, bu genlerin transkripsiyonunu hem bazı transkripsiyonel aktivatörlerin bağlanmasını engelleyerek, hem de metillenmiş DNA’ya özgün olarak bağlanan represörlerin daha kolay bağlanmasını sağlayarak engeller. CpG island Methylated CpG island DNA’daki metilasyon aktivatör proteinin bağlanmasını engeller. 2. Post-transkripsiyonel (Transkripsiyon sonrası) Kontrol Genin RNA transkriptinin (özellikle mRNA) transkripsiyon başlangıcından translasyon başlangıcına kadarki sürede uğradığı değişimleri içermektedir. Bunlar arasında önemli ve iyi çalışılmış olanlar şu şekildedir: o Transkripsiyonun hemen başlangıcında 5’ başlık ilavesi (RNA’yı 5’ ekzonükleaz aktivitesinden korur). o Transkripsiyon tamamlandıktan sonra poli-A kuyruğu ilavesi (kuyruk uzunluğu RNA’nın stabilitiesi ve translasyon verimiyle ilişkilidir). Hatırlanacağı gibi, yumurta hücrelerinde mRNA’ların kısa poli-A kuyrukları ile depolanması da buna bir örnektir. o Alternatif Splicing ve o mRNA Editing. Bu gibi işlemler hem RNA stabilitesini hem de çeşitliliği sağlayan transkripsiyon sonrası gen kontrolünde görev alan birtakım kompleks mekanizmalardır. Alternatif Splicing: Bir genin primer RNA transkriptindeki ekzonlarının farklı doku/organlarda farklı kombinasyonlarda bir araya getirilmesiyle farklı proteinler üretilmesi işlemidir. Pre-mRNA RNA Düzeltme (RNA Editing) RNA splicing’den farklı olarak, RNA düzeltme, bazı mRNA’ların protein kodlayan dizilerini değiştiren RNA işlenmesi olaylarını kapsamaktadır. RNA düzeltme, baz modifikasyonu reaksiyonları sonucu oluşan, tek baz değişikliklerini kapsamaktadır. RNA düzeltme reaksiyonları, Citozinin→ Uridine ve Adenozinin→ Inozine deaminasyonunu içerir. En iyi bilinen örneklerden biri, kanda lipidleri taşıyan apolipoprotein B (Apo-B) mRNA’sının düzeltilme işlemidir. Burada, doku spesifik RNA düzeltme, Apo-B’nin iki farklı formunu oluşturur. İnsanlarda, 4536 amino asitten oluşan Apo-B100 proteini düzeltilmemiş mRNA’nın translasyonu ile karaciğerde sentezlenmektedir. Ancak, 2152 amino asitten ibaret, daha kısa bir protein olan Apo-B48, C’in U’e değiştiği düzeltilmiş mRNA’nın translasyonu ile barsaklarda sentezlenmektedir. Bu değişim, düzeltilmemiş mRNA’daki glutamin kodonunu (CAA), düzeltilmiş mRNA’da stop kodonuna (UAA) dönüştürerek, daha kısa ApoB48 proteininin sentezine yol açar. Apo-B mRNA’sının dokuya özgün düzeltme işlemi böylece, karaciğer ve barsakta yapısal ve fonksiyonel olarak farklı proteinlerin ekspresyonu ile sonuçlanır. Karaciğerde üretilen tam uzunluktaki ApoB100 dolaşımda lipidleri taşır, düzeltilmiş Apo-B48 ise diyetle alınan lipidlerin barsaklarda emiliminde işlev görür. 3. Translasyonel Kontrol Translasyona hazır olan RNA molekülleri üzerinde dupleks yapı oluşturulması sonucu bloklanma veya parçalanma gibi bir takım mekanizmalarla translasyonu engellenebilmekte ve bu şekilde protein üretimi kontrol altına alınabilmektedir: Hücrelerde bu amaçla en sık kullanılan mekanizma miRNA aracılı mekanizmalardır. Bu mekanizmada; küçük RNA molekülleri hedef mRNA’ları üzerindeki 20-50 nükleotitlik küçük bir homolog bölgede nükleotitler arası baz eşleşmesi (RNARNA) prensibi ile dubleks yapılar oluşturur. RNA moleküllerindeki bu yapılar ya molekülün RNazlar tarafından parçalanmasına neden olarak ya da ribozomların ilerlemesini engelleyerek translasyonun bitmesine/durmasına neden olur. Deneysel ve tedavi amaçlı birtakım çalışmalarda bu mekanizmaya benzer şekilde sentetik olarak hedefe yönelik küçük RNA/tek iplikli DNA molekülleri (antisens nükleik asitler) hazırlanarak da istenen gen ürününün translasyonu engellenebilmektedir (bu mekanizmalar RNA İnterferans konusunda detaylandırılacaktır). Bu yöntemde, hedef genin mRNA’sına eşlenik olan RNA ya da tek iplikli DNA (antisens) hücre içine aktarılır. Bu antisens DNA ya da RNA, eşleniği olan mRNA ile hibridize olur ve mRNA’nın yıkımına yol açarak veya ribozomun ilerleyişini durdurarak proteine çevrimini engeller. Translasyon kontrolünde yer alan mekanizmalardan biri de, represör moleküllerin özgün mRNA dizilerine 5’ ve 3’ UTR bölgelerinde (Figure 10.8) bağlanarak translasyonu durdurmasıdır. Bu mekanizmaya örnek olarak, hücre içinde demir depolayan bir protein olan ferritin ve hücre içine demir alımını sağlayan transferrin sentezinin düzenlenmesi verilebilir: a) Ferritin sentezinin düzenlenmesi Ferritin mRNA’sının translasyonu, ortamda bulunan demir tarafından düzenlenmektedir. Eğer ortamda fazla miktarda demir mevcutsa, daha fazla ferritin sentezlenmektedir. Bu düzenleme, translasyonu durdurmak üzere, ferritin mRNA’sının proteine çevrilmeyen 5’ bölgesindeki (5’-UTR bölgesi) nükleotid dizisine (demir yanıt elemanı= iron response element=IRE) bağlanan protein (IRE-BP) adlı bir represör protein aracılığı ile gerçekleştirilir. Hücre içinde demir var (depolamak için daha fazla ferritine ihtiyaç var) Demir varlığında IRE-BP, IRE’ye bağlanamaz ve ferritin translasyonu devam eder. Ortamda demir yoksa, IRE-BP, IRE’ye bağlanır ve translasyonu durdurur. Hücre içinde demir yok (depo proteini olan ferritine ihtiyaç yok) b) Transferrin sentezinin düzenlenmesi Hücre içinde demir yeterli (transferrin sentezine gerek yok) Transferrin reseptör mRNA’sının stabilitesi, proteine çevrilmeyen 3’ bölgesine bağlanan bir protein tarafından düzenlenir. Ferritin ve transferrin reseptör mRNA’larının her ikisinin de IRE bölgelerine aynı protein (IRE-BP) bağlanır fakat proteinin, iki farklı mRNA’nın IRE bölgelerine bağlanmasının sonuçları oldukça farklıdır. Transferrin reseptörü mRNA’sının 3’ IRE bölgesine IRE-BP bağlanması, translasyonu inhibe etmek yerine mRNA’yı yıkımdan korur. Hücre içinde demir az (daha fazla transferrine ihtiyaç var) Transferrin reseptörü ve Ferritin mRNA kontrolü 3’ IRE’ye IRP bağlanması mRNA’yı stabilize eder ve daha fazla transferrin reseptörü sentezlenir. 5’ IRE’ye IRP bağlanması mRNA’nın ribozoma bağlanmasını engeller ve ferritin sentezi durur. (Demir az) IRP serbest durumda iken IRE’ye bağlanmaktadır. Hücre de yeterli demir iyonu varlığı IRP’nin demir bağlamasına ve böylece mRNA’daki IRE’ye bağlanmasına engel olur. (Demir fazla) Ferritin ve transferrin reseptör mRNA’larının her ikisinin de IRE bölgelerine aynı protein (IRE-BP) bağlanır fakat proteinin, iki farklı mRNA’nın IRE bölgelerine bağlanmasının sonuçları oldukça farklıdır. Transferrin reseptöründe IRE’ye protein bağlanması, translasyonu inhibe etmek yerine mRNA’yı yıkımdan korur. IRE dizisi, transferrin reseptör mRNA’sında 3’ uçta, ferritin mRNA’ sında ise 5’ uçta bulunmaktadır. Sonuçta, mRNA üzerindeki farklı bölgelere aynı düzenleyici proteinin bağlanması, gen ekspresyonu üzerinde farklı etkiler gösterir. Transferrin Reseptör mRNA 4. Post-translasyonel kontrol Daha önceki önceki derste anlatılan, translasyon sonrası protein üzerinde yapılan ve aktivitesini etkileyen bütün modifikasyonlar (ER ve Golgideki modifikasyonlar gibi) ve feedback inhibisyonu (gen ekspresyonunun ürün miktarına bağlı engellenmesi) post translasyonel kontrole dahildir.