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UT3. REALIZACIÓN DE CULTIVOS CELULARES Biología Molecular y Citogenética UT8 Contenido 1. Objetivos....................................................................................

UT3. REALIZACIÓN DE CULTIVOS CELULARES Biología Molecular y Citogenética UT8 Contenido 1. Objetivos............................................................................................................................... 3 2. Introducción.......................................................................................................................... 3 3. Definición de cultivo celular.................................................................................................. 3 4. Tipos de cultivos.................................................................................................................... 5 4.1. Tipos de Cultivos Celulares................................................................................................. 6 4.2. Biología de las células en cultivo........................................................................................ 9 4.3. Las células transformadas proliferan indefinidamente en un cultivo. ¡Error! Marcador no definido. 5. Composición del Laboratorio de Cultivos Celulares.............................................................. 9 5.1. Preparación de Medios de Cultivo................................................................................... 10 5.2. Aparataje de un laboratorio de cultivos. Funcionamiento y uso..................................... 12 6. Normas de trabajo en el laboratorio de citogenética......................................................... 15 7. Contaminaciones................................................................................................................. 16 7.1. Bacterias levaduras y hongos........................................................................................... 16 7.2. Micoplasmas..................................................................................................................... 16 7.3. Virus.................................................................................................................................. 17 8. Técnicas de obtención, mantenimiento y proliferación de cultivos................................... 17 8.1. Recolección de muestras para la obtención de cultivos celulares en citogenética......... 17 8.2. Realización de cultivos celulares..................................................................................... 18 9. Determinación del número de células y viabilidad celular................................................. 20 9.1. Técnicas de recuento celular............................................................................................ 20 9.2. Determinación de la viabilidad celular............................................................................. 21 María José Jiménez Página 2 Biología Molecular y Citogenética UT8 1. Objetivos  Conocer las diferentes técnicas para la obtención de cultivos celulares en los laboratorios citogenéticos.  Diferenciar las muestras a partir de las que se pueden obtener cultivos celulares.  Aprender las técnicas de recuento celular. 2. Introducción La citogenética convencional permite estudiar los cromosomas que se obtienen tras el cultivo de células in vitro. Únicamente mediante la división celular, especialmente en la metafase, los cromosomas pueden identificarse individualmente al microscopio. Los cromosomas metafásicos se obtienen in vivo a partir de muestras con un alto índice de división mitótica (vellosidades coriónicas, médula ósea, tumores sólidos, etc.) e in vitro al inducir químicamente la división celular de muestras, como linfocitos de sangre periférica, biopsias de tejido y células de líquido amniótico, mediante los cultivos celulares. A continuación, se describen los diferentes tipos de cultivos celulares con los que se trabaja en los laboratorios de citogenética y las técnicas para su obtención. Los cultivos celulares desempeñan un papel clave en el diagnóstico citogenético prenatal, ya que a partir de ellos se pueden detectar, por ejemplo, aneuploidías, así como alteraciones génicas (mutaciones) como translocaciones, delecciones, microdelecciones, inversiones, duplicaciones, etc. 3. Definición de cultivo celular. Actualmente se entiende por cultivo celular: Dependiendo del grado de preservación de la estructura del tejido o del órgano de origen y de su duración hablaremos de diferentes tipos de cultivos: de órganos, explantes, primarios, secundarios, etc. En la actualidad, entre las áreas de aplicación en las que el cultivo celular in vitro es una herramienta básica cabe destacar: María José Jiménez Página 3 Biología Molecular y Citogenética UT8  El Cáncer, que se puede considerar como una enfermedad del ciclo celular. Los defectos en el control del ciclo pueden conducir a una proliferación celular anormal o a alteraciones cromosómicas como las que se observan en las células cancerosas.  La reproducción y diferenciación celular. Sus aplicaciones se refieren, de una parte, a la llamada “reproducción asistida” y al controvertido tema de la clonación y, de otra, a la Medicina Regenerativa en la que, a partir de células madre o troncales, se forman o reconstruyen tejidos que sustituyen a otros dañados por diversos procesos patológicos.  La medicina regenerativa, que pretende conseguir la regeneración, total o parcial, de los tejidos que han perdido masa celular, utilizando técnicas de trasplante celular para implantar células troncales o células madre. Otros ejemplos de áreas de investigación fuertemente dependientes de las técnicas de cultivo celular son:  Virología: establecimiento de condiciones de cultivo de virus animales y de plantas, producción de vacunas antivirales,...  Inmunología. Gracias especialmente a la introducción de las técnicas de fusión celular en la producción de anticuerpos monoclonales.  Ingeniería de proteínas. Por la producción de proteínas en líneas celulares: interferón, insulina, hormona de crecimiento,... Los cultivos celulares tienen una serie de ventajas innegables, pero al mismo tiempo tienen unas desventajas que hay que tener en consideración. Como ventajas podemos citar:  Permiten un control preciso y fino del medio ambiente. En un cultivo se pueden controlar todos los factores del medio: físico-químicos (pH, temperatura, presión osmótica, niveles de O2, CO2, tensión superficial...), y fisiológicos (hormonas, factores de crecimiento, densidad celular, etc.).  Caracterización y homogeneidad de la muestra. Las células en cultivo de una línea celular (cultivo primario propagado), o de una línea continua son homogéneas, con morfología y composición uniformes.  Economía. El coste de los ensayos clínicos se reduce considerablemente y se puede hacer un mayor número de pruebas. Suponen un ahorro en el uso de reactivos o drogas ya que las concentraciones requeridas son mucho más bajas que en animal completo.  Motivaciones éticas. La investigación biomédica supone el sacrificio cada año de muchos miles de animales de experimentación. El cultivo celular no puede María José Jiménez Página 4 Biología Molecular y Citogenética UT8 reemplazar siempre al ensayo in vivo pero es una alternativa válida en muchas situaciones. En cuanto a las desventajas del cultivo celular:  Técnica sensible. El crecimiento de las células animales es mucho más lento que el de los contaminantes más habituales (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas,...) y además dado que proceden de organismos pluricelulares son incapaces de crecer en ausencia de una compleja mezcla de nutrientes que simula el plasma o el fluido intersticial. Esto supone la necesidad de mantener las condiciones de asepsia en todo momento, lo cual es limitante a nivel tanto del instrumental requerido como del personal cualificado para su manipulación.  Cantidad y costo. Producir 1 gramo de células en cultivo cuesta 10 veces menos que obtenerlas a partir del tejido de un animal. Sin embargo, para producir hasta 100 gramos de células hay que incrementar tanto el instrumental como el personal, y las instalaciones.  Inestabilidad. Muchas de las líneas celulares continuas son inestables, como consecuencia de la dotación cromosómica aneuploide (cambio en el número de cromosomas) lo que afecta tanto a su velocidad de crecimiento como a su capacidad para diferenciarse.  Validez del modelo in vitro. Un cultivo celular carece de:  la organización espacial tridimensional propia del tejido.  las interacciones entre los distintos tipos celulares y entre las células y la matriz extracelular.  los componentes sistémicos implicados en la regulación de la homeostasis 'in vivo', especialmente los sistemas nervioso y endocrino. 4. Tipos de cultivos. Se podría hablar de tres tipos de cultivos: Cultivo de órganos. Se mantiene, al menos en parte, la arquitectura característica del tejido in vivo. Para ello el órgano se mantiene en un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos y en el que mantiene su estructura tridimensional, en general esférica. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados y es por ello una buena réplica del tejido de origen, pero por el contrario no permite su propagación pues el crecimiento, de producirse, se limita a la periferia. Se utilizan para estudiar interaciones respuestas a estímulos, estudios regenerativos, etc. María José Jiménez Página 5 Biología Molecular y Citogenética UT8 Explantes primarios. Fragmentos de tejidos o de órganos que se adhieren a una superficie y en la que proliferan las células de la periferia del explante. Cultivo celular. Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o mecánicos. La suspensión celular se puede cultivar como una monocapa adherente o en suspensión en el medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite su propagación, aumentando notablemente la masa celular del cultivo a lo largo de las generaciones. Como característica negativa se pierde la heterogeneidad celular de partida, la población se hace uniforme y homogénea al predominar en el cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento. Figura 1. Esquema de la obtención de distintos tipos de cultivo celular a partir de los órganos de un animal. 4.1. Tipos de Cultivos Celulares Dentro de los cultivos celulares podemos distinguir:  Cultivos primarios Se denominan así a aquellos cultivos preparados directamente a partir de un tejido u órgano. Pueden iniciarse con o sin fraccionamiento previo para separar los distintos tipos celulares. En estos cultivos las células están vivas, conservan sus características originales y su proliferación es limitada. Pueden ser removidas del recipiente de cultivo para formar cultivos secundarios. En esta etapa, las células establecen contactos entre ellas que inhiben su proliferación y el crecimiento se detiene. Por eso, al cabo de un tiempo hay que trasplantar las células a un nuevo soporte. Esta operación se denomina subcultivo o pase. Ejemplos: hepatocitos obtenidos de hígado adulto, neuronas, etc... María José Jiménez Página 6 Biología Molecular y Citogenética UT8 Existen dos tipos de cultivo celular primario: Cultivos en monocapa: las células crecen adheridas sobre un soporte sólido (plástico o vidrio). El anclaje al sustrato es un prerrequisito para la proliferación celular. Es el método utilizado para la mayoría de las células excepto para las hematopoyéticas. Cultivos en suspensión: las células se encuentran dispersas en el medio de cultivo. Su crecimiento no depende del anclaje. Este tipo de cultivo se restringe a las células hematopoyéticas, células madre, líneas celulares transformadas y células tumorales. Figura 2. Obtención de células en cultivo a partir de un tejido u órgano. Los cultivos primarios de muchos tipos celulares son posibles porque las células pierden algunas de sus propiedades diferenciadas, entre ellas la incapacidad de dividirse. Esta pérdida de algunas de sus propiedades características puede deberse a la desdiferenciación celular que implica una pérdida irreversible de una propiedad diferencial del tipo celular.  Cultivos secundarios o Líneas celulares Los sucesivos cultivos así formados se denominan una línea celular. La formación de una línea celular a partir de un cultivo primario implica que: aumenta el número de células obtenidas acaban predominando uno o dos tipos celulares: los que tienen mayor tasa de crecimiento la población celular se hace uniforme y homogénea sus características se conservan durante las sucesivas generaciones y, si se conservan en nitrógeno líquido, de forma indefinida María José Jiménez Página 7 Biología Molecular y Citogenética UT8  Líneas celulares continuas Normalmente, las líneas celulares tienen una vida finita (se dividen un número determinado de generaciones característico de cada tipo celular, entre 20 y 100) y posteriormente entran en senescencia, las líneas continuas se mantienen en cultivo por tiempo ilimitado. Senescencia: Un cultivo de células con un período de vida indefinido se considera inmortal y se lo denomina línea celular continua.. Las líneas continuas aparecen como consecuencia de un periodo de transformación de las células normales, relacionado con la pérdida de los mecanismos de control celular. Características de las células transformadas:     Estas líneas aparecen espontáneamente en algunos cultivos, debido a la aparición de células inmortales, aunque también se pueden inducir por:  Métodos físicos: irradiación del cultivo.  Métodos químicos: tratamiento con carcinógenos.  Métodos biológicos: infección vírica, transfección de ADN. La línea celular HeLa fue la primera línea celular continua humana que se obtuvo originariamente en 1952 a partir de un tumor maligno (carcinoma) del cuello uterino María José Jiménez Página 8 Biología Molecular y Citogenética UT8 4.2. Biología de las células en cultivo La concentración de células a los largo de los días de evolución de un cultivo se representa gráficamente mediante una curva de crecimiento. En ella se pueden diferenciar tres fases:  Fase de latencia: corresponde a las primeras 24 horas del cultivo, no se produce crecimiento (el número de células permanece constante o incluso disminuye ligeramente).  Fase de crecimiento exponencial: es el tramo recto con elevada pendiente. Dura entre 6-7 días. en esta fase, el número de células aumenta de forma exponencial hasta alcanzar un máximo.  Fase estacionaria: tramo recto sin pendiente. A partir de los 6-7 días. El número de células permanece constante.  Fase de Senescencia: pierden su capacidad de proliferar y mueren. 5. Composición del Laboratorio de Cultivos Celulares. Antes de proceder a describir las principales técnicas para la realización de cultivos celulares, hay que mencionar el equipamiento necesario para poder realizarlas de forma adecuada en el laboratorio de citogenética. La característica principal que define un laboratorio de citogenética en el que se realizan cultivos celulares es el mantenimiento de la asepsia. La tasa de crecimiento de las células en cultivo es muy inferior a la de los contaminantes habituales: hongos, levaduras, bacterias y micoplasmas y, por esta razón, para el mantenimiento del cultivo es esencial evitar que se contamine con cualquier otro microorganismo. Para realizar cultivos, el área de trabajo debe situarse en una parte del laboratorio tranquila, alejada de las vías de paso y exclusivamente dedicada al cultivo de células. El empleo de cabinas de flujo laminar reduce las necesidades de aislamiento del área de trabajo, pero aun así, se recomienda mantener un gradiente de esterilidad, desde María José Jiménez Página 9 Biología Molecular y Citogenética UT8 el medio exterior o laboratorio general, al interior de las cabinas de flujo, donde se manipulan los cultivos, y del incubador, donde se mantienen. El área de trabajo de los cultivos de tejidos suele ser una sala aislada, con suministro de aire filtrado mediante un equipo de filtración y a temperatura regulada, lo que hace que se produzca un aumento de la presión atmosférica en el interior de la sala (típicamente, 15-20mm Hg), que impide la entrada de aire no filtrado del exterior al área limpia. Un laboratorio de cultivos celulares debe contar con una infraestructura básica de áreas independientes para: 5.1. Preparación de Medios de Cultivo. En esta área una serie de técnicos se dedican enteramente a la preparación de medios y reactivos para uso común de los usuarios del laboratorio de cultivos. El Medio de Cultivo En esta área una serie de técnicos se dedican enteramente a la preparación de medios y reactivos para uso común de los usuarios del laboratorio de cultivos. Son mezclas complejas que deben:  Aportar a la célula nutrientes y todo tipo de sustancias necesarias para el completo desarrollo metabólico que permita a la célula proliferar.  Reunir una serie de características físicoquímicas que: - generen condiciones microambientales adecuadas para el desarrollo celular - permitan acumular temporalmente productos de desecho del metabolismo celular - María José Jiménez Página 10 Biología Molecular y Citogenética UT8 Soportes del medio de cultivo Los recipientes y soportes sobre los cuales se realizan los cultivos celulares, son principalmente de dos tipos, de vidrio o de plástico. - Recipientes de vidrio. Son fáciles de limpiar y esterilizar y es posible la observación directa al microscopio a través de ellos. Además, el coste es relativamente bajo. - Recipientes de plástico. Tienen la ventaja de ser desechables y tener un coste asociado muy bajo. Del mismo modo, presentan una buena calidad óptica. Destacan las placas Petri como el soporte más común para realizar los cultivos Composición del medio de cultivo Todo medio de cultivo está formado por los siguientes elementos: Soluciones salinas equilibradas. La base de un medio de cultivo es una solución salina equilibrada en la que se disuelven el resto de componentes. Entre las sales minerales que habitualmente forman parte de los medios de cultivo están el cloruro sódico (NaCl), cloruro potásico (KCl), cloruro magnésico (MgCl2), fosfatos sódicos (NaH2PO4) y bicarbonatos sódicos (NaHCO3). Tampón. El medio de cultivo tiene que estar tamponado, ya que las células son muy sensibles a los cambios de pH. El tampón más utilizado ha sido el bicarbonato. Glucosa. Es la fuente de energía en muchos medios, como componente único o junto a otros hidratos de carbono. Aminoácidos. Es necesario suplementar el medio basal con los aminoácidos esenciales. Vitaminas. Influyen en la tasa de crecimiento y supervivencia de las células. Su composición varía de un medio a otro en función de la concentración de suero que se utilice. Suero fetal bovino, hormonas y factores de crecimiento. Esta categoría incluye multitud de componentes esenciales para el crecimiento de las células. María José Jiménez Página 11 Biología Molecular y Citogenética UT8 Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibióticos y antifúngicos). A fin de evitar el crecimiento de contaminantes en el cultivo se suele suplementar éste con sustancias antibióticas de diferente espectro de acción. Indicador de pH. Como el pH es un parámetro fundamental para la supervivencia del cultivo, se incluye un indicador de pH que registre cambios mínimos. El más utilizado es el rojo fenol. Características fisicoquímicas del medio de cultivo En el medio de cultivo hay que controlar:  pH: las células de cultivo suelen crecer en un rango estrecho de pH. El pH óptimo para la mayoría de las células es de 7,4 (rango 7,2-7,6).  Osmolaridad: los medios de cultivo deben ser isotónicos o ligeramente hipotónicos respecto a las células.  La Concentración de oxígeno y CO2: Descrita como la concentración de oxígeno necesaria para que un cultivo se desarrolle y prolifere correctamente. Es un factor dependiente del tipo celular cultivado. Generalmente, la concentración de oxígeno usada es la atmosférica. Los niveles de CO2 pueden influir en el pH del medio, y por eso se recomienda una concentración de 5% de CO2.  Temperatura. La temperatura tiene una gran influencia en la tasa de crecimiento de las células, de ahí la importancia de un buen control de este parámetro. Las células en cultivo son capaces de soportar temperaturas por debajo de la temperatura corporal del animal del que proceden pero no soportan temperaturas por encima de este valor. Por ejemplo, las células humanas soportan temperaturas de 4ºC durante días, pero no sobreviven más de 2 horas por encima de los 37ºC. 5.2. Aparataje de un laboratorio de cultivos. Funcionamiento y uso. La característica principal del laboratorio de cultivo celular es la asepsia. Esto es debido a que la tasa de crecimiento de las células de un cultivo es muy inferior a la de los posibles contaminantes biológicos, como hongos y bacterias. De acuerdo al mantenimiento de la asepsia en el Laboratorio de Cultivo Celular se pueden encontrar los siguientes equipos y componentes: María José Jiménez Página 12 Biología Molecular y Citogenética UT8 Cabinas de seguridad biológica o de flujo laminar Su función es la de mantener un área libre de partículas, especialmente de posibles contaminantes (bacterias, levaduras,...) que puedan acceder al cultivo. Esto se consigue mediante un dispositivo mecánico que fuerza el paso del aire a través de un filtro de gran superficie (filtro HEPA) situado o bien en el techo o en la pared frontal. De este modo, se consigue proteger al cultivo de una posible contaminación externa y proteger al individuo que manipula el cultivo. Figura 8. Cabina de flujo laminar vertical Incubadores de CO2 Es un dispositivo que sirve para mantener y hacer crecer cultivos microbiológicos o cultivos celulares. La incubadora mantiene la temperatura, la humedad y otras condiciones en grado óptimo, tales como el contenido de dióxido de carbono (CO2) y de oxígeno en su atmósfera interior. Microscopios El control morfológico del cultivo se realiza mediante el uso de un microscopio. Usado para la observación y determinación de cultivos. Pueden ser ópticos, de fluorescencia, de contraste de fase. Figura 10. Microscopio invertido Congeladores e instalación de criogenia (depósito de N2 líquido) Es preciso el almacenamiento de soluciones y células a diferentes temperaturas, para lo que se requiere: 1. Neveras (4 ºC) para el almacenamiento de medios, PBS,... 2. Congeladores de -20 ºC para el almacenamiento de suero, aditivos (glutamina, antibióticos) y soluciones enzimáticas (tripsina, colagenasa,...). 3. Congeladores de -80 ºC para el almacenamiento a largo plazo de los aditivos del medio (suero, glutamina, antibióticos,...) y de sustancias especialmente sensibles (factores de crecimiento, mitogenos, inductores,...). María José Jiménez Página 13 Biología Molecular y Citogenética UT8 4. Unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-196 ºC), para el almacenamiento de las líneas celulares. Figura 11. (Izda) Tanques de N2 líquido de diversas capacidad y (dcha) criotubos para el almacenamiento de las líneas celulares. Centrífugas Figura 12. Centrífuga Instrumentos que ponen en rotación una muestra para acelerar la decantación o sedimentación de sus componentes o fases (normalmente una sólida y una líquida) en función de la densidad. En el laboratorio de cultivo de tejidos es necesario disponer de una centrífuga refrigerada. Autoclave Un autoclave es un instrumento que permite la esterilización por calor tanto de sólidos como de líquidos. La esterilización se realiza habitualmente a 121 ºC, durante un tiempo superior a 20 min. Contador electrónico de células (cell counter) Un contador electrónico de células es un instrumento capaz de contar y medir partículas en suspensión. Equipo de purificación de agua Es de gran importancia en la preparación de los medios, de los aditivos, o en cualquier solución que pueda estar en contacto con el cultivo, una absoluta esterilidad y ausencia de sustancias que puedan provocar alguna alteración al cultivo. Por ello se utiliza siempre agua de la máxima calidad (tipo MilliQ, Millipore) obtenida mediante equipos de doble destilación o de intercambio iónico y filtración. María José Jiménez Página 14 Biología Molecular y Citogenética UT8 Baños termostatizados Todos los medios de cultivo y líquidos que entren en contacto con las células deberán estar atemperados a la temperatura óptima de crecimiento de las células. Pipeteadores y Micropipetas 6. Normas de trabajo en el laboratorio de citogenética Como ya hemos dicho, las condiciones estériles son esenciales dentro del laboratorio, especialmente en áreas de sembrado y cultivos celulares. El técnico de anatomía patológica tiene que seguir las recomendaciones para mantener la asepsia para evitar la contaminación, que puede afectar a la variabilidad celular. En los protocolos de trabajo de los laboratorios se siguen unas sencillas recomendaciones:  Es de extrema importancia lavarse las manos antes, después, y frecuentemente durante el trabajo en cultivos, para evitar contaminaciones en los experimentos, y contaminación del usuario con material biológico, y posible diseminación de éste.  Luz ultravioleta siempre que no se trabaje.  Encender la campana al menos 10 min antes de comenzar el trabajo.  Limpieza de zona de trabajo con etanol 70% al inicio y al final.  Se debe trabajar siempre con material estéril (pipetas, puntas, etc). El material estéril sólo puede abrirse, lógicamente, dentro de la campana de cultivos, o a la llama del mechero.  Por defecto, todo aquello de lo que no se esté seguro al 100% de su esterilidad ha de ser considerado como no estéril. “Asumir” que algo está estéril cuando no lo está supone, sin ninguna duda, contaminar (esto es, destruir) el experimento.  No pasar por encima de placas, botellas o recipientes abiertos. Poner tapones boca arriba y hacia la parte trasera de la campana para evitar pasar por encima de ellos.  No tocar con las pipetas ni puntas estériles ninguna superficie. Utilizar una pipeta o una punta cada vez para tener cuidado de que no se produzcan contaminaciones cruzadas.  En caso de contaminar algo involuntariamente (o incluso sospechar que esto ha pasado), se debe poner inmediatamente en conocimiento del coordinador, para evitar males mayores.  Marcar siempre cualquier tubo o recipiente que contenga algo útil, de la forma más segura posible, por ejemplo tanto en la tapa como en el tubo.  Marcar siempre las placas de cultivos en la tapa y en un lateral de la base, de manera distinta para cada placa, para evitar intercambiar tapas. María José Jiménez Página 15 Biología Molecular y Citogenética UT8  Si se ha de pipetear repetidamente un stock de una solución (p.ej. botella con medio de cultivo) es conveniente sacar de una vez la alícuota que se vaya a usar a una botella o tubo de menor volumen, para disminuir el número de veces que se introducen pipetas en la botella con el stock, y el consiguiente riesgo de contaminación.  Tanto el plástico desechable como el vidrio que haya estado en contacto con material biológico ha de ser inactivado con hipoclorito antes de tirarlo, o disponerlo para su lavado y esterilización.  Los residuos acumulados en vasos de precipitados han de ser inactivados con hipoclorito antes de tirarlos, y los vasos se dejarán con un poco de hipoclorito hasta su próximo uso.  La mesa de trabajo y las campanas se descontaminarán antes y después de trabajar con material biológico. Cualquier material biológico derramado ha de ser descontaminado inmediatamente con hipoclorito, antes de proceder a secar y lavar con jabón la superficie manchada. 7. Contaminaciones Las contaminaciones se refieren a la alteración del cultivo por la presencia de microorganismos no deseados que son omnipresentes en el medio ambiente. Los tipos de contaminantes más frecuentes son: bacterias, hongos y levaduras, micoplasmas y virus. 7.1. Bacterias levaduras y hongos Las bacterias y las levaduras son los contaminantes más habituales en cultivos a corto plazo, mientras que los hongos lo son a largo plazo. Estos contaminantes crecen perfectamente en los medios de cultivo a mayor velocidad que las células, por lo que ocasionan la muerte del cultivo en poco tiempo. Generalmente la fuente de contaminación es ambiental, debida a una mala práctica. 7.2. Micoplasmas Son microorganismos procariotas sin pared, que pueden provocar la muerte de los cultivos o alterar su crecimiento. En muchas ocasiones proceden de las propias líneas celulares continuas (se suministran ya contaminadas) o de los sueros animales. Su detección no es siempre fácil, pero la observación de gránulos oscuros en el citoplasma de las células puede ser indicativo de sospecha. María José Jiménez Página 16 Biología Molecular y Citogenética UT8 7.3. Virus Es un tipo de infección infrecuente, aunque grave. Anteriormente, la fuente principal de contaminación viral eran los sueros (ahora están muy controlados). Su detección se basa en la detección del efecto citopático característico de cada virus. 8. Técnicas de obtención, mantenimiento y proliferación de cultivos 8.1. Recolección de muestras para la obtención de cultivos celulares en citogenética. Los cultivos celulares se obtienen exclusivamente de tejidos vivos que contienen células con núcleo. En el ámbito de la genética clínica postnatal, la muestra por excelencia es la sangre periférica, ya que se usan los glóbulos blancos de la sangre porque son de fácil acceso. Otras muestras a partir de las cuales se podrían obtener cultivos son la biopsia de piel o la biopsia de gónadas. En el diagnóstico genético prenatal las muestras a partir de las cuales se pueden obtener cultivos celulares son:  Líquido amniótico: se obtiene por amniocentesis, una técnica invasiva de diagnóstico prenatal que se realiza a las 15-18 semanas de gestación. El riesgo de aborto se sitúa en el 0,2-0,5%, porque se necesita un amplio volumen de muestra (aprox. 20ml).  Vellosidades coriónicas: se obtienen por vía transcervical o transabdominal. La biopsia coriónica se realiza a las 11-13 semanas de gestación y es una técnica invasiva que conlleva un riesgo de aborto del 0,5-1%. Se indica cuando existe un alto riesgo de anomalía fetal. En ocasiones, se ha visto que pueden existir fallos en el cultivo.  Sangre fetal de cordón umbilical: se obtiene mediante cordocentesis o foniculocentesis. Esta técnica no se emplea prácticamente, porque existe un riesgo de aborto de un 2-6%. La cordocentesis se suele realizar a las 18-19 semanas de gestación. En muchos laboratorios de citogenética es de interés el cultivo de restos abortivos, para tratar de averiguar si existía alguna alteración cromosómica en el feto muerto. En el diagnóstico oncológico son útiles los cultivos que se obtienen a partir de sangre periférica, médula ósea, ganglios linfáticos y biopsias de tumores. María José Jiménez Página 17 Biología Molecular y Citogenética UT8 Un técnico de AP en un laboratorio de citogenética ha de desarrollar un gran conocimiento sobre un cultivo concreto en los siguientes aspectos: 8.2. Realización de cultivos celulares El primer paso para realizar un cultivo celular es aislar y separar los diferentes componentes del tejido mediante técnicas de disgregación. Esta puede ser mecánica o enzimática. Con este proceso se consiguen los diferentes tipos celulares que forman parte del tejido, estos son viables y con capacidad de proliferación. El siguiente proceso sería la separación de los distintos tipos celulares. Para ello, se pueden utilizar diferentes métodos como la centrifugación, permitiéndose la separación de células por su tamaño. También se puede utilizar la capacidad de adherencia al sustrato que presentan algunos tipos celulares. Una vez conseguido el tipo celular de interés para realizar el cultivo, se realiza la siembra del mismo, consiguiendo el cultivo primario, a partir del cual se tendrán que hacer resiembras. Las resiembras de los cultivos en monocapa (con las células adheridas), se pueden llevar a cabo mediante diferentes métodos. María José Jiménez Página 18 Biología Molecular y Citogenética UT8 Métodos de disgregación de células adheridas a la placa Mecánicos Se emplean con frecuencia los métodos de rascado (“scrapping”) de la placa para arrancar las células adheridas. Figura 13. Espátulas de scrapping Químicos Se reduce la concentración de los iones que estabilizan las uniones de las proteínas de la matriz extracelular y de éstas con los receptores celulares. Enzimáticos Tratamiento del tejido o del cultivo celular con soluciones de proteasas activas (colagenasa, dispasa, tripsina, elastasa, papaína, pronasa, hialuronidasa, etc...) Sin embargo en la práctica se suelen emplear técnicas que combinan dos o tres métodos. La elección de uno u otro procedimiento dependerá fundamentalmente de la naturaleza y cantidad de tejido o cultivo disponible y del uso previsto de las células obtenidas. Congelación y Descongelación de las células en cultivo Una vez analizadas las células en cultivo, no se pueden mantener indefinidamente en cultivo, ya que su mantenimiento supondría un enorme gasto y además ocuparían un gran espacio en el incubador, limitando el trabajo con nuevas muestras. En este sentido, se pueden almacenar congeladas, como hemos comentado previamente, constituyendo lo que se denomina, un banco de células. Para ello, el técnico del laboratorio de citogenética debe elaborar una base de datos informatizada en la que figuren los datos más relevantes de esa línea celular, así como la posición de la misma en el tanque de N2, para facilitar su localización cuando fuese necesario. María José Jiménez Página 19 Biología Molecular y Citogenética UT8 9. Determinación del número de células y viabilidad celular 9.1. Técnicas de recuento celular Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje de éstas que son viables. Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas, desde la relativamente simple cámara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la cámara de Neubauer, hasta equipos automáticos de contaje celular como el Cell Coulter. Figura 14. Mecanismo contaje Cell Coulter. Cámara de Neubauer Es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la figura 15.A. Figura 15. A. Grabado de las cuadrículas en una cámara de contaje celular Neubauer. B. Detalle de una de las zonas L, donde se aprecia la división en 16 pequeños cuadrados de 0,25 milímetros de lado. C. Muestra de la determinación del número y viabilidad celular con Azul Trypan. Es un cuadrado de 3 × 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0,25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado. En la figura 15.B. se puede observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el microscopio se ven como una cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0,25 milímetros de lado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0,1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0,1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0,1 milímetro cúbico, es decir 0,1 microlitro. María José Jiménez Página 20 Biología Molecular y Citogenética UT8 Si contamos las cuatro áreas sombreadas (L) observando un total de x células entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será: Concentración en la suspensión (células/ml) = 10.000*x/4 Cell Coulter o Citometría de flujo La Citometría de flujo (CMF) es una técnica de análisis celular automático, cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de células por un haz de luz (láser), midiendo las características de dispersión de la luz y/o fluorescencia asociadas a cada tipo celular a medida que pasan a través del rayo. El impacto de cada célula con el haz de luz produce señales que se traducen en información correspondiente a diferentes parámetros celulares. De esta forma se obtiene información sobre tamaño, estadío de diferenciación, características antigénicas, etc. Por tanto, con el uso de la CMF s posible la identificación de una célula a través de la descripción de sus características morfológicas. 9.2. Determinación de la viabilidad celular Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el de tinción con azul tripán. El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan roturas en la membrana. Así pues las células que aparecen en la imagen, claramente de color azul, son consideradas no viables. María José Jiménez Página 21 Biología Molecular y Citogenética UT8 A tener en cuenta:  Es vital conocer los protocolos de trabajo y las normas de seguridad cuando se trabaja con cultivos celulares para preservar la muestra y la seguridad personal del técnico.  Se debe evitar la contaminación de los cultivos celulares, por lo que es importante trabajar en campanas de flujo laminar.  Es importante conocer el funcionamiento de los aparatos de un laboratorio de citogenética y extremar su limpieza para evitar contaminaciones.  No se deben emplear medios de cultivo que contengan fungicidas, porque inhiben el crecimiento celular.  Los tipos de contaminaciones más frecuentes son por bacterias, hongos, levaduras, micoplasmas y virus.  Los principales conocimientos de un técnico de AP en un laboratorio de citogenética han de estar relacionados con Morfología y ciclo celular/ Forma y tiempos de digestión/ Densidad de siembra/ Selección de medios a emplear: suero/ Cuando hacer y cambiar medios  La cámara de Neubauer sirve para realizar un recuento celular.  Se trata de un cultivo largo cuando las muestras son de líquido amniótico, restos abortivos, vellosidades coriónicas o fibroblastos de piel. María José Jiménez Página 22