7-Gen İfadesi-Transkripsiyon (EBUBEKİR) (2 saat) PDF

GEN İFADESİNDEKİ TRANSKRİPSİYON SÜRECİ Prof. Dr. Ali İrfan GÜZEL Doç. Dr. Ebubekir DİRİCAN BŞEÜ-Tıp Fakültesi (Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı) 12.01.2024-CUMA (10.30) Gen İfadesi/Ekspresyonu (Gene Expression) A) Transkripsiyon B) Translasyon P https://highered.mheducation.com/sites/9834 092339/student...

GEN İFADESİNDEKİ TRANSKRİPSİYON SÜRECİ Prof. Dr. Ali İrfan GÜZEL Doç. Dr. Ebubekir DİRİCAN BŞEÜ-Tıp Fakültesi (Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı) 12.01.2024-CUMA (10.30) Gen İfadesi/Ekspresyonu (Gene Expression) A) Transkripsiyon B) Translasyon P https://highered.mheducation.com/sites/9834 092339/student_view0/chapter15/simple_gen e_expression.html Gen Replikasyon DNA Revers Transkripsiyon Transkripsiyon Heterojen RNA Splicing (işleme) Kodlanan RNA (mRNA) Kodlanmayan, yapısal veya fonksiyonel RNA molekülleri (ncRNA) Translasyon Protein Şekil: Santral (central) Dogma; Genetik bilginin akış şeması GEN İFADESİ, TRANSKRİPSİYON VE TRANSLASYON KAVRAMLARI NE ANLAMA GELMEKTEDİR? Hücrelerin taşımış olduğu genetik talimatlar RNA ve protein molekülleri aracılığı ile uygulanmaktadır. Genetik talimatların RNA ve protein moleküllerine dönüştürülmesi olayı genel anlamıyla Gen İfadesi (ekspresyonu) olarak tanımlanmaktadır. Hücrelerin davranışlarının primer belirleyicisi taşımakta oldukları genler (genetik talimatlar) ve bunların kontrollü bir şekilde ifade edilmesidir.  Genlerin hangisinin, ne zaman ve ne miktarda ifade edileceği de son derece önem taşımaktadır. Gen ifadesindeki ilk basamak DNA bilgisinin (gen) RNA molekülüne dönüştürülmesidir, bu olay transkripsiyon, yazılım veya aktarım olarak ifade edilmektedir. Bu işlemle üretilen çok sayıda değişik RNA molekülleri çok farklı işlevleri yerine getirmektedir. Bu işlemi mRNA’nın proteine çevrilmesi (translasyon) takip eder.  TRANSKRİPSİYON, prokaryotlarda hücrede herhangi bir bölgede bulunan DNA üzerinde, ökaryotlarda nükleus ve mitokondri de gerçekleşir.  Ökaryotlarda mRNA ve tRNA nükleusta, rRNA nükleolusta (çekirdekçikte) sentezlenir.  Prokaryotlarda 1 adet, ökaryotlarda 3 adet RNA Polimeraz vardır. REPLİKASYON ve TRANSKRİPSİYON ARASINDAKİ BENZERLİKLER ve FARKLILIKLAR NELERDİR? REPLİKASYON VE TRANSKRİPSİYON ARASINDAKİ BENZERLİK VE FARKLILIKLAR 1. Replikasyon hücrenin bölünmeye hazırlandığı S fazda gerçekleşirken, transkripsiyon protein sentezine ihtiyaç duyulduğu zamanlar olan G1 ve G2 de meydana gelir. 2. Replikasyonda genomun tamamı kopyalanırken, transkripsiyonda genom üzerinde sadece belirli gen bölgelerine ait RNA kopyaları oluşturulur (Gelişim gereksinimleri, fizyolojik ihtiyaçlar ve çevresel değişikliklere yanıt olarak.) 3. Replikasyonda genomun tamamı kopyalandığı için uzun DNA zincirleri sentezlenir ve yeni sentezlenen DNA zinciri hidrojen bağları ile kalıp DNA’sına bağlıdır (DNA: DNA hibrid). Bununla beraber transkripsiyonda belirli gen bölgeleri üzerinden sentez yapıldığı için nispeten kısa RNA zincirleri sentezlenir (DNA: RNA hibrid) ve transkripsiyona uğrayan RNA daha sonra kalıp zincirinden ayrılır. Replikasyonda A-T, G-C baz eşleşmesi yapılırken transkripsiyondaki baz eşleşmeleri A-U, G-C şeklindedir. REPLİKASYON VE TRANSKRİPSİYON ARASINDAKİ BENZERLİK VE FARKLILIKLAR 4. Replikasyonda orijinal dsDNA molekülünden birbirinin aynısı olan 2 molekül dsDNA üretilirken, transkripsiyonda dsDNA kullanılarak ssRNA elde edilir ve elde edilen ürünler arasında mRNA,tRNA, rRNA ve microRNA gibi non-coding RNA molekülleri yer almaktadır, 5. Replikasyonda genetik bilgi bir sonraki jenerasyona miras olarak aktarılırken, transkripsiyonda bilgi genden proteine transfer edilir. 6. Her iki işlemde de kalıp olarak dsDNA kullanılır. Replikasyonda her iki DNA zinciri kalıp görevi görürken, transkripsiyonda sadece tek zincir DNA kalıp görevi görür. 7. Replikasyon işleminden sorumlu temel enzim DNA polimeraz, transkripsiyon işleminden sorumlu olan temel enzim ise RNA polimerazdır. DNA polimeraz enziminin proofreading aktivitesi vardır. RNA polimeraz enziminin proofreading aktivitesi yoktur. Replikasyonun gerçekleşebilmesi için topoizomeraz, helikaz, primaz, DNA ligaz ve DNA polimeraz I, II, III enzimleri gerekli iken transkripsiyonda gerekli olan enzimler sadece transkriptaz (bir tip DNA helikaz) ve RNA polimeraz’dır. REPLİKASYON VE TRANSKRİPSİYON ARASINDAKİ BENZERLİK VE FARKLILIKLAR 8. DNA polimeraz enzimi replikasyonu başlatabilmek için kendisine serbest 3’OH grup sağlayan primerin varlığına ihtiyaç duyarken RNA polimeraz enzimi bir primerin varlığına ihtiyaç duymadan sentezi kendisi başlatabilir. Her iki enziminde sentez yönü 5’→3’. Her iki işlemde de birbirine komşu nükleotitler arasında fosfodiester bağı kurulur. 9. Replikasyonda öncül olarak dNTP molekülleri (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) kullanılırken, transkripsiyonda NTP’ler (ATP,UTP,GTP,CTP) kullanılır. TRANSKRİPSİYON HANGİ AŞAMALARDAN OLUŞUR? TRANSKRİPSİYON BASAMAKLARI Başlangıç – Genin 5’ ucundan – RNA polimeraz promotora bağlanır. – DNA çift zinciri ayrılır. Uzama – Nükleotidler 3’ uçtan ilave olur. – GTP’den enerjisini sağlar. Sonlanma – Genin 3’ ucunda gerçekleşir. Prokaryotlarda transkripsiyon süreci PROKARYOTLARDA VE ÖKARYOTLARDA mRNA‘YI OLUŞTURAN GENLER ARASINDA NASIL BİR FARK VARDIR? Prokaryotik ve Ökaryotik mRNA (polisistronik vs monosistronik)  Prokaryotlarda mRNA polisistroniktir.  Polisistronik mRNA moleküllerini oluşturan gen kümeleri OPERON (tek bir promotor tarafından kontrol edilen ve tek bir metabolik yolda aktivite gösteren enzimleri üreten gen kümeleri) olarak isimlendirilen tek bir transkripsiyon ünitesidir. Operonda yer alan her bir gen mRNA’da temsil edilir. Ancak mRNA molekülünün her bir bölümü bağımsız translasyona uğrar.  Ökaryotlarda mRNA molekülü MONOSİSTRONİK’dir, yani tek bir mRNA sadece tek bir polipeptit kodlar. TRANSKRİPSİYONDA KALIP OLARAK HANGİ İPLİK KULLANILIR? Transkripsiyon Kalıbı (DNA’nın iki ipliğinden biri?) Herhangi bir genin transkripsiyonu göz önüne alındığında; ilk olarak DNA molekünü oluşturan zincirler birbirinden ayrılır ve ayrılan zincirlerden biri RNA sentezi için kalıp görevini üstlenir. RNA polimeraz DNA’ya bağlanır ve onun üzerinde kayarak DNA molekülüne komplementer RNA zinciri sentezlenir (eşlenme A-U ve G-C şeklinde olur). RNA polimeraz DNA üzerinde ilerledikçe DNA çift sarmalını açar ve arkadaki transkribe olan kısım yeniden sarmal halini alır.  RNA sentezi de 5’3’ yönündedir (Kalıp DNA 3’ 5’ yönünde okunur). 3’ 5’ 5’ 3’ 5 3 5’ 3’  Transkript ve kalıptaki nükleotidler komplementerdir. Kalıp zincir kodlanmayan iplik (antisens veya non-coding strand) olarak tanımlanırken, RNA transkripti ile aynı (yalnızca T yerinde U olan) diziye sahip karşı zincir anlamlı (sense) veya kodlanan zincir (coding strand) olarak tanımlanır (karşı zincirin benzeri sentezlendiği için bu şekilde bir tanımlama yapılmaktadır). Sense (anlamlı) DNA ipliği/zinciri (Kodlanan iplik) (Kalıp iplik) Non-sense (anlamsız) veya non-coding (kodlanmayan) DNA ipliği  RNA sentezi de 5’3’ yönündedir (Kalıp DNA 3’ 5’ yönünde okunur). RNA POLİMERAZLARIN GENEL ÖZELLİKLERİ NELERDİR? RNA polimeraz RNA sentezinden sorumlu başlıca enzim olan RNA polimeraz, DNA kalıbına komplementer (eşlenik) olarak ribonükleotid trifosfatların (NTP:Nükleozittrifosfatlar) polimerleşmesini katalizlemektedir.  RNA polimeraz (DNA polimerazda olduğu gibi) RNA zincirinin uzamasını daima 5’3’ yönünde katalizler. ***Ancak, DNA polimerazdan farklı olarak, RNA zincirinin uzaması için bir primere ihtiyaç duymaz!!!  Prokaryotlarda bütün genlerin transkripsiyonundan sorumlu bir çok alt üniteden oluşan tek tip RNA polimeraz varken, ökaryotlarda her biri farklı gen gruplarının transkripsiyonundan sorumlu olan 3 tip RNA polimeraz vardır.  Bakteriyel bir RNA polimeraz; 2, , ’,  (omega) ve  (sigma) olarak isimlendirilen 6 alt birimden oluşmaktadır ( biriminden iki adet ). RNA polimeraz E. colide bütün genler 2, , ’,  (omega) ve  (sigma) alt ünitelerini içeren tek bir RNA polimeraz enzimi tarafından transkribe olur. Bu beş alt üniteden oluşan enzim holoenzim olarak adlandırılır.  (sigma) alt ünitesi holoenzimin RNA sentezini başlatabilmesi için DNA üzerinde uygun bölgeyi (promotoru) tanımasını sağlar. Ancak transkripsiyon başlamasından hemen sonra RNA polimerazdan ayrılır. Enzimin geri kalan kısmı çekirdek enzim olarak bilinir.  Çekirdek enzim tek başına RNA zincirinin uzamasını katalize eder. E. coli RNA polimerazı: Tam enzim, altı alt birimden oluşur; 2 tane , , ’,  (omega) ve  (sigma).  alt birimi göreceli olarak zayıf bağlanır ve çekirdek polimerazı oluşturan diğer beş alt birimden ayrılır. (Transkripsiyon kabarcığı) NTP ların (RNA nükleotitlerinin) giriş yeri (DNA ikili sarmalının tekrar oluşumu) (DNA’nın açılması) (Kalıp iplik) (Transkripsiyon yönü) RNA polimeraz-DNA kompleksi PROKARYOTLARDA TRANSKRİPSİYON NASIL BAŞLAR? Başlama Aşaması RNA polimeraz, DNA ile bağlantılar oluşturabilen büyük bir proteindir.  RNA sentezinin doğru olarak başlaması için, RNA polimeraz ilk önce DNA üzerinde uygun bölgeyi tanımak zorundadır.  DNA üzerinde RNA polimerazın bağlandığı bu özel dizilere sahip bölgeler promotor olarak adlandırılır. Farklı organizmalarda birçok farklı promotor dizileri saptanmıştır. PROMOTORUN ÖZELLİKLERİ  RNA polimeraza talimat veren; bahsi geçen herhangi bir gen için, DNA üzerinde daima aynı noktadan RNA sentezini başlatan sekans PROMOTOR sekansıdır. PROMOTOR sekansı;  DNA molekülünün kodlama zinciri üzerinde  5’3’ yönünde tanımlanmaktadır ve  Bakteriyel promotor, transkripsiyona uğrayacak bölgenin hemen yukarısında (5’) yer alır.  ***Transkripsiyonun başlaması için doğru yerin tanınmasında  alt birimi gereklidir.  İşlevsel bir RNA’nın sentezi, genin başlangıç noktasından başlamak zorunda olduğu için, başlangıç yerinin seçimi, transkripsiyon için oldukça kritikdir.  RNA polimerazın genin transkripsiyonunu başlatmak için bağlandığı spesifik DNA dizisine promotor adı verilmektedir. Yapılan çalışmalar transkripsiyon başlangıç noktasının ön tarafında (upstream) yer almakta olan bu promotör bölgenin, prokaryotlarda ve ökaryotlarda farklı grup nükleotid dizisine sahip olduğunu ortaya koymuştur. David Pribnow, E. coli'den beş genin promotor bölgelerindeki sekansları karşılaştırarak bunu test etti.  Her birinde korunmuş nükleotid dizileri buldu ve Pribnow kutusu olarak isimlendirdi.  PROMOTOR bölgesi: Transkripsiyonel kontrol için kilit noktadır ve E. coli RNA polimeraz tarafından tanınan tipik prokaryotik PROMOTOR bölgesi yaklaşık 40 nükleotit uzunluğunda olup farklı tipte korunmuş sekanslar içermektedir. David Pribnow Transkripsiyonun başladığı noktada, STARTPOINT, neredeyse her zaman pürin bazı (sıklıkla adenine) bulunmaktadır. +1 pozisyonu: mRNA’nın ilk nükleotidini kodlayan kalıp DNA üzerindeki nükleotit pozisyonu Startpoint’in yaklaşık 10 nükleotid yukarısında kalan ve TATAAT şeklindeki 6 nükleotitden oluşmuş sekans -10 SEKANS veya PRİBNOW KUTUSU veya TATA KUTUSU olarak isimlendirilmektedir.  Bu bölge RNA polimeraz enziminin tanıma ve bağlanma bölgesidir.  Startpoint’in yaklaşık 35 baz yukarısında kalan ve TTGACA şeklindeki 6 nükleotitden oluşmuş sekans -35 SEKANS olarak isimlendirilmektedir. RNA polimeraz enziminin tanıma ve bağlanma bölgesidir. Arada kalan bölgedeki baz sekansı önemli değildir, ancak bu mesafe oldukça kritiktir (16-18 bplik uzunluk)  -10 ve-35 sekansları (ve bunların startpoint’e göre pozisyonları) evrim esnasında korunmuştur, ancak tüm bakteriyal promotorlarda veya tek bir genomdaki tüm promotorlarda aynı değildir. Verilen sekanstaki her bir pozisyonda müşterek nükleotit içeren sekanslar: konsensüs sekans Transkripsiyonun başlangıç (initiation) aşamasında tanımlanmış 3 basamak bulunmaktadır. 1. Kapalı kompleks yapının oluşumu (closed complex): Polimeraz enzimin promotor bölgesine ilk defa bağlanması DNA çift zincir varlığını muhafaza eder. Enzim heliks yapısının tek bir yüzüne bağlanır. 2. Açık kompleks yapının oluşumu (open complex): Başlangıç bölgesinin (+1 site) etrafında yaklaşık 14 bp’lik (-11’den +3) bir bölgede DNA denatüre olur ve zincirler birbirinden ayrılarak replikasyon balonu oluşur. 3. Promotordan ayrılması (Stable ternary complex): Enzim promotor bölgesinden ayrılır. Elongasyon (uzama) fazına geçilir. Prokaryotik RNA polimerazın promotor bölgeyi bulup yerleşmesi ve transkripsiyonu başlatması Açık promotor kompleksi PROKARYOTLARDA TRANSKRİPSİYON UZAMA EVRESİ NASIL GERÇEKLEŞİR? Uzama Evresi (Elongation) Kalıp ipliğin karşısına yaklaşık 10 nükleotidin eklenmesinden sonra  alt birimi polimerazdan ayrılır (prokaryotlarda) ve polimeraz RNA zincirinin uzamasının devamı için kalıp DNA’da ileri doğru hareket eder (kayar). Uzama sırasında, polimeraz enzimi RNA’yı sentezlerken kalıp DNA ile bir arada kalır.  RNA Polimeraz ilerlerken, transkripsiyon bölgesinde yaklaşık 15 bazlık bölgede DNA ipliği açıktır; DNA molekülü transkripsiyon kompleksinin ön tarafında açılarak (unwinds) tek iplikli kalıp oluşturulurken transkripsiyona uğrayan kısım yeniden sarmal halini alır (rewinds). http://vcell.ndsu.nodak.edu/animations/transc ription/movie-flash.htm PROKARYOTLARDA TRANSKRİPSİYON SONLANMASI NASIL GERÇEKLEŞİR? RNA polimeraz ne zaman durması gerektiğini nasıl belirler? DNA üzerinde transkripsiyonun nerede başlayacağını belirleyen promotor sekansları gibi yine DNA üzerinde bu transkripsiyonun ne zaman bitmesi gerektiğini belirleyen ve terminator olarak isimlendirilen sekanslar mevcuttur.  DNA üzerindeki sonlandırma sinyalleri en yaygın olanı, ATzengin dizilerin takip ettiği GC bakımından zengin diziyi taşıyan bölgedir. Sonlandırma Evresi (Termination) Polimeraz enzimi, sonlandırma sinyaliyle karşılaşıncaya kadar RNA sentezi devam eder ve sonlandırma sinyaliyle karşılaşınca transkripsiyon durur. Sentezlenen RNA transkripti polimerazdan ayrılır ve daha sonra polimeraz da DNA kalıbını terk eder. Ökaryotlarda bu işlemden sorumlu birtakım protein faktörleriyle ilgili modellemeler ileri sürülmekle birlikte prokaryotlarda daha iyi çalışılmış olup iki tip sonlandırma mekanizması tespit edilmiştir: 1. Saç Tokası (hairpin) oluşumu (Rho independent): Prokaryotlarda en basit ve en sık gözlenen sonlandırma sinyalidir.  Sentezlenen RNA transkriptindeki G ve C’ler arasındaki baz eşleşmeleri, saç tokası (hairpin) şeklinde bir yapı oluşturarak transkriptin kalıp DNA ile olan ilişkisini bozar ve transkripsiyonu sonlandırır. 2. Rho Faktörü Bağımlı (rho-dependent): Bu mekanizmada, Rho faktörü olarak isimlendirilen transkripsiyon düzenleyici bir proteinin, sonlanma bölgesinde tek zincirli RNA’ya bağlanmasını takiben transkripsiyon sonlandırılır. 1. 2. Transkripsiyon işleminde terminasyon ister RHO FAKTÖR BAĞIMLI ister RHO FAKTÖR BAĞIMSIZ olsun, neticede tamamlanmış RNA molekülü ve core RNA polimeraz enzimi serbest kalır.  Core RNA polimeraz enzimi daha sonra başka bir sigma faktöre bağlanarak başka bir promotordan RNA sentezini başlatır. ÖKARYOTLARDA TRANSKRİPSİYON NASIL GERÇEKLEŞİR? Ökaryotlarda gen ekspresyonu Ökaryotlarda transkripsiyon karmaşıktır. 1. Genom büyüktür ve daha fazla gen vardır. Bununla beraber noncoding (kodlama yapmayan) DNA bulunur. Dolayısıyla başlangıç noktasını bulmak saman yığını içinde iğne aramaya benzer.  Bu sorunu çözmek içinse ökaryotlarda farklı 3 sınıf RNA polimeraz ve bir çok proteinin başlangıç noktasında toplanması gerekir bu proteinlere GENEL TRANSKRİPSİYON FAKTÖRLERİ (GTF) denir. 2. Ökaryotlarda nükleus bulunur. RNA nükleusta sentezlenir ve daha sonra proteine dönüşmek üzere sitoplazmaya geçer. Bu nedenle çeşitli modifikasyonlar geçirir. Prokaryotik mRNA'ların aksine, ökaryotik mRNA'lar hem 5‘ hem de 3'uçlarından modifiye edilir ve mature (olgun) mRNA oluşturmak intronlar çıkarılır. Bu işlemler RNA İŞLENMESİ (PROCESSING) denir. İlk sentezlenen mRNA’ya pre-mRNA yada primer transkript denir. Olgunlaşmasını tamamlamış olan ise mature mRNA’dır. ÖKARYOTİK RNA POLİMERAZLARIN ÖZELLİKLERİ NELERDİR? Ökaryotik RNA polimerazlar Polimeraz Tipi Transkribe ettiği genler RNA polimeraz I (çekirdekçikte) 5.8S, 18S ve 28S rRNA genleri RNA pol II (nükleoplazmada) Tüm protein kodlayan genler (mRNA) ve küçük RNA genleri RNA pol III (nükleoplazmada) tRNA genleri, 5S rRNA genleri ve bazı küçük RNA genleri RNA pol IV, V (Yalnızca bitkilerde) siRNA mt RNA pol Mitokondrial genomdaki genler ***Ökaryotik hücrelerde bulunan RNA polimerazlar: en az 10 polipeptit zincirinden oluşmakta ve her bir tip polimeraz transkripsiyon sırasında promotor bölgeye bağlanabilmesi için çok sayıda transkripsiyon faktörleri (TF) ile kompleks oluşturmaktadır. Ökaryotik RNA polimeraz II ve ilişkili olduğu protein kompleksleri (transkripsiyon faktörleri) DNA RNA Prokaryotik RNA polimeraz ile karşılaştırıldığında ökaryotik RNA polimerazlar ile çalışmak daha zordur, çünkü düşük konsantrasyonlarda bulunurlar. Bilinen tüm ökaryotik RNA polimerazlar çoklu alt birimlere sahiptir (ör,12 alt birimden oluşan maya RNA pol II enzimi, bu alt birimlerden 5 tanesi maya RNA pol III enziminde de bulunmaktadır) Organel spesifik RNA polimerazlar daha prokaryotik benzerleridir. (kloroplast ve mitokondri)  Organizmaların en basiti transkribe edilmeyen bir sürü DNA içerir. RNA polimeraz;  Hangi zincirin kalıp zincir olduğunu,  Hangi bölümünün transkribe edileceğini ve  Transkripsiyona tabi tutulacak genin ilk nükleotidinin nerede olduğu bilmelidir. ÖKARYOTLARDA TRANSKRİPSİYON BAŞLANGIÇ EVRESİ NASIL GERÇEKLEŞİR? Ökaryotlarda Transkripsiyon başlangıcı Ökaryotik Transkripsiyonun Başlatılması  Organizatörü Tanıma ve Çözme: Başlatma sırasında, RNA polimeraz, kopyalanacak genin yukarısında bulunan spesifik bir promotör bölgesini tanımlar. Promotör sahasının çevresindeki DNA, RNA sentezi için şablon sarmalı açığa çıkarmak üzere yerel olarak çözülür.  TATA Kutusu ve Başlatıcı Öğe: Protein kodlayan genleri kopyalayan RNA polimeraz II durumunda, çoğu promotör bölgesi, TATA kutusu (cis-element) olarak bilinen korunmuş bir dizi içerir. Tipik olarak transkripsiyon başlangıç bölgesinin -25 baz çifti yukarısında yer alan bu dizi, bir TATA(A/T)A(A/T) konsensüs modeli sergiler.  TATA kutusu, prokaryotik promotörlerde bulunan -10 dizisine benzer şekilde işlev görerek RNA polimerazın tanınmasına ve konumlandırılmasına yardımcı olur. Bununla birlikte, bazı genler bir TATA kutusundan yoksundur ve bunun yerine transkripsiyonel başlatma bölgesi etrafında merkezlenmiş bir başlatıcı öğeye sahiptir. Ökaryotik hücrelerde promotor bölgede çok sayıda korunmuş dizi tanımlanmıştır. NOT: RNA pol II tarafından transkribe edilen bazı protein kodlayan genler, TATA kutusu içermezler. Bunlar rutin hücre fonksiyonları için gerekli olan proteinleri kodlayan ve bu yüzden bütün hücrelerde düşük seviyede eksprese olan ‘’housekeeping’’ genlerdir. Ökaryotik transkripsiyonun başlatılması, promotör tanıma, transkripsiyon faktörlerinin birleştirilmesi ve transkripsiyon başlatma kompleksinin oluşumunun karmaşık bir etkileşimini içerir.  Bu işlemler, ökaryotik hücrelerde RNA sentezinin doğru şekilde başlatılmasını ve gen ifadesinin düzenlenmesini sağlar. ENHANSIRLAR DNA üzerinde yerleşmiş transkripsiyon hızını arttıran diğer cis-elementlerdir. Genellikle bir genin çok yukarısında yada aşağısında ve hatta içinde bulunabilirler.  Transkripsiyonu uzaktan kontrol etme potansiyeline sahiptirler.  Kalıba bağlanmada doğrudan rol oynamasa da, transkripsiyonun etkin bir biçimde başlamasında rol oynarlar. Genel Transkripsiyon Faktörleri: Transkripsiyonu başlatmak için RNA polimeraz II, genel (veya bazal) transkripsiyon faktörlerinin yardımını gerektirir.  Bu faktörler, promotör üzerinde bir kompleks halinde birleşerek, RNA polimerazın bağlanmasını ve müteakip transkripsiyonun başlatılmasını kolaylaştırır. RNA polimeraz II için genel transkripsiyon faktörlerine toplu olarak TFII (RNA polimeraz II için Transkripsiyon Faktörü) adı verilir.  Transkripsiyon Başlatma Kompleksinin Oluşumu: Başlatmadaki ilk adım, TFIID protein kompleksinin TATA kutusuna bağlanmasını içerir. TFIID, TATA kutusu dizisi ile etkileşime giren TBP (TATA kutusu bağlayıcı protein) adı verilen bir alt birim içerir. TFIID bağlanmasının ardından, TFIIA, TFIID-TATA kutusu etkileşimini stabilize ederken, TFIIB, TFIID ve RNA polimeraz II arasında bir köprü proteini görevi görür. Halihazırda RNA polimeraz II ile kompleks oluşturan TFIIF, düzenek ile daha fazla ilişki kurar. Son olarak, TFIIE, TFIIH, (TFIIJ) komplekse katılarak transkripsiyon başlatma kompleksini oluşturur.  Başlatma Kompleksi Meclisi: RNA polimeraz II ve ilgili genel transkripsiyon faktörlerinden oluşan transkripsiyon başlatma kompleksi, transkripsiyonun tam olarak başlatılmasını kolaylaştırır. Kompleks, çok sayıda polipeptit içerir ve RNA polimeraz II'nin promotör üzerinde doğru konumlandırılmasını sağlar. Polimeraz II transkripsiyon kompleksinin oluşumu: Polimeraz II promotörlerinin çoğunda, transkripsiyon başlama noktasının 25 ila 30 nt yukarısında, TATA kutusu bulunur. Bu dizi, TATA’ya bağlanan protein (TBP) ve TBP-bağlanan faktörlerden (TAF’lar) oluşan transkripsiyon faktörü TFIID tarafından tanınır. Sonra TFIIB TBP’ye bağlanır ve bunu TFIIF ile birlikte polimerazın bağlanması izler. En sonunda, TFIIE ve TFIIH komplekse eklenir. ÖKARYOTLARDA RNA POLİMERAZ I ve III ile TRANSKRİPSİYON NASIL GERÇEKLEŞİR? Ribozomal RNA geni: Ribozomal DNA, sonradan 28S, 18S ve 5.8S rRNA’lara ayrılacak olan, büyük bir RNA molekülüne (45S pre-rRNA) kopyalanır.  RNA Polimeraz I rRNA genlerinin transkripsiyonuyla yükümlüdür.  Polimeraz III genlerinin transkripsiyonu: Polimeraz III ile kopyalanan genler, üç tip promotör ile eksprese edilir. 5S rRNA’nın ve tRNA genlerinin promotörleri, transkripsiyon başlama yerinin aşağı yönündedir.  5S rRNA geninin transkripsiyonu TFIIIA bağlanması ile başlar ve bunu TFIIIC, TFIIIB ile polimerazın bağlanması takip eder.  tRNA promotörleri TFIIIA için bağlanma yeri içermez ve transkripsiyonları için TFIIIA gerekli değildir. Onun yerine, tRNA genlerinin transkripsiyonunu promotöre bağlanan TFIIIC ile başlatılır ve bunu TFIIIB ve polimerazın birleşmesi takip eder.  U6 snRNA geninin promotörü, transkripsiyon başlama yerinin yukarısındadır ve TFIIIB’nin alt birimi olan TATA’ya bağlanan protein (TBP) tarafından tanınan TATA kutusu içerir. TFIIIB, SNAP olarak adlandırılan diğer bir faktör ile birlikte bağlanır. ÖKARYOTLARDA TRANSKRİPSİYON UZAMA EVRESİ NASIL GERÇEKLEŞİR? Ökaryotik Transkripsiyonun Uzaması TFIIH ve Fosforilasyon: Bir transkripsiyon faktörü kompleksi olan TFIIH, uzama sırasında iki önemli fonksiyona hizmet eder. İlk olarak, DNA sarmalını çözmek için ATP kullanarak, transkripsiyonun ilerlemesini kolaylaştıran bir helikaz görevi görür. İkincisi, TFIIH, RNA polimeraz II'yi fosforile ederek, enzimde konformasyonel bir değişikliğe ve başlatma kompleksindeki diğer proteinlerden ayrışmaya neden olur. Fosforilasyon, öncelikle RNA polimeraz II molekülünün C-terminal alanında (CTD) meydana gelir.  CTD'nin fosforilasyonu: RNA polimeraz II'nin uzun bir C-terminal kuyruğu olan CTD, uzama sırasında fosforilasyona uğrar. İlginç bir şekilde, fosforile olmayan bir CTD'ye sahip RNA polimeraz II, transkripsiyonu başlatabilir, ancak yalnızca CTD fosforile edildiğinde RNA'nın uzaması meydana gelebilir. Bu fosforilasyon olayı, başlangıçtan uzama fazına geçiş için kritiktir. Modifikasyonlar ve Nükleozom Etkileşimi: Uzama sırasında, yeni oluşan RNA molekülünde ek değişiklikler meydana gelir. Ökaryotlarda mRNA, RNA pol II tarafından uzun bir öncül olarak sentezlenir. Bu öncül primer mRNA popülasyonuna heterojen nüklear RNA (hnRNA) adı verilir. RNA işlenmesi öncül RNA’nın olgun RNA’ya dönüştürülmesi işlemidir. Bu işlem başlık yapısının takılması, poliadenilasyon ve RNA splicing işlemlerini içerir. mRNA’ya başlık yapısının ilave edilmesi Ökaryotlarda, pre-mRNA'nın 5' ucu, bir 7-metilguanozin (7MG) başlığının eklenmesiyle değiştirilir. Alışılmadık bir 5'-5' trifosfat bağlantısı ve metil grupları içeren bu başlık yapısı, RNA zinciri yaklaşık 30 nükleotid uzunluğunda olduğunda eklenir.  7-MG başlığı, transkripsiyon başlangıcında rol oynar ve büyüyen RNA zincirini ribonükleazlar tarafından bozunmaya karşı korur. Ayrıca mRNA’nın ribozomlarca tanınmasında rol oynar.  Bu yapının, olgun mRNA’ların çekirdek zarından stoplazmaya geçişinde de rol oynadığı düşünülmektedir. Poliadenilasyon işlemi  Öncü transkriptin 5’ ucuna başlık yapısı takıldıktan sonra, 3’ ucunda enzimatik bir kırılma meydana gelir ve yaklaşık 100-200 adenin içeren Poli (A) kuyruğu ilave edilir.  Enzimatik kırılma, RNA transkriptinin 3’ ucunda poliadenilasyon sinyali olarak bilinen AAUAAA dizisinin 10-30 nt ilerisindeki bir noktada meydana gelir.  Bundan sonra, poli (A) polimeraz yeni 3’ uca 100-200 adenilik asit molekülünü ilave eder.  Bu kuyruk çekirdekten ihracı ve çevirimi sağlar, ayrıca ökaryotlarda mRNA'yı yıkımdan korur.  Yapılan çalışmalar, ökaryotik organizmaların mRNA’larının hemen hepsinin 3’ ucunda poli (A) kuyruğu bulunduğunu göstermiştir.  Ancak histon proteinleri bu kuralın dışında kalan istisnalardır. RNA splicing  RNA işlenmesinde, şapka yapısının takılması ve poliadenilasyon işleminden sonraki basamak, intronların kesilip çıkarılması ve ekzonların birleştirilmesi aşamasıdır. ÖKARYOTLARDA TRANSKRİPSİYON SONLANMA EVRESİ NASIL GERÇEKLEŞİR? Ökaryotlarda transkripsiyonun sona ermesi Faktöre Bağlı:  Ribozomal RNA genlerini kopyalayan RNA polimeraz I (Pol I) durumunda, sonlandırma, TTF-1 (RNA Polimeraz I için Transkripsiyon Sonlandırma Faktörü) olarak bilinen özel bir transkripsiyon sonlandırma faktörü gerektirir. TTF-1, genin sonuna yakın belirli bir baz çifti dizisini tanır ve daha fazla transkripsiyonu bloke ederek RNA polimeraz I'in DNA şablonundan ayrılmasına ve yeni sentezlenen RNA'nın salınmasına yol açar.  Protein kodlayan, yapısal RNA ve düzenleyici RNA genlerinin kopyalanmasından sorumlu olan RNA polimeraz II (Pol II) için sonlandırma daha karmaşık bir süreçtir.  Pol II genin sonuna ulaştığında, RNA polimeraz II'nin C-terminal alanı (CTD) tarafından taşınan iki protein kompleksi, CPSF (bölünme ve poliadenilasyon özgüllük faktörü) ve CSTF (bölünme stimülasyon faktörü), poli-A'yı tanır. Kopyalanan RNA'daki sinyal. Bu kompleksler, RNA'yı parçalamak ve bir poli-A kuyruğu eklemek için diğer proteinleri toplar. Transkriptin geri kalanı bir 5'-ekzonükleaz tarafından sindirilirken, bölünme ve poliadenilasyon işlemi, genin "sonunu" işaretleyen dahili bir bölgede gerçekleşir. Bu sindirim, polimerazın DNA şablonundan ayrılmasına yardımcı olur ve sonuçta transkripsiyonu sonlandırır. Faktörden Bağımsız: RNA polimeraz III (Pol III), ek faktörlerin katılımı olmadan transkripsiyonu verimli bir şekilde sonlandırabilir. Pol III için sonlandırma sinyali, olgun RNA'ların 3' ucundan aşağıya doğru yerleştirilmiş bir dizi timin içerir. Pol III, bu poli-T sonlandırma sinyaliyle karşılaştığında, yeni sentezlenmiş RNA'yı serbest bırakmadan önce duraklar. RNA SENTEZ İNHİBİTÖRLERİ NELERDİR? RNA sentez inhibitörleri  Actinomyces cinsi mantarların bazı türlerinden elde edilen bir antibiyotik olan aktinomisin D, DNA çift zincirine yerşeleşerek DNA’da deformasyona sebep olur. Bu sebeple RNA polimeraz DNA üzerinde ilerleyemez ve transkripsiyon durur.  Rifampisin tüberküloz tedavisinde kullanılan antibiyotik bakteri RNA polimerazın beta alt birimine bağlanarak transkripsiyonu durdurur.  Alfa-amantin; ökaryotlarda RNA polşimeraz II ve III’ü inhibe eder.  Doksorubisinin DNA’ya interkalasyon yaparak topoizomeraz II’nin ilerlemesini engellediği bilinmektedir ve replikasyonun yanında transkripsiyonu da durdurur.