PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa 5.1

PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa

• La PCR es una técnica de amplificación de ADN que replica una secuencia millones de veces rápidamente.
• Es un proceso automatizado y permite la detección y cuantificación de secuencias de ADN específicas en poco tiempo con muestras pequeñas.
• La PCR se basa en la replicación del ADN.
• Utiliza una ADN polimerasa (Ej: Taq polimerasa) estable a altas temperaturas.
• Los cebadores (primers) delimitan la región de interés del ADN para amplificar.

Componentes de la PCR

• ADN molde: Es la secuencia de ADN que se quiere copiar.
• Cebadores (primers): Oligonucleótidos cortos con secuencias conocidas complementarias a las regiones del ADN que se amplificarán. Es crucial para la especificidad.
• dNTPs: Desoxirribonucleótidos trifosfatados son los bloques de construcción para la nueva cadena. Deben estar en concentraciones iguales para mantener la eficiencia.
• Taq polimerasa: Una enzima que sintetiza nuevas cadenas de ADN, importante porque es resistente al calor.
• Cloruro de magnesio (MgCl2): Necesario para la actividad de la Taq polimerasa. Concentraciones óptimas son cruciales.
• Buffer: Solución que mantiene el pH adecuado para la reacción.
• Agua ultrapura: Exenta de ADNasas y ARNasas para evitar contaminación.
• Mezcla de reactivos (master mix): Contiene todos los componentes necesarios para la reacción.

Etapas de la PCR

• Desnaturalización: Elevación de la temperatura (95ºC) para separar las cadenas de ADN molde.
• Hibridación (Annealing): Reducción de la temperatura (50-70ºC) para permitir que los cebadores se unan a sus secciones complementarias del ADN molde. La temperatura óptima se determina por la secuencia de los cebadores.
• Extensión: Aumento de la temperatura (72ºC) para que la Taq polimerasa sintetice nuevas cadenas de ADN desde los cebadores.

Variantes de la PCR

• PCR multiplex: Amplificación simultánea de varios fragmentos de ADN en una sola reacción.
• PCR anidada: Una doble PCR donde el producto de la primera reacción es el molde para la segunda.
• PCR en tiempo real: Permite la cuantificación de ADN en tiempo real durante el proceso de amplificación.
• RT-PCR: Usa la transcriptasa inversa para amplificar ARN y convertirlo en ADNc (ADN complementario) para amplificarlo.

Problemas en la PCR

• Amplificación inespecífica: Producción de fragmentos no deseados.
• Formación de dímeros de cebadores: Unión de los cebadores entre sí en lugar del ADN molde.
• Contaminación: Presencia de ADN extraño que puede interferir con la reacción.
• Ausencia de amplificación: Posibles fallas en el proceso.

Ventajas de la PCR

• Alta especificidad
• Sensibilidad extrema (permite detectar cantidades muy pequeñas de ADN)
• Rapidez
• Automatización