TP-Tests biochimiques et galerie API PDF

TESTS BIOCHIMIQUES D’IDENTIFICATI ON et GALERIE API En plus de l’étude des caractères morphologiques et culturaux, on identifie: Une bactérie en observant si elle utilise tel ou tel substrat (nutriment). On test l’aptitude de la bactérie a pouvoir se développer dans un milieu d...

TESTS BIOCHIMIQUES D’IDENTIFICATI ON et GALERIE API En plus de l’étude des caractères morphologiques et culturaux, on identifie: Une bactérie en observant si elle utilise tel ou tel substrat (nutriment). On test l’aptitude de la bactérie a pouvoir se développer dans un milieu de culture en présence d’un glucide, ou un peptide, ou d'autres substrats plus complexes.  Chaque famille de Bactérie Chaque espèce de bactéries a des caractères propres. On peut donc les rassembler facilement avec des caractéristiques de base comme l'utilisation du glucose avec ou sans oxygène, la réduction Chaque espèce des nitrates, etc. de bactéries ses préférences nutritives Chaque famille se développera dans des milieux spécifiques à elle. La combinaison de différents résultats obtenus permet de définir le profil métabolique de la bactérie analysée ce qui permet de l’identifier. L'utilisation d’un substrat est révélée par le virage d'un indicateur de pH (par exemple : un glucide utilisé donne un produit acide, un peptide donne un produit basique, etc… ou encore une activité enzymatique de la bactérie qui a conduit à la formation d’un métabolitepH ou la production Acided’un produit final et le Alcalin milieu devient acide ou alcalin. Rouge de 6,8 à 8,3 jaune Rouge phénol Rouge de 4,2 à 6,3 Rouge jaune méthyle Bromothymol 6 à 7,6 Jaune Bleu bleu Bromocrésol 5,6 à 6,8 Jaune Pourpre pourpre  Exemples de quelques Tests Biochimiques  Test de la catalase La méthode consiste à prélever une colonie du germe à étudier (ex. les staphylocoques pour les Gram + et les entérobactéries pour les Gram -). Déposer sur une lame, une goutte d’H2O2 Placer inoculum dessus. H2O2 catalas H O + O2 2 e  Test de la catalase Pas de bulles = le test est Bulles = le test est positif= la bactérie est negatif= la bactérie est catalase + catalase -  Le genre staphylocoques: sont catalase + ils possedent l’enzyme catalase qui dégrade l’eau oxygénée en H2O + O2 Les streptocoques sont catalase – Ne possèdent pas la catalase  Test de l’oxydase Le test d'oxydase est utilisé pour identifier les bactéries à Gram négatif. Les Staphylocoques sont oxydase négative (sauf S. sciuri, S. lentus, S. vitulinus et S. fleurettii). Les bactéries oxydase-positives donnent rapidement une coloration violette foncée ; dans le cas contraire, il n’ya pas de coloration  Test de la coagulase L'espèce Staphylococcus aureus, considérée le plus fréquemment comme pathogène, la recherche de la coagulase est largement utilisée pour l'identification de Staphylococcus aureus en laboratoire clinique est la coagulation du plasma , Le test de coagulase en tube est réalisé en transférant une grande colonie bien isolée d'une gélose dans 0,5 ml de plasma de lapin reconstitué. Il est essentiel d'incuber le tube à 37 ° C pendant 4 h et d'observer le tube pour la formation de caillots en inclinant lentement le tube à 90 ° de la verticale.  en fonction de leur capacité à coaguler le plasma de lapin, les membres du genre Staphylococcus ont été divisés en ceux qui sont à coagulase positive, c'est-à- dire Staphylococcus aureus, et ceux qui sont appelés staphylocoques à coagulase négative (SCN),  Test ornithine décarboxylase Test ornithine décarboxylase pour l'identification de Staphylococcus lugdunensis qui est ornithine décarboxylase positive.  Test mannitol mobilité (pour des enterobactéries) Composition du milieu mannitol mobilité peptone 20 g Nitrate de potassium 2g Mannitol 2g Rouge de phénol à 1 % 4 mLIndicateur de pH(rouge en milieu basique , jaune en milieu acide.) gélose 4g ED qsp 1 L  Lecture du milieu mannitol mobilité Mode Avant utilisation Après utilisation d’ensemenceme nt Ensemencer par piqûre centrale à l’aide d’un fil droit. Incuber 24 h à 37°C.  Milieu Citrate de Simmons( pour des enterobactéries) -Permet de voir si la bactérie peut utiliser le citrate comme seule source de carbone Principe: Le milieu contient le citrate comme source de carbone et le phosphate d’ammonium comme source d’azote. Lorsque la bactérie utilise le C et le N, le pH du milieu deviendra alcalin. L’indicateur bleu de bromothymol passera de vert à  Composition du milieu Citrate de Simmons Composition Sulfate de magnésium 0,2 g Phosphate monopotassique 1g Phosphate bipotassique 1g Citrate de sodium 2g NaCl 5g Bleu de Bromothymol 0,08 g Agar (gélose) 15 g ED qsp 1 L Ensemencement Faire une strie centrale à partir d’une colonie Ne pas visser le bouchon à fond Incuber 24 h à 37°C Lecture du milieu citrate de Simmons Le milieu Le milieu ne présente une présente aucune culture, culture. l’indicateur de Les bactéries pH a viré au bleu n’utilisent pas le = le milieu est citrate comme devenu basique. source de Les bactéries ont carbone : le utilisé le citrate milieu reste vet: comme source la bactérie est de carbone en CITRATE - produisant des composés alcalinisant le milieu: CITRATE + Milieu de Kligler Hajna (KIA) Permet de voir l’utilisation du glucose, du lactose , la production de H2S et du Gaz. Principe: Le milieu contient 10 fois plus de lactose que de glucose, un indicateur pH le rouge de phénol et un sel de fer pour détecter le H2S  Composition du milieu de Kligler Hajna Composition Extrait de viande de boeuf 3g Extrait de levure 3g Peptone 20 g Chlorure de sodium 5g Citrate ferrique 0,3 g Thiosulfate de sodium 0,3 g Lactose 10 g Glucose 1g Rouge de phénol 0,05 g Indicateur de pH Agar (gélose) 12 g 6,5 8,2 ED qsp 1 L Ensemencement Piqûre centrale dans le culot – Ensemencer le milieu à partir de la boite de pétri, par piqûre centrale dans le culot et par stries d'épuisement au niveau de la pente. Le tube est mis à incuber à 37°C pendant 24 heures. – Lecture : – Culot = Glucose – culot jaune =le test est positif (bactérie gluc +) – culot rouge = les test est négatif (bactérie gluc-) – Pente = Lactose – pente jaune= test poisitif (bactérie lac+) – pente rouge= test négatif (bactérie lac-) – Présence de bulles= bactérie (gaz positif) – Absence de bulles = bactérie (gaz négatif) – Précipité noir de sulfure ferrique : le test est positif (il y’a production de H2S/ – pas de précipité noir : le test est négatif (il n’y’a pas de production de H2S).  RESULTATS ►C = Contrôle ►2 = Glucose + lactose – ►3 = Glu +, Lac -, H2S + ►4 = Glu +. Lac +, Gaz + ►5 = Glu +, Lac + H2S +  LA GALERIE API Une galerie API est un ensemble de petits tubes prêts à l’emploi permettant l'identification de micro-organismes par la réalisation rapide et facile de tests biochimiques miniaturisés  ONPG: béta galactosidase (milieu jaune= ONPG positif) ADH: l’arginine désaminase (milieu rose=ADH positif) LDC: Lysine décarboxylase (milieu rose =LDC positif) ODC :Ornithine décarboxylase (milieu rose=ODC positif) Urée: uréase (milieu rose = uréase positif) TDA: tryptophane désaminase ( milieu marron= TDA positif)() IND:trytophanse (milieu rose +réactif)=test positif VP production de butanediol après métabolisme glucidique: couleur rose =test positif après ajout du réactif(naphtol) RM: :production d’acides mixtes : le milieu redevient alcalin après dégradation du glucose  Lecture Lorqu’une suspension bactérienne répartie dans les différentes alvéoles qui composent la microgalerie (contenant de substrats déshydratés), les métabolites produits durant la période d’incubation se traduisent par des changements de couleur spontanés ou révélés par addition de réactifs.  Exemples de quelques galeries API API® 20E: Identification des bacilles Gram (-) en 18-24 heures Rapid 20E :Identification rapide des Entérobactéries en 4 heures API® 20 NE: Identification des bacilles Gram (-) Non-Entérobactéries en 24- 48 heures API® 10 S: Identification simplifiée des bacilles Gram (-) en 18-24 heures  Questions 1- Expliquez le principe du test du mannitol mobilité. 2-Quel est le but du test du milieu Kligler Hajna (KIA). 3- Quelles sont les deux enzymes qui caractérisent les streptocoques et le staphylocoques?  Questions 1- Quel est l’interet des tests biochimiques en bactériologie. 2-Quel est le but du test citrate de Simmons. 3- Pourquoi est ce que dans le test KIA il y’a 1 fois plus de lactose que de glucose? 4- Qu’elle enzyme permet de différencier les staphylocoques des streptocoques? FIN Zone du tube Caractèr observation Interprétatio Conclusion e n recherch é Culot Glucose Culot jaune Acidification du Le glucose a été (anaérobiose) culot ulitisé par fermentation La bactérie est glucose+ Culot couleur Absence Le glucose n’a pas inchangée d’acidification été utilisé:la bactérie est glucose- Pente Lactose Pente rouge Absence Lactose non utilisé (aérobiose) d’acidification Bactérie lactose - Pente jaune Acidification Lactose utilisé:la bactérie est lactose+ Pente culot Productio Présence de bulles Production de La bactérie produit du n de gaz gaz gaz (fermentation du gllucose) bactérie Gaz+ Absence de bulles Pas de La bactérie ne produit production de pas de gaz: Elles est gaz gaz - Productio Présence d’un La bactérie est H2S+ n d’H2S précipité noir