Introducción a la Histología PDF

Tema 1 Introducción a la Histología Índice Concepto de tejido Preparación de muestras Tinciones convencionales Técnicas inmunohistoquímicas y moleculares Técnicas especiales para microscopía electrónica Interpretación de cortes histológicos  Histología Del griego antiguo...

Tema 1 Introducción a la Histología Índice Concepto de tejido Preparación de muestras Tinciones convencionales Técnicas inmunohistoquímicas y moleculares Técnicas especiales para microscopía electrónica Interpretación de cortes histológicos  Histología Del griego antiguo (histós, “tejido” ) es la ciencia que estudia todo lo referente a los tejidos: “anatomía microscópica”.  Histología Wolfgang Bargmann (1906-1976)  Tejido: “Asociación de células seme- jantes o con diferenciación similar, junto con sus derivados, las sustancias & intercelulares” ¿Qué es un Tejido? del => y tipo mismo o similares  Agrupación de células del mismo tipo o similares y su matriz extracelular coordinadas para realizar una función ¿Qué es un Órgano? = * tejidos para una función en común  Conjunto de tejidos diferentes con una función común  Histología: Objetivos Conocer la estructura (“anatomía microscópica”) de los tejidos humanos Reconocer los diferentes tejidos Comprender las relaciones entre estructura y función Conocer y aplicar métodos de estudio de los tejidos  Histología Células que trabajan conjuntamente  Por contacto físico  Mediante moléculas señal 250 tipos celulares que se agrupan en 4 tipos básicos de tejidos:  Epitelial  Conjuntivo = Conectivo  Muscular  Nervioso  Epitelios (temas 3 y 4) Epitelio (del gr. epi, sobre; theleo, papila) Es un tejido compuesto por células cohesionadas, sin apenas sustancias intercelulares que las separen. La matriz extracelular es sólo la lámina basal Función: 1.- Sobre la superficie externa (epidermis de la piel):  Protección mecánica y frente a microorganismos, L impermeabilizante. 2.- Sobre las superficies internas (tapizando cavidades, conductos y órganos huecos:  absorción =  secreción (epitelios glandulares) L  “barrera” protectora 2  Otras (tema 3) Uniones Intercelulares y Membrana Basal Recordad el tema 6 (uniones) de biología celular  Conjuntivo (temas 5, 6, 7 y 8) Tejido Conjuntivo: Múltiples tipos de tejidos conjuntivos Dos grandes grupos: - Propiamente dicho (Laxo, Denso, Reticular,…) - Especiales (Sangre, Óseo, Cartílago, Adiposo) Todos proceden del mesénquima: tejido conjuntivo embrionario que deriva del (mesodermo) Células separadas, rodeadas de A abundante matriz extracelular =  Secretada por las células del tejido  Polisacáridos, proteoglucanos y glucoproteínas  Responsable de las propiedades físicas del tejido Funciones de: conexión, soporte estructural, protección, comunicación, etc. LPB  Músculo (Tema 9) Tejido Muscular También deriva del mesénquima 3 tipos  Estriado esquelético  Estriado cardiaco  Liso Especializados en contrácción-relajación en respuesta estímulos D Células excitables Transforman Energía química (ATP) en Energía Mecánica (para movimientos, mantenimiento de posturas, etc.) LPB  Nervioso (Tema 10) Constituido por los cuerpos y prolongaciones de las neuronas (células excitables que reciben, transportan y transmiten información), sus prolongaciones, y por la neuroglía (células gliales) Distintos tipos de células gliales en el sistema D nervioso central que en el sistema nervioso periférico Origen ectodérmico (recordad formación del tubo neural) D + tejidoconjunta Detecta cambios externos o internos, integra la información y comunica respuestas a músculos y glándulas  Procesamiento de Muestras Preparación de los Tejidos 1. Fijación 2. Deshidratación 3. Inclusión 4. Corte Cuando aparezca este símbolo es que haciendo click sobre él 5. Tinción: contraste se habre un enlace a un vídeo sobre el tema en cuestión  Procesamiento de Muestras 1. Fijación: Se realiza con el objetivo de lograr la conservación de las características de los tejidos de la muestra) Los tejidos que sacamos del organismo y los tejidos de un organismo D muerto, si no se fijan, van a experimentar degradación por dos causas: L  Procesos celulares post-mortem de autolisis (por acción de enzimas intracelulares que provocan la autodigestión de la propia célula >  Putrefacción por la acción de gérmenes (sobre todo bacterias). Por ello, si queremos conservar el tejido se necesitan los métodos de fijación que impiden tanto la autolisis como la putrefacción Además, los métodos de fijación pueden contribuir a que la muestra de tejido adquiera mayor dureza facilitando obtener secciones más finas posteriormente cuando se corte la muestra y evitando adicionalmente que se altere la estructura de la muestra tras los siguientes pasos del procesamiento  1.1 Fijadores físicos  Desecación al aire: si eliminamos buena parte del agua no podrán suceder fácilmente procesos de autolisis, ni putrefacción)  Frotis sangre, semen (extender el líquido por portaobjetos y fijarlo por desecación al aire; generalmente se hará también una suave fijación química adicional)  Cultivo de bacterias (Se hace igual, pero, en este caso se puede acelerar con llama bajo el portaobjetos porque, aunque el calor de la llama destruya la membrana, no alterará la pared celular)  Calor: el calor fija porque desnaturaliza proteínas impidiendo la autolisis y - la putrefacción fijación por  Z Calor seco: En estufa además de fijar por calor, fija por desecación calar + desecación Problema: Destruye las membranas. Sin embargo, podemos usar este método para muestras de bacterias ya que se conserva pared celular para ver órganos  2 Calor húmedo: En agua hirviendo, altera mucho los tejidos, pero se ven bien los de invertebrados órganos, por eso se usa fundamentalmente para ver los órganos de pequeños & invertebrados a la lupa o el microscopio) más conservador  Frío: Congelación muy rápida con Nitrógeno líquido, u otro medio muy frio que fijador (necesidad de que sea muy rápida y de que se usen crioprotectores para evitar cristales de hielo que rompan las células). Es un método muy rápido y además endurece, pero no dura mucho (esBmás un conservador que un fijador) D caro +  7 Congelación y desecación: Elimina el agua al congelar la muestra y luego complejo sublimar el agua bajando la presión (caro y complejo, no endurece) D  1.2 Fijadores químicos:  Usamos soluciones que emplean sustancias químicas que provocan la fijación de la muestra (fijadores químicos)  Muchos de los diferentes tipos de fijadores químicos podemos meterlos dentro de uno de estos dos grupos:  Algunos fijan porque forman enlaces cruzados entre las moléculas del tejido (el fijador es una molécula que se une covalentemente a moléculas de la muestra formando enlaces indirectos entre ellas y evitando que puedan sufrir cambios morfológicos, reacciones, etc). Por ejemplo, el formaldehido (formol al 10%), glutaraldehído, paraformaldehido, etc.  Otros fijan porque deshidratan y precipitan macromoléculas de la muestra.Por ejemplo, el etanol (alcohol etílico), metanol, acetona, etc.  Las soluciones fijadoras pueden ser: I solo  SSimples: usamos un solo tipo de sustancia fijadora. mezcla y se  [ Compuestos: Mezcla que contiene varios tipos de fijador (se suman sus ventajas (unos fijadores fijan mejor unas estructuras y otros otras), suman ventajas pero también sus inconvenientes (uno puede ser tóxico, otro penetrar inconvenientes ! + lentamente en la muestra, etc.)  Deshidratación e inclusión Estos dos pasos van encaminados al endurecimiento de la muestra, como paso previo requerido para poder realizar su corte en secciones muy finas. Por ello estos dos pasos de deshidratación e inclusión no son necesarios cuando la fijación ha sido por un método que endurezca lo suficiente (por ejemplo, por congelación). Sin embargo, si la fijación no endurece lo suficiente, por ejemplo, en la fijación química no se endurece lo suficiente el tejido como para cortarlo en secciones muy finas (Nota, en este caso podría usarse un vibratomo para cortar el tejido, y no se necesitaría tampoco la deshidratación e inclusión para endurecerlo, pero este aparato consigue secciones menos finas que el microtomo. Por tanto, para obtener secciones más finas con el microtomo de tejidos fijados químicamente, habrá que endurecer previamente el tejido y para ello se debe hacer por orden deshidratación y luego inclusión (Las secciones para microscopía electrónica serán todavía más finas y se obtienen con el ultramicrotomo y también requerirán estos dos pasos de deshidratación e inclusión) = serie gradual de [2 mayores de acchol/actona 2. Deshidratación: Los medios de inclusión son hidrófobos, D por ello, para que penetren en la muestra, ésta antes tiene que ser - deshidratada. Para ello se introduce por orden la muestra en una Serie gradual de soluciones acuosas con concentraciones cada vez mayores de agente deshidratante. Alcohol etílico o acetona  50% → 60 % → 70% → → 100% 3. Inclusión La muestra de tejido, ya deshidratada, será endurecido gracias a que quedará incluida en una sustancia hidrófoba de consistencia firme (esa sustancia estará líquida en un principio y así puede penetrar y rodear los tejidos de la muestra y luego será endurecida, endureciendo con ello la muestra también) - El medio de inclusión puede ser una gelatina, o más comúnmente parafina (un tipo de cera): Se emplean para obtener una muestra suficientemente dura como para poder cortarla en secciones finas con el microtomo (luego podrán observarse con el microscopío óptica - El medio de inclusión elegido serán resinas. Si queremos obtener una muestra aún más dura que pueda ser cortada en secciones ultrafinas con el ultramicrotomo y así poder observarlas con el microscopio electrónico de transmisión (en este caso no vale la parafina hay que usar resinas) 1.- Infiltración del medio líquido de inclusión en la muestra de tejido 2.- Colocación en un molde 3.- Solidificación del medio de inclusión Nota: La luz puede atravesar las secciones finas que se obtienen con el microtomo (entre 5 y 10 micras de espesor), y estas secciones serán válidas para microscopía óptica, pero los electrones no pueden atravesarlas. Por ello, para el microscopio electrónico se necesitan secciones aún más finas (de unos 100 nm de espesor) las llamamos secciones ultrafinas y se necesita que la muestra esté aún más dura para poder cortarla con el ultramicrotomo (no vale la parafina y por ello se usan resinas que endurecen aún más)  4. Corte Para obtener secciones para microscopía óptica se usan los siguientes aparatos: - Micrótomo (obtenemos secciones de 5 -10 micras). Se usa para realizar secciones a partir de muestras incluidas en parafina - Criostato (obtenemos secciones de 5 – 10 micras). Para realizar secciones a partir de muestras fijadas por congelación (no será necesaria la inclusión y, por tanto, tampoco la deshidratación previas (esto acorta Microtomos los tiempos de procesamiento y también puede ser necesario porque la deshidratación e inclusión pueden afectar a ciertas características de la muestra. Es como un microtomo dentro de un congelador - Vibratomo (secciones de 40-50 micras). Tampoco requiere que antes de usarlo la muestra sea deshidratada e incluida aunque no haya sido congelada y la fijación química no la haya endurecido lo suficiente como para usar el microtomo. El vibratomo sí podrá cortarla, pero en secciones más gruesas (para ciertos estudios de ciertos tejidos o el empleo de ciertas técnicas de tinción no es necesario e incluso puede ser perjudicial que las secciones sean tan finas o que hayan sido deshidratadas e incluidas) Para obtener secciones para microscopía electrónica se usa: - Ultramicrotomo: Permite obtener secciones ultrafinas (unos 100 nm) a partir de muestras incluidas en resinas. Estas secciones serán suficientemente finas para el microscopio electrónico  Procesamiento de muestras 5. Tinción Colocación sobre un portaobjetos Eliminación de parafina D Rehidratación Colorantes:  Diferenciar componentes ácidos y básicos  Detectar componentes fibrosos de la matriz  Sales metálicas → formación de precipitados insolubles LPB  Videos sobre preparación de muestras Procesamiento normal Biopsia intraoperatoria LPB  Técnicas convencionales de tinción Hematoxilina-eosina Wright y Giemsa PAS Tricrómico de Masson Tinción argéntica Tinciones de lípidos (Sudán) LPB  Hematoxilina – Eosina (H-E) Hematoxilina: Colorante básico (se une electrostáticamente a lo ácido: Cromatina del núcleo, ribosomas (tienen ARN), proteoglucanos, etc.  Color azul-violeta Eosina: Colorante ácido (se une electrostáticamente a lo básico: mitocondrias, proteínas, colágeno y otras fibras de la matriz extracelular  Color rosa La H-E es la tinción más común, En la mayoría de los tejidos, tras esta tinción, veremos los núcleos de morado o azul oscuro y el citoplasma de color rosa. En la matriz extracelular hay dos tipos principales de componentes (las fibras y la sustancia fundamental), las fibras con esta tinción se verán rosas y la sustancia D Nota: Las estructuras del tejido que sean fundamental blanca (porque se suele perder en el ácidas, preferirán el colorante básico (serán procesamiento de la muestra) o morada (si no se ha basófilas); las estructuras del tejido que sean perdido, por ej. En el cartílago no se pierde) básicas, se uniran al colorante ácido (serán eosinófilas o acidófilas)  Tinción de Wright y Tinción de Giemsa Son dos métodos de tinción diferencial de células sanguíneas, son muy similares entre sí ambos usan los dos mismos colorantes (eosina y azul de metileno).  Rosa (eosina colorante ácido)  Eritrocitos  Gránulos de los eosinófilos Neutrófilo  Citoplasma  Azul (azul de metileno. Colorante básico)  Núcleo, gránulos de los basófilos, Nota. Al igual que la tinción H-E usan un ligeramente también el citoplasma colorante básico de color oscuro y otro ácido de monocitos y linfocitos de color rosa, pero en estas dos tinciones el colorante básico es azul de metileno en lugar de hematoxilina  Ácido Peryódico de Schiff (PAS) Tiñe Polisacáridos y oligosacáridos  Glucógeno  Mucus (rico en glucoproteínas muy glucosiladas)  Membrana basal  Fibras reticulares Color magenta o púrpura (rojo muy intenso) Se suele usar combinada con H-E LPB Tricrómico de Masson Emplea tres colorantes: Azul oscuro o morado (hematoxilina). Tiñe los núcleos Rojo (Fucsina: parecido a la eosina). Tiñe los citoplasmas Azul claro (verde luz, azul de anilina). Tiñe las fibras de la matriz extracelular: colágeno, fibras elásticas,… Nota: El principal interés de esta tinción es poder distinguir el citoplasma de las células de las fibras de la matriz extracelular, que con tinciones como la H-E se tiñen ambos del mismo color rosa, pero que con la tinción tricrómica se tiñen de color diferente. Es decir, con la tinción H-E, se diferencia bien el núcleo del citoplasma de las células, pero no tan bien el citoplasma de las fibras de la matriz extracelular. Es útil para detectar mejor donde hay tejido conjuntivo, y diferenciarlo mejor de tejidos como el músculo que con otras tinciones se distinguen peor entre sí  Tinciones Argénticas Emplean Sales de plata que, en contacto con la muestra, en ciertas condiciones químicas, precipitarán tiñendo ciertas estructuras de color muy oscuro. Distintos procedimientos de tinciones con sales de plata permiten teñir distintos tipos de estructuras con un color Negro o marrón oscuro. Por ejemplo, se pueden emplear para teñir: - Fibras reticulares en la matriz extracelular (colágeno III) - Ciertos orgánulos (Golgi) - Neuronas (por completo, tanto soma,como dendritas y axones) - Células gliales enteras con sus prolongaciones - Teñir el núcleo celular  Tinciones de Lípidos Tinciones liposolubles (usan pigmentos muy hidrofóbicos que no se disuelven en agua, pero tiñen muy eficazmente las estructuras ricas en lípidos como las gotitas de grasa, o la vaina de mielina. Un buen ejemplo son los colorantes Sudán, que podemos usar para teñir las gotas lipídicas (gotas de grasa). Otro ejemplo, es el azul luxol que se usa para teñir la vaina de mielina. El colorante va disuelto en alcohol (interesante para estudio y diagnóstico de enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple). El colorante en la solución de tinción va disuelto en alcohol, pero, al ponerlo en contacto con la muestra de tejido, como tiene aún más afinidad por los lípidos muy hidrofóbicos, que son todavía más lipófilos que el alcohol, estos lípidos de la muestra retendrán el colorante y, por tanto, se tiñen las zonas de la muestra que tengan abundantes lípidos. Por otro lado, este colorante no tiñe el resto de estructuras de la muestra porque el colorante no se disuelve en las zonas acuosas de la muestra, (por ello,Dsólo se tiñen estructuras formadas por abundantes lípidos hidrofóbicos) A Es importante que antes de la tinción durante el procesamiento no se hayan perdido lípidos (por ejemplo, por una fijación agresiva con una agente deshidratante, o por una deshidratación previa allá inclusión en parafina (lo ideal es usar muestras fijadas por congelación) Se suele usar combinada con Hematoxilina eosina (para poder destacar las células y la matriz del tejido y ubicar los lípidos teñidos en ese contexto) LPB  Histoquímica Empleo de métodos químicos (en ocasiones físicos) sobre muestras de tejido, para en ellas: identificar, localizar e incluso cuantificar:  Determinadas sustancias específicas: Determinados ácidos nucleicos que tengan una secuencia específica (hibridación in situ, determinados antígenos específicos proteícos, glucídicos o incluso lipídicos (inmunohistoquímica)  Diferentes sustancias que compartan determinados grupos funcionales: teñir ácidos nucleicos en general (Técnica de Feulgen), o lípidos hidrofóbicos (Sudan), o glúcidos en general (PAS),…  Reacciones catalizadas por enzimas (histoquímica enzimática) LPB  Histoquímica Enzimática Detectar enzimas activas en su lugar natural Ciertas enzimas pueden ser detectadas en los tejidos empleando este tipo de método  Fosfatasas en lisosomas  Peroxidasa en células sanguíneas D Succinato-deshidrogenasa en las mitocondrias celulares Es importante que la enzima a detectar en la muestra no se haya desnaturalizado y por ello el procesamiento previo a la muestra excluirá la deshidratación e inclusión y será necesario emplear un procesamiento menos agresivo como la fijación por congelación y corte en criostato antes de la tinción La solución de tinción lleva un sustrato que en contacto con la enzima de la muestra se transformará en un producto que precipita y tiene color o es electrodenso. Muchas veces la solución de tinción debe llevar un marcador que reaccione con el producto de la reacción para que éste precipite o adquiera el color Precipitado coloreado (para microscopía óptica) o electrodenso (sirve para L T microscopía electrónica)  Fosfatasa ácida Fosfatasa alcalina NADH. Músculo LPB  Inmunohistoquímica Reacciones Antígeno (Ag) – Anticuerpo (Ac)  Componente a detectar → Ag en la muestra Utiliza anticuerpos y anti-anticuerpos marcados con:  colorante fluorescente → Inmunofluorescencia  fluoresceína  rodamina  enzima detectable (peroxidasa)→ técnicas Inmunoenzimáticas BTécnica extremadamente específica. El anticuerpo de la solución de tinción reconoce una molécula concreta. Localización muy precisa LPB  Inmunohistoquímica neosita un secundanz Ac marcaje Ejemplos de inmunofluorescencias: Directa e indirecta ~ con M Ac primarz lleva marraje Ejemplo de inmunohistoquímica enzimática: En este caso indirecta N necentra Ac secundario que love enzima LPB  Inmunohistoquímica Directo  Anticuerpo diseñado para que reconozca como antígeno a la molécula de la muestra que queremos localizar  Marcar el anticuerpo  Reacción Ag – Ac  Observación: m.o. o al m.e.t.  Menos sensible (mayor posibilidad de falsos negativos) Indirecto  Anticuerpo 1rio contra la molécula  Anti-anticuerpo (anticuerpo secundario) marcado L  Incubación con AC 1rio  lavado  Incubación con anti-Ac marcado  Observación: m.o. o al m.e.t  Más reacciones cruzadas (mayor posibilidad de falsos positivos) LPB Detección de proteína priónica PrP en citoplasma de neuronas. Avidina-Biotina-Peroxidasa Tinción para citoqueratina LPB LPB  Autorradiografía Incorporación de isótopos radiactivos a macromoléculas  tritio (H3) Fisiología Celular  Localización e investigación de secuencias temporales de fenómenos celulares  Inyección de sustancia radiactiva  Obtener muestra de tejido a intervalos de tiempo  procesamiento de la muestra (fijación, deshidratación, inclusión, corte, tinción convencional)  Oscuridad y poner sobre las secciones emulsión fotográfica  Revelado  Cuando observemos la muestra donde se haya incorporado la radiactividad veremos que se ha formado un precipitado muy oscuro o electrodenso 7 Gránulos de plata ennegrecidos en las zonas donde se incorporó el isótopo radiactivo Gránulos de secreción Células en división LPB Hibridación in situ D Directamente en células o tejidos  Detección de secuencias específicas de ADN o ARN. Por ejemplo:  1 gen en un cromosoma  Si hay transcripción (debería aparecer el ARNm correspondiente) Presencia de ADN oARN de un patógeno (por ejemplo, un virus)  La solución de tinción usa Sondas de ADN o ARN marcadas (con fluorescencia, un enzima detectable, etc.) que sean complementarias de ADN o ARN que queremos detectar en la muestra LPB  Interpretación de la muestra cuando la observamos al microscopio Debemos tener en cuenta: Fijamos algo vivo y cambiante (por ejemplo, no se verá igual una célula si la fijamos cuando estaba en interfase, que si la fijamos cuando estaba en metafase) ≠ tinciones para ≠ componentes (el aspecto del tejido y lo que podamos detectar en él no es igual si empleamos tinciones diferentes) Parte mínima de un todo: Muchas veces no vemos estructuras en toda su extensión y además, dependiendo del corte el aspecto de una sección 2D de una misma estructura 3D puede ser muy diferente (ver dibujo acompañante) Posibles artefactos (ver diapositivas siguientes) LPB  Artefactos Alteraciones indeseadas producidas a causa del L procesamiento de la muestra. Ejemplos:  Retracción por fijación (por ejemplo, si el procesamiento incluyó agentes deshidratantes como el alcohol). Esto genera espacios artificiales  Pérdida de moléculas que no se conservan. Puede inducir a error, llevando a la conclusión errónea de que lo que se busca no está presente en el tejido, o si se sabe que está presente que no se pueda localizar.  Colorante viejo precipitado: genera manchas que no indican la presencia de ninguna estructura original de la muestra y dificultan su correcta interpretación  Pliegues: Si la sección se pliega sobre si misma, las zonas replegadas no se pueden interpretar bien  Rasgaduras producidas por mellas en la cuchilla  Otros: presencia de objetos que “contaminan” la muestra como: pelos, fibras de ropa, restos de invertebrados microscópicos, etc; roturas en el cristal del cubre o del portaobjetos: burbujas del medio de montaje, etc. LPB