HPLC High Performance Liquid Chromatography PDF

High Perfomance Liquid Chromatography  HPLC. Índice Introducción. Tipos de cromatografía líquida Sistema de inyección Precolumnas y columnas Horno Disolventes fase móvil Bombas Detectores Derivatización Cálculos en HPLC Aplicaciones ...

High Perfomance Liquid Chromatography  HPLC. Índice Introducción. Tipos de cromatografía líquida Sistema de inyección Precolumnas y columnas Horno Disolventes fase móvil Bombas Detectores Derivatización Cálculos en HPLC Aplicaciones  HPLC La cromatografía líquida puede llevarse a cabo por cuatro técnicas analíticas: C. En papel C. En capa fina C. en columna C. Líquida de alta resolución: HPLC.  HPLC Existen diferentes modalidades de HPLC, dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria Modalidad Fase estacionaria Adsorción (líquido-sólido) Sólido adsorbente Partición o reparto Líquido inmiscible con la fase móvil Fases ligadas Sustancia ligada por enlace covalente (reparto/adsorción) a un soporte sólido Intercambio iónico Resina cambiadora de iones Exclusión Sólido de porosidad controlada Afinidad Ligando afinidad  TIPOS DE HPLC Fase Mecanismos Fase Móvil de Separación Estacionaria Adsorción Sólido Líquido Exclusión Resina Líquido Intercambio cambiadora Iónico Líquido Reparto o Líquido partición  HPLC Los componentes básicos de un equipo de HPLC son: Reservorios de disolventes (fase móvil) Bomba de presión Sistema de inyección de la muestra Horno: donde se encuentra la precolumna y la columna Detector Ordenador y software: donde quedan registrados todos los datos del análisis, es decir, los cromatogramas con los tiempos de retención, áreas de los picos, etc.  Esquema del equipo de HPLC INYECTOR PRE-COLUMNA BOMBA CÁMARA DE MEZCLA COLUMNA DETECTOR HPLC LOS COMPONENTES DE UNA LAS SEPARACIONES ESTÁN LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA ES LA TÉCNICA ANALÍTICA DE MEZCLA SON LLEVADOS BASADAS EN LAS DIFERENCIAS DE ALTA RESOLUCIÓN SE SEPARACIÓN MÁS TRAVÉS DE UNA FASE DE LA VELOCIDAD DE CARACTERIZA POR EL EMPLEO AMPLIAMENTE UTILIZADA ESTACIONARIA FIJADA MIGRACIÓN ENTRE LOS DE UNA FASE ESTACIONARIA DEBIDO A SUS CUALIDADES DENTRO DE UNA COLUMNA COMPONENTES DE LA CONSTITUIDA POR DE SENSIBILIDAD, SU FÁCIL MEDIANTE EL FLUJO DE UNA MUESTRA, QUE VIENEN PARTÍCULAS DE TAMAÑO ADAPTACIÓN A LAS FASE MÓVIL LÍQUIDA. CONDICIONADAS POR LA MUY PEQUEÑO, DEL ORDEN DETERMINACIONES NATURALEZA DE LOS DE LOS M. ESTO HACE QUE CUANTITATIVAS EXACTAS, SU ANALITOS Y SU INTERACCIÓN LA EFICACIA DEL SISTEMA SEA IDONEIDAD PARA LA CON LAS FASES. MUY ELEVADA. SEPARACIÓN DE ESPECIES NO VOLÁTILES O TERMOLÁBILES Y SU GRAN ADAPTABILIDAD A SUSTANCIAS QUE SON DE GRAN INTERÉS PARA LA INDUSTRIA, LA CIENCIA Y LA SOCIEDAD.  Las columnas de HPLC estas hechas de acero inoxidable, con un diámetro interno de 2-5 mm y una longitud variable de 10 a 30 cm, dependiendo del diámetro de las micropartículas que contiene la columna (fase estacionaria), que puede ser de 3-10 µm. Como cierre de las columnas se utilizan placas filtrantes de acero que no dejen escapar las micropartículas de la columna. En muchos casos se utiliza una precolumna para eliminar contaminantes y partículas de polvo. La mayor parte de los instrumentos comerciales modernos están equipados con un horno para la columna, el cual controla la temperatura. Manteniendo la temperatura constante se obtienen mejores cromatogramas. Son necesarias bombas de presión para conseguir velocidades de flujo razonables (de 0,5 a 2 mL/min normalmente). HPLC Se dispone de varios reservorios de disolvente que pueden contener cada uno más de 500 ml. Es necesario que estos reservorios vayan acompañados de desgasificadores para eliminar los gases del disolvente, pues producen burbujas en la columna interfiriendo en los resultados. El sistema de inyección de muestra se basa en válvulas dosificadoras que permiten una aplicación cuantitativa y reproducible a presión elevada. Proporcionan una selección del tamaño de la muestra que va desde 5 a 500 µl. La muestra se pasa primero al bucle sin presión, para luego pasar a la columna accionando el flujo del disolvente con una llave de varias vías o válvulas de membrana. La muestra no debe contener sólidos para que no se atasque la columna, si es necesario deberá filtrarse por un filtro de membrana o precolumna. Lo mejor es disolver la muestra en el eluyente que se vaya a emplear en la separación. El volumen inyectado de muestra debe ser lo más pequeño posible, para que los resultados aparezcan más nítidos.  Fase normal y fase reversa La cromatografía en fase normal (fase estacionaria más polar que la fase móvil), y la cromatografía en fase reversa (fase estacionaria menos polar que la fase móvil). Cromatografía de fase normal: La fase estacionaria presenta puntos activos de alta polaridad y las interacciones que se producen con el soluto son específicas del grupo activo. La fase estacionaria puede ser un sólido adsorbente (sílice o alúmina), o bien, un soporte al que se unen químicamente moléculas orgánicas que presentan grupos funcionales de alta polaridad (ciano, amino, etc). Cromatografía de fase reversa (inversa): La fase estacionaria tiene una naturaleza apolar (cadenas hidrocarbonadas, grupos fenilo) y las interacciones que se producen son inespecíficas (efecto solvófobo). Se suele utilizar como fase móvil: agua, metanol, acetonitrilo  HPLC Fases Químicamente Ligadas C8 media C18 (ODS) muestra fuerte C4 muestra débil muestra  HPLC Fases Químicamente Ligadas  HPLC Fases estacionarias Interacción Si C8 van der Waals Si PH van der Waals Si C2 van der Waals  HPLC Fases estacionarias Interacción O H CN Dipolo/Dipolo Si C N H NH2 Si N Puentes de H H O hidrógeno Si O O O H Puentes de 2OH H H hidrógeno O  HPLC Fases estacionarias Interacción H3+N PRS Electrostática Si SO3- H3+N CBA O Si O- Electrostática -O S 3 SAX Si N+(CH3)3 Electrostática  HPLC Ejemplo de fase reversa: TIEMPO DE RETENCIÓN Y HIDROFOBICIDAD OH C18 (ODS) Interacción débil fuerte OH  HPLC Cromatografía en fase reversa (RP) La mayoría de los análisis cromatográficos actuales se llevan a cabo por cromatografía en fase reversa. Esta modalidad emplea una fase estacionaria apolar, generalmente una cadena hidrocarbonada, C8 o C18, junto a una fase móvil polar, constituida por una mezcla de agua o tampón con un disolvente orgánico miscible como MeOH o Acetonitrilo. El poder eluyente de la fase móvil se regula variando la proporción Agua/Disolvente orgánico. Cuanto mayor sea la proporción de agua menor será el poder eluyente de la fase móvil, y por tanto, mayores los tiempos de retención.  HPLC Efecto de la fase móvil en la separación  Bombas en HPLC Requerimientos Generación de altas presiones (1000 - 6000 psi) psi (pound per square inch, libras por pulgada cuadrada) 1 kg/m2 = 9,8 Pa 1 bar = 105 Pa 1 psi = 0.069 bar 1 atm= 101325 Pa Flujo libre de pulsaciones Caudales 0.1 – 10 mL/min Componentes resistentes a la corrosión (acero inoxidable, teflón)  La fase móvil Análisis en modo isocrático y en modo gradiente En modo isocrático se mantiene constante la composición de la fase móvil durante la cromatografía. La polaridad del eluyente no cambia durante el análisis de la muestra En el modo en gradiente se varía la proporción del disolvente en la fase móvil de forma programada para obtener una mejor separación y resolución. En gradiente modificamos ε0 (parámetro de desplazamiento o fuerza desplazante o poder de elución) durante le proceso cromatográfico. Elución isocrática vs elución con gradiente Elución con Elución gradiente isocrática Disolventes utilizados en HPLC como fase móvil  La fase móvil Propiedades de disolventes utilizados en HPLC Los parámetros utilizados son: Viscosidad dinámica Tensión superficial Polaridad (mediante momento dipolar (Debye) o según Zinder) Fuerza desplazante (ε0 solvent Strength referida a silica o a Al2O3 según Snyder). Los disolvente los podemos dividir: Apolares o no polares. Ej: Disolventes con momento dipolar cero. Ej: n-hexano, ciclohexano, tetracloruro de carbono, tolueno. Polares: – Próticos: contienen un enlace O-H o N-H. Ej: agua, etanol, ácido acético. – Apróticos: no tiene enlaces O-H o N-H. No dan ni aceptan protones. Ej: acetona , acetonitrilo, dimetilformamida ,THF (Tetrahidrofurano).  La fase móvil Disolventes polares: Se utilizan para disolver sustancias polares. – Próticos – Apróticos Disolventes apolares: Son sustancias químicas o una mezcla de las mismas, que son capaces de diso lver sustancias no hidrosolubles – éter dietílico, cloroformo, benceno, tolueno, xileno, cetonas, hexano, ciclohexano y tetracloruro de carbono.  La fase móvil Disolventes polares Disolvente Tipo: Polar PE (ºC) Constante Momento Cte dieléctrica dipolar (D) autoprotólisis Agua Prótico 100 78.5 1.82 1.01 *10-14 Metanol Prótico 65 32.6 1.71 2 *10-17 Etanol Prótico 78 24.3 8 *10-20 Ácido fórmico Prótico 58.5 6 *10-7 Ácido acético Prótico 118 6.2 3.6 *10-15 Ácido sulfúrico Prótico >84 1.4 *10-4 Acetona Aprótico 56.5 20.7 2.88 Acetonitrilo Aprótico 81.8 37.5 3.92 Formamida Aprótico 111 111 3.73 DMF Aprótico 39.9 36.71 3.86 DMSO Aprótico 87 46.6 3.9  Disolvente Fórmula química Punto de ebullición Constante dieléctrica Densidad Disolventes no polares CH3-CH2-CH2-CH2-CH2- Hexano 69 °C 2,0 0,655 g/ml CH3 Benceno C6H6 80 °C 2,3 0,879 g/ml Tolueno C6H5-CH3 111 °C 2,4 0,867 g/ml Éter dietílico CH3CH2-O-CH2-CH3 35 °C 4,3 0,713 g/ml Disolventes polares apróticos 1,4-Dioxano CH2-CH2-O-CH2-CH2-O 101 °C 2,3 1,033 g/ml Acetato de etilo CH3-C(=O)-O-CH2-CH3 77 °C 6,0 0,894 g/ml Cloroformo HCCl3 61 °C 4,8 1,498 g/ml Tetrahidrofurano (THF) CH2-CH2-O-CH2-CH2 66 °C 7,5 0,886 g/ml Diclorometano (DCM) CH2Cl2 40 °C 9,1 1,326 g/ml Acetona CH3-C(=O)-CH3 56 °C 21 0,786 g/ml Acetonitrilo (MeCN) CH3-C≡N 82 °C 37 0,786 g/ml Dimetilformamida (DMF) H-C(=O)N(CH3)2 153 °C 38 0,944 g/ml Dimetil CH3-S(=O)-CH3 189 °C 47 1,092 g/ml sulfóxido (DMSO) Disolventes polares próticos Ácido acético CH3-C(=O)OH 118 °C 6,2 1,049 g/ml n-Butanol CH3-CH2-CH2-CH2-OH 118 °C 18 0,810 g/ml Isopropanol (IPA) CH3-CH(-OH)-CH3 82 °C 18 0,785 g/ml n-Propanol CH3-CH2-CH2-OH 97 °C 20 0,803 g/ml Etanol CH3-CH2-OH 79 °C 24 0,789 g/ml Metanol CH3-OH 65 °C 33 0,791 g/ml Ácido fórmico H-C(=O)OH 100 °C 58 1,21 g/ml Agua H-O-H 100 °C 82 1,000 g/ml La fase móvil: Disolventes en HPLC  La fase móvil Orden en polaridad ascendente de diversos disolventes: Hexano – Isooctano - Tetracloruro de carbono – cloroformo - cloruro de metileno – tetrahidrofurano - éter etílico – acetona - acetato de etilo - dioxano – acetonitrilo - 2-propanol – metanol – agua. Polaridad Alta - COOH Acidos carboxílicos - OH Alcoholes - NH2 Aminas - SH Tioles - CHO Aldehidos - CO Cetonas Baja - COOR Ésteres - OCH3 Éteres Hidrocarburos No-Saturados Hidrocarburos Saturados  Fase móvil en cromatografía líquida: Calidad alta (HPLC) La fase Filtración previa a 0,45 μm y desgasificado móvil Disolventes orgánicos: Ciclohexano, acetonitrilo, acetato de etilo, metanol, etanol, dioxano, acetona Disolventes inorgánicos: agua calidad HPLC, disoluciones acidificadas, soluciones iónicas, etc. 29  La fase móvil Filtración y Desgasificación de solventes En el instante que se abre una nueva botella de solvente para HPLC se expone el interior del solvente a la atmósfera y empieza a acumular gases disueltos que se encuentran en la atmósfera. El Oxígeno Disuelto que constituye el 21% de la atmósfera puede producir mayor interferencia en los detectores de fluorescencia y electroquímicos. El Nitrógeno Disuelto es el otro componente de la atmósfera que puede producir burbujas en la columna de HPLC y cuando el solvente entra al detector produce picos falsos y desviaciones de la línea base. El Dióxido de Carbono disuelto algunas veces puede ser la causa de los cambios de pH en el sistema de solvente.  Métodos de Filtración de Solventes en HPLC Filtro a la Entrada del Solvente Filtración al Vacío Filtración en Línea La fase Métodos de Desgasificación móvil de Solventes en HPLC Sonificación (ultrasonidos) Burbujear Helio Desgasificación Electrónica en la Línea del Flujo Desgasificación al Vacío en Línea  Columnas en HPLC Precolumnas Contiene un empaquetamiento igual a de la columna. La finalidad es retirar las impurezas del disolvente o de la muestra. http://www.cromlab.es/COL_LC_ThermoFisher_Proteccion.htm  Columnas en HPLC Precolumnas Composición similar a la columna cromatográfica Elimina materia en suspensión y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la FE Se usa para mejorar la vida de la columna. Se reemplaza cuando se contamina. Columnas en HPLC NOMBRE SUPERFICIE N PH TIPO DE COMERCIAL ESPECÍFICA PORO PARTÍCUL. A Hypersil 170 11,5 nm 9,0 esférica m2/g LiChrosorb 100 -320 11,1 nm 7.0 irregular m2/g Propiedades de algunos rellenos Porasil 350 10.0 nm 7.2 irregular de columnas basados en sílice: m2/g Spherisorb 190 8,1 nm 9.5 esférica m2/g Zorbax BPSil 300 5,6 nm 3.9 esférica m2/g Pecosphere 300 8 nm - esférica m2/g  Columnas en HPLC Los parámetros que definen a una columna son: Longitud y diámetro. Ej: 250 x 4 mm Tamaño de partícula. Ej: 5 micras Tamaño de poro:. Ej: 100 Å Tubos de acero inoxidable. Columnas termostatizadas: en general se trabaja a T ambiente. La T constante mejora el cromatograma  Columnas en HPLC El mecanismo suele ser de partición, es decir, líquido- líquido. Las columnas deben lavarse habitualmente y realizar una regeneración de la misma con cierta habitualidad. El tipo de regeneración depende del tipo de columna. En una columna se suele especificar: Número de platos teóricos por metro (suele estar alrededor de 50.000) Rango de pH ( de 2 a 7.5). Factor de retención k Factor de separación. etc.  Columnas en HPLC Rellenos Relleno pelicular. Esferas de vidrio o polímero no porosas de 30 – 40 m de diámetro. En la superficie de las esferas se deposita una capa delgada y porosa de sílica, alúmina, polímero. Relleno de partículas. Micropartículas porosas de sílica, alúmina o polímero de 3 – 10 m de diámetro. Se recubren con películas orgánicas que unen químicamente o físicamente a la superficie.  Columnas en HPLC Se suelen fabricar con acero inoxidable. Tiene una longitud de 125 o 250 mm y un diámetro interno de 4 mm. El empaquetamiento de las columnas: – la gel de sílice dividida es la más utilizada – Alúmina – Celite (tierra de diatomeas). El tamaño uniforme de partícula es de 5 a 10 micras. La casa Merck posee tres tipos de columnas: Lichrosorb, que contiene partículas de forma irregular. Posee con soporte polares, de polaridad mediana y de fase invertida (RP-2, RP-8 y RP-18). El relleno es silicagel, óxido de aluminio básico, silicagel con grupos amino, hidroxilo, etc. Lichrospher es basada en partículas esféricas de silicagel. Presenta los tres tipos: normal, media e invertida Perisorb. Tamaño de partícula más grande, de 30-40 micras. Partículas esféricas.  Columnas en HPLC Procedimientos de restauración o limpieza de columnas Columna RP-18: Muestra soluble en agua: 1.- 50 mL de agua caliente ( 40-60ºC) 2.- 50 mL de metanol 3.- 50 mL acetonitrilo 4.- 30 mL Tetrahidrofurano (THF) 5.- 25 mL Metanol 6.- 25 mL Fase móvil Muestra no soluble en agua: 1.- 50 mL 2-propanol 2.- 50mL THF 3.- 50 mL Cloruro de metileno 4.- 50 mL hexano 5.- 25 mL Isopropanol 6.- 25 mL Fase móvil Pinchazos con Dimetilsulfóxido/Agua 50/50 utilizando agua como eluyente.  Filtros de 0,45 micromETROS DE NYLON Filtración de FILTROS DE PTFE HIDRÓFOBO polímero de Politetrafluoroetileno (PTFE) disoluciones a Este tipo de membranas tienen un gran abanico de aplicaciones tanto en la versión natural hidrofóbica como en la tratada pinchar en hidrofílica. Filtros de membrana hplc Nylon (NY): soluciones acuosas. Teflón (PTFE): ácidos, bases o disolventes, HPLC  HPLC detectors Here we will discuss the most common HPLC detectors: Refractive index UV/Vis – Fixed wavelength – Variable wavelength – Diode array DAD Fluorescence Conductivity Mass-spectrometric (LC/MS) Evaporative light scattering  HPLC detectors Detectores selectivos: responden a una propiedad del soluto en disolución Detectores universales: responden cuando una propiedad de la fase móvil es cambiada por la presencia de un soluto  HPLC detectors Basados en la medida de una propiedad del eluyente (índice de refracción, constante dieléctrica, densidad) Basados en la medida de una propiedad del soluto (absorbancia, fluorescencia, corriente límite) Requisitos ❖ Sensibilidad adecuada ❖ Respuesta lineal amplia ❖ Respuesta rápida y reproducible ❖ Manejo sencillo  HPLC detectors Detector: ÍNDICE DE REFRACCIÓN Marca: Jasco Mod. RJ-2031 Termostatizado con sistema Peltier Programación de purga de celda de referencia Bajo ruido y línea base estable http://www.jascoinc.com/ HPLC detectors Detector de fluorescencia La luminiscencia o emisión de luz tiene lugar cuando las moléculas pasan de un estado excitado a su estado natural. Las moléculas pueden excitarse mediante diferentes formas de energía, cada una con su propio proceso de excitación. Por ejemplo, cuando la fuente de energía de excitación es la luz, el proceso se denomina fotoluminiscencia.  HPLC detectors Detector de fluorescencia La fotoluminiscencia es el nombre colectivo para dos fenómenos, fluorescencia y fosforescencia, que presentan entre sí una diferencia característica: el retraso de la emisión tras la excitación. Si una molécula emite luz entre 10-9 y 10-5 segundos después de ser iluminada, el proceso se denomina fluorescencia. Si emite luz durante un tiempo mayor de 10-3 segundos tras la iluminación, el proceso se denomina fosforescencia. La fosforescencia es un proceso más largo  HPLC detectors Detector de fluorescencia El máximo característico de absorción de una sustancia es su λEX, y el de emisión su λEM HPLC detectors Detector de fluorescencia  HPLC detectors Diode Array Detector DAD Fue introducido a mediados de los años 1970. La base del funcionamiento de los espectrómetros de arreglo de diodos es simple: el haz de radiación que ha atravesado la columna cromatografía, es dispersado por medio de una red de difracción fija, siendo recogidas simultáneamente todas las longitudes de onda dispersadas mediante una matriz de fotodiodos. HPLC detectors Diode Array Detector DAD Toda la luz de la fuente atraviesa la muestra, y luego es dispersada, en lugar de una ranura de salida, tiene en el plano focal un dispositivo que integra en un pequeño circuito varios cientos de detectores tipo fotodiodo de silicio. El número de elementos varía actualmente entre 64 y 4096, siendo los más comunes 512 y 1024 elementos. Este detector se compone de una serie de diodos fotosensibles lado a lado y aislados unos de otros en forma de capas múltiples sándwich. Cada diodo tiene un espesor muy pequeño y la salida de cada uno se puede escanear, almacenar y posteriormente procesadas por un ordenador en un numero de maneras diferentes. https://www.agilent.com/en-us/products/liquid- chromatography/lc-detectors/1290-infinity-diode- array-detector  HPLC detectors Diode Array Detector DAD http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1290- infinity-diode-array-detector/1290dad-1260dad-video Derivatización  Derivatización Se derivatizan compuestos o mezclas de compuestos antes del análisis por los siguientes motivos: Para que un compuesto que no se puede analizar mediante un método particular resulte idóneo para el análisis Para mejorar la eficacia analítica del compuesto Para mejorar la detectabilidad del compuesto  Derivatización Ejemplo: Determinación aminoácidos por HPLC La detección de los distintos aminoácidos y el amonio se realizó con un detector de fluorescencia usando λex = 250 nm (EXCITACIÓN) Λem= 395 nm. (EMISIÓN)  Derivatización Determinación aminoácidos por HPLC El método consiste en la derivatización de los aminoácidos con O-ftalaldehído Se utiliza como fase estacionaria una columna de C-18 y como fase móvil un gradiente de acetonitrilo, buffer fosfato de pH 7,2 (a temperatura ambiente Detector de fluorescencia El análisis se completa en 52 minutos Problemas más comunes encontrados en HPLC – Presión Alta Posible causa: Obstrucción de la Columna de HPLC o Guarda Columna por partículas. Solución: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente, teniendo la columna desconectada del detector. Si esto no funciona reemplace el fritado a la entrada de la columna. Si la presión sigue alta reemplace la columna. Solución a largo plazo: Asegúrese que todas las fases móviles se filtren apropiadamente antes que entren a la bomba de HPLC. También filtre todas las muestras antes de inyectarlas. – Pérdida de la Resolución Posible causa: Obstrucción de la Columna de HPLC ó del Guarda Columna por partículas. Solución a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases móviles en el sistema de HPLC. – Picos Hendidos (cortados) Posible causa : Obstrucción de la Columna de HPLC o del Guarda Columna por partículas. Solución: Si es necesario reemplace el fritado de la entrada o la columna. Solución a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases móviles en el sistema de HPLC. – Variación en los Tiempos de Retención Posible causa : Aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase móvil. Solución : Asegúrese que la fase móvil está adecuadamente desgasificada. Problemas más comunes encontrados en HPLC – Variaciones de la Línea Base Posible causa: Burbujas del aire atrapados en la celda del detector debido a una mala desgasificación de los solventes de la fase móvil. Solución: Asegúrese que todas las fases móviles estén debidamente desgasificadas y considerar el uso de un restrictor de la presión a toma de corriente del detector. – Línea Base con mucho Ruido Posible causa: Aire atrapado en celda del detector o en la bomba. Solución: Enjuage el sistema y purge la bomba de HPLC. Use Solventes desgasificados adecuadamente para mantener constante la velocidad de flujo de la fase móvil del sistema. – Picos Falsos (Detectores Electroquímicos y de Fluorescencia) Posible causa: Oxígeno Disuelto Solución: Desgasificar adecuadamente las fases móviles para reducir la concentración de oxígeno disuelto. Solución a largo plazo: Agregar un sistema de filtración al vacío en línea. Periódicamente chequear el nivel de oxígeno disuelto. – Baja ó Ninguna Presión Posible causa: Trabajar con bombas, sellos ó pistones expuestos por mucho tiempo a partículas en suspensión en la fase móvil. Solución: Reemplace los sellos o pistones, si es necesario.  Cuántas muestras y tipos de ensayos La facilidad para reemplazar los sellos de las Recomendaciones bombas (mantenimiento) sistema de HPLC para adquirir un La exactitud y precisión del sistema de bombas El Sistema de Gradiente. La suavidad y reproducibilidad de la mezcla Qué tipo de servicio ofrecen o puede ofrecer la casa vendedora Suministro de software y compatibilidades Cuánto puede PAGAR usted! CÁLCULOS EN CROMATOGRAFÍA Ximo Balaguer Análisis Instrumental II 2ºLACC  Recta de calibrado normal TIPOS DE CÁLCULOS Recta de calibrado con patron interno 1 punto de calibrado: factor de respuesta 1 punto de calibrado com patron interno: Factor de respuesta  Cálculos en Principales parámetros que pueden obtenerse a partir de CROMATOGRAFÍA un cromatograma. tiempo de retención (tR) respuesta del detector altura del pico inyección área del pico “pico” del solvente línea de base tiempo  Cálculos en CROMATOGRAFÍA ANÁLISIS CUALITATIVO Disolución estándar Señal analítica F1 La muestra no contiene CH4 Octano Nonano Decano metano ni octano. Tiempo Si los contiene será a concentraciones inferiores Muestra a los correspondientes límites de detección Señal analítica CH4 Octano ¿Nonano? ¿Decano? Tiempo Identificación positiva: - Comparación de datos de retención - Uso de detectores en línea  Cálculos en CROMATOGRAFÍA ANÁLISIS CUANTITATIVO MÉTODOS DE ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO CUANTITATIVO 1. Curva de calibrado 0,4 Área de pico, s 0,3 0,2 Área 0,1 Señal analítica Altura, h 2.- Factores de Respuesta (FR): 1 patrón 0,0 0 5 10 15 20 25 30 Concentración, ng ml-1 tm tr Tiempo  Cálculos en cromatografía Método del estándar interno 0,35 Area de pico/Area del estándar interno 0,30 0,25 Se añade a disoluciones 0,20 patrón y a muestras 0,15 0,10 Analito 1 0,05 Señal analítica Estándar 0,00 0 10 20 30 40 50 60 interno -1 Concentración, ng ml Analito 2 Tiempo Fig.1  Cálculos en CROMATOGRAFÍA Método del estándar interno  Cálculos en CROMATOGRAFÍA Cálculo con factor de respuesta Se utiliza el factor de respuesta FR que es el cociente entre área del patrón y su concentración. FR= área patrón /concentración patrón Las ppm de un analito son: ppm = (Área / FR) * V final (mL) / Peso muestra (g) Response factor is the ratio between a signal produced by an analyte, and the quantity of analyte which produces the signal  Cálculos en CROMATOGRAFÍA Cálculo con factor de respuesta Se utiliza el FR= área patrón /concentración patrón Las ppm de un factor de analito son: respuesta FR que es el cociente entre área del patrón y su ppm = (Área / FR) * V final (mL) / Peso concentración. muestra (g) Response factor is the ratio between a signal produced by an analyte, and the quantity of analyte which produces the signal  Cálculos en CROMATOGRAFÍA Uso de patrón externo Uso de patrones externo e interno S S P Área S Área S Área P Área Sx Área Sx Área P Sx [S] Sx [S]/[P] P  APLICACIONES HPLC -Detección y cuantificación de sacarina, benzoatos, cafeína y aspartamo en refrescos. -Detección de ciclamato en jugos de fruta. -Separación de ésteres de ácidos grasos por fase inversa y con argentización de columnas (Silicato de Al con Ag). -Separación de Triglicéridos por la longitud de la cadena y el grado de insaturación por fase inversa y detector de dispersión luminosa, para el estudio de aceites y grasas adulteradas. -Determinación del contenido de Vit A y sus precursores (α y β caroteno) en margarina y aceites de hígado por fase inversa. -Determinación del contenido en Vit D en leche en polvo y cereales por fase normal. APLICACIONES HPLC Detección y cuantificación de azúcares y edulcorantes Detección de colorantes. Separación de ésteres de ácidos grasos Separación de Triglicéridos Determinación del contenido de Vitaminas. Determinación de azúcares Determinación de plaguicidas  APLICACIONES HPLC LC DE REPARTO Sulfonamidas en miel Fase reversa. Elución en gradiente con mezcla ACN:agua. PAHs, pesticidas, sulfonamidas, vitaminas, drogas y sus metabolitos, antibióticos, esteroides, analgésicos, colorantes, ácidos grasos, nucleótidos ….  APLICACIONES HPLC LC DE INTERCAMBIO IÓNICO A B  APLICACIONES HPLC LC DE EXCLUSIÓN La separación de proteínas es una aplicación importante de la cromatografía de exclusión molecular. El cromatograma mostrado presenta la separación de cinco proteínas de masas moleculares comprendidas entre 12400 y 290000, obsérvese que éstas son eluidas en orden decreciente de su masa molecular. APLICACIONES HPLC  APLICACIONES HPLC The Analysis of Milk Aflatoxins by HPLC using Fluorescence Detection  https://www.youtube.com/watch?v=kz_egMtdn Videos sobre L4 cromatografía https://www.agilent.com/en/solutions/food- testing-agriculture/beverage-analysis/beer- analysis http://www.dionex.com/en-us/index.html https://www.agilent.com/en/solutions/food- testing-agriculture/beverage-analysis/beer- analysis