Sekundarna Fermentacijska Aroma - Hlapljivi Esteri - Viši Alkoholi - Masne Kiseline (PDF)

STRUČNI DIPLOMSKI STUDIJ VINARSTVO AROME MOŠTA I VINA dr. sc.biotech. Sanja Radeka, profesor stručnog studija u trajnom zvanju SEKUNDARNA (FERMENTACIJSKA) AROMA Sekundarnu (fermentacijsku) aromu vina čine spojevi koji se oslobađaju tijekom prerade grožđa te spojevi koji nastaj...

STRUČNI DIPLOMSKI STUDIJ VINARSTVO AROME MOŠTA I VINA dr. sc.biotech. Sanja Radeka, profesor stručnog studija u trajnom zvanju SEKUNDARNA (FERMENTACIJSKA) AROMA Sekundarnu (fermentacijsku) aromu vina čine spojevi koji se oslobađaju tijekom prerade grožđa te spojevi koji nastaju tijekom alkoholne i malolaktične fermentacije. Alkoholna fermentacija dovodi do povećanja aromatske kompleksnosti vina na način da potpomaže ekstrakciji spojeva iz čvrstih dijelova grožđa u mošt (Lambrechts i Pretorius, 2000). Kao glavni nositelji alkoholne fermentacije, kvasci modificiraju spojeve grožđa te proizvode znatne količine metabolita. Stoga većina hlapljivih aromatskih spojeva detektiranih u vinu uglavnom nastaje tijekom alkoholne fermentacije budući da se ti spojevi u vinu nalaze u najvećim koncentracijama (Belda i sur., 2017; Lambrechts i Pretorius, 2000). Sekundarne (fermentacijske) arome rezultat su mikrobioloških transformacija mošta (alkoholne i malolaktične fermentacije), a predstavljene su: - hlapivim esterima (acetatnim i etilnim esterima) - višim alkoholima - masnim kiselinama HLAPIVI ESTERI Esteri su spojevi koji nastaju kondenzacijom hidroksilne skupine alkohola i karboksilne skupine organske kiseline. Ukupna koncentracija estera u vinu prilično je značajna i obično je viša od praga percepcije, što značajno utječe na konačnu aromu vina. Detektirano je više od 150 različitih estera u vinu. Ipak, većina ovih estera prisutna je u tragovima i ne utječe značajno na cjelokupnu aromu vina (Ruiz i sur. 2019.). Većina etil estera i acetata prisutna je u sličnim ili višim koncentracijama u bijelim vinima u usporedbi s crnim vinima (Robinson i sur., 2014.a). Esteri u vinu nastaju metabolizmom kvasaca putem metabolizma lipida i acetil-CoA, iz preteča grožđa koje sintetiziraju kvasci (Swiegers i sur.2005.), te kemijskim modifikacijama tijekom starenja vina (Robinson i sur. 2014.a) Etilni esteri masnih kiselina nastaju tijekom fermentacije, točnije putem etanolize acil-CoA koji nastaje tijekom sinteze ili degradacije masnih kiselina (Cai i sur., 2014), a budući da se u vinima pojavljuju u visokim koncentracijama te imaju nizak prag osjetljivosti, njihova uloga u voćnim aromama vina vrlo je značajna (Ayestarán i sur., 2019). Reakcijom etanola i masnih kiselina nastaju etil esteri, a njihovo nastajanje djelovanjem S.cerevisiae kataliziraju najmanje dvije acil-CoA, etanol O-aciltransferaze (AEATaze), EEB1 i EHT1. Najznačajniji etil esteri su etil butirat, etil oktanoat, etil dekanoat i etil heksanoat (Robinson i sur. 2014.a). Acetatni esteri nastaju reakcijom alkoholne skupine etanola ili višeg alkohola i kiselinske skupine (acetata) (Ruiz i sur. 2019.). Nastanak acetatnog estera aktivnošću kvasca Saccharomy cescerevisiae kataliziraju alkohol acetiltransferaze I i II (AATaza I i II) iz dva supstrata, alkohola i acetil-CoA (Robinson i sur. 2014.a). Acetatni esteri, mnogo važniji Slika 1. Predstavnici hlapivih estera u vinu  Sinteza estera tijekom alkoholne fermentacije ovisna je o sastavu mošta, soju kvasca, uvjetima koji vladaju tijekom fermentacije (naročito temperaturi). Visoke temperature alkoholnog vrenja negativno se odražavaju na količinu hlapivih estera u vinu, budući da dolazi do njihove pojačane hidrolize i gubitka tijekom fermentacije. Prema Versini et al., 1991, stvaranje estera je povećano kod mošteva sa većim sadržajem aminokiselina, što je i razumljivo budući da aminokiselinski ugljikovi kosturi služe kao prekursori u njihovom formiranju. C6-spojevi također mogu djelovati kao supstrati za proizvodnju estera pomoću kvasca tijekom fermentacije (Robinson i sur., 2014). Esteri su značajni za aromu vina budući da doprinose cvjetnim i voćnim mirisima u vinu te utječu na konačni senzorni doživljaj. Njihov sadržaj u vinu i način formiranja ovisi o brojnosti alkohola i kiselina u vinu, a budući da vino sadrži visoku količinu alkohola i kiselina koje sudjeluju u reakcijama esterifikacije, očekivano je i kako će koncentracija nastalih estera biti visoka (Ivanova-Petropulos i sur., 2014). Prema Wang i sur. (2016), maceracija tijekom fermentacije dovela je značajnog povećanja koncentracije estera dok suprotno navode Lukić i sur. (2015), koji u svom istraživanju bilježe smanjenje koncentracije estera, osobito etilnih estera. Količine hlapivih estera u vinu su relativno niske i prema Peynaud, 1996. kreću se od nekoliko mg/L, pa sve do manje od 0.1mg/L. Prema Postel et al., 1972. jedini esteri prisutni u većim koncentracijama u vinu su etil acetat (60-240 mg/L), te etil laktat (24-226 mg/L).  Tablica 1. Koncentracije i olfaktivni pragovi hlapivih estera u vinima, (mg/L) Koncentracije u vinu - Koncentracija Olfaktivni prag – prag Sastojak literaturni podaci u vinu Malvazije osjetljivosti Miris Etil acetat 50 - 240 54.0 12 - 160 voćni, ljepilo, mg/L odstranjivač laka za nokte Izobutil acetat n. d. - 0.12 0.04 - banana mg/L Izoamil acetat 2-6 2.01 1.60 banana, kruška mg/L Heksil acetat n. d. – 0.63 0.32 3.50 cvjetni mg/L 2 – Fenil etil acetat 0.1 – 1.2 0.10 0.25 ruža, sušeno voće mg/L Etil butirat 0.01 – 1.3 0.14 0.40 cvjetni mg/L Etil kaproat 0.2 – 3.4 1.17 0.005 - 0.80 zelena jabuka, tropsko mg/L voće, ljubica Etil kaprilat 0.5 - 2 1.41 0.002 - 0.50 zelena jabuka, sapun, mg/L ananas, kruška Etil kaprat 0.5 - 2 0.32 0.2 - 0.50 zelena jabuka, sapun, mg/L cvjetni Etil laktat 3.8 – 17, pa do 226 8.97 - maslac, mlijeko mg/L Izvor: Radeka S. (2001): Kakvoća vina Malvazije od kasno branog i od prosušenog grožđa HRZZ projekt: „Utjecaj različitih vinifikacijskih tehnologija na kvalitativna svojstva vina od autohtonih hrvatskih sorti: uloga vina u ljudskoj prehrani - VINUM SANUM” (IP-2018-01-5049), 2018.-2022. Tablica 2. Koncentracija hlapivih estera (mg/L) u vinima Malvazije istarske berbe 2019. proizvedenih različitim tretmanima maceracije masulja (CRIO, M7, M14, M21, M42); kontrolni tretman „brza prerada” (K). Bestulić, 2024. HRZZ projekt: „Utjecaj različitih vinifikacijskih tehnologija na kvalitativna svojstva vina od autohtonih hrvatskih sorti: uloga vina u ljudskoj prehrani - VINUM SANUM” (IP-2018-01-5049), 2018.-2022. Tablica 2. Koncentracija hlapivih estera (mg/L) u vinima Malvazije istarske berbe 2019. proizvedenih različitim tretmanima maceracije masulja (CRIO, M7, M14, M21, M42); kontrolni tretman „brza prerada” (K). Bestulić, 2024. Suma etilnih estera izračunata je kao zbroj koncentracija etil-butirata, etil-2-metilbutirata, etil-3-metilbutirata, etil-pentanoata, etil-heksanoata, etil-oktanoata, etil-3-furoata, etil-heks-4-enoata, etil-2-heksenoata i etil- cinamata. U 2019. godini, najviše koncentracije etilnih estera zabilježene su u tretmanima K te tretmanu K i CRIO u 2020. godini. Od svih detektiranih etilnih estera, najzastupljeniji je etil oktanoat sa najvišim koncentracijama zabilježenim u tretmanima K i CRIO, u obje godine istraživanja. U vinima su detektirani sljedeći acetatni esteri: butil-acetat, izoamil- acetat, heksil-acetat, 2- feniletil-acetat i izobornil-acetat. Promatrajući sumu acetatnih estera, zabilježen je isti trend u obje godine istraživanja te su najviše koncentracije zabilježene u tretmanu K, nakon čega slijedi tretman CRIO, a koncentracije ostalih tretmana maceracije se međusobno nisu značajno razlikovale. Izoamil-acetat je bio kvantitativno najzastupljeniji acetatni ester, s najvišim koncentracijama zabilježenim u kontrolnom tretmanu (K). Suma ostalih estera obuhvaća zbroj izoamil-propanoata, etil-laktata, izoamil-laktata, dietil - sukcinata i n-heksil-salicilata. Najviše koncentracije ukupnih ostalih estera zabilježene su u tretmanima M21 i M42 dok su najniže zabilježene u tretmanima K, CRIO i M7. Najzastupljeniji ester u ovoj skupini je etil-laktat. VIŠI ALKOHOLI Višim alkoholima se nazivaju alkoholi koji imaju više od dva ugljikova atoma, veću molekulsku masu i vrelište od etanola. Pripadaju skupini spojeva koji značajno pridonose aromi vina, a imaju karakterističan snažan i oštar miris (Nykänen, 1986). Sinteza viših alkohola odvija se istodobno sa stvaranjem etanola (Rapp i Versini, 1991). To su sekundarni metaboliti kvasca, a na njihovo nastajanje utječe koncentracija aminokiselina koje su prekursori za sintezu viših alkohola (Swiegers i Pretorius, 2005). Nastaju deaminacijom i dekarboksilacijom odgovarajućih aminokiselina (treonin, valin, leucin, izoleucin) ili sintezom iz šećera (Mauricio i sur., 1997). Ukupni udio viših alkohola u vinu u rasponu je od 100-500 mg/L (Dubourdieu i sur., 2006). Njihova koncentracija ovisi o sorti, uvjetima fermentacije (koncentracija šećera, pH, temperatura fermentacije i aeracija), mutnoći mošta i soju kvasca koji provodi fermentaciju (Sweigers i sur., 2005). Koncentracije viših alkohola iznad 400 mg/L, koje uglavnom nastaju uslijed mikrobiološkog kvarenja rezultiraju jakim i oštrim mirisima, dok u optimalnim koncentracijama, ispod 300 mg/L imaju voćne karakteristike i pozitivno doprinose aromi vina (Swiegers i Pretorius. 2005). Najznačajniji predstavnici ove skupine spojeva su 1-propanol, 1-butanol, i-amil alkohol i 2-fenil etanol (Sweigers i sur., 2005). Također, viši alkoholi su važni prekursori nastajanja estera koji su povezani sa ugodnim i poželjnim aromama vina (Dubourdieu i sur., 2006.) VIŠI ALKOHOLI Viši alkoholi nastaju radom kvasaca S. cerevisiae za vrijeme alkoholne fermentacije, i uz hlapive estere bitan su čimbenik fermentacijske arome vina. Dvojak je način njihovog nastanka tijekom alkoholnog vrenja i to: - metabolizmom ugljikohidrata (anabolički), na koji način nastaje oko 35% viših alkohola - transformacijom odgovarajućih aminokiselina (katabolički) – Ehrlichova reakcija Slika 7. Nastajanje viših alkohola iz šećera i aminokiselina (Moreno-Arribas i Polo, 2009.) Glavni predstavnici viših alkohola su : 1-propanol ( n – propanol) izobutanol (2 – metil – 1 – propanol) amilni alkohol (2 – metil – 1 – butanol) izoamilni alkohol (3 – metil – 1 – butanol) 2 – feniletanol Smatra se kako od svih aromatskih spojeva, viši alkoholi imaju najveći utjecaj na aromu vina (Waterhouse i sur., 2016). Neke više alkohole karakteriziraju ugodne arome, kao što je slučaj s amilnim ili izoamilnim alkoholom koji doprinose aromi marcipana te tirosolom i feniletanolom koji daju arome meda i ruže, dok drugi viši alkoholi mogu maskirati voćnu aromu vina (Ruiz i sur., 2019). Tablica 10. Koncentracije i olfaktivni pragovi viših alkohola u vinima (mg/L) Sastojak Koncentracija u vinu – Koncentracija u vinu Olfaktivni prag – prag Miris lit. podaci Malvazije osjetljivosti razređivač, lak za nokte 1 - Propanol 11 - 68 23.7 – 35.3 500 mg/L Heksanol 0.5 - 12 0.4 – 1.7 5.2 travni mg/L razređivač, lak za nokte Izobutanol 6 - 174 14.5 – 23.8 500 mg/L Amilni alkohol 19 - 96 20.7 – 21.6 65 razređivač, lak za nokte, marcipan mg/L Izoamilni alkohol 83 - 400 103.7 – 132.2 300 razređivač, lak za nokte, marcipan mg/L 2 – Fenil etanol 25 - 105 9.5 – 26.0 7.5 ruža mg/L Izvor: Radeka S. (2001): Kakvoća vina Malvazije od kasno branog i od prosušenog grožđa Koncentracije v. alkohola u vinu ovisne su o sastavu mošta, temperaturi fermentacije, te tehnologiji proizvodnje (bijela i crna vina). Kompozicija aminokiselina u moštu od velikog je značaja jer te tvari predstavljaju važan izvor slobodnog dušika, te sudjeluju kao prekursori tijekom sinteze v. alkohola. Aminokiseline iz kojih nastaju viši alkoholi su valin, leucin, izoleucin, fenilalanin, tirozin, triptofan i metionin iz kojega nastaje tioalkohol metionol. Kvasac Saccharomyces cerevisiae daje manje količine viših alkohola za razliku od kriotolerantnih sojeva Saccharomyces bayanus/uvarum. Prema podacima koje navode Guerzoni et al., 1987, vina kasnijih berbi imala su manje koncentracije viših alkohola u odnosu na vina ranijih rokova berbe. Jednako tako i Versini et al. 1989 ističu tendenciju smanjenja količine viših alkohola, naročito 3 metilbutanola i heksanola, tijekom daljnje zriobe grožđa. 3 metil-1-butanol kao najzastupljeniji viši alkohol čini više od 50% njihove ukupne koncentracije, a karakterizira ga miris na razrjeđivač. Prema istim autorima viši alkoholi u koncentraciji do 300 mg/L doprinose razvoju željene arome vina, dok koncentracije veće od 400 mg/L negativno utječu na aromatske karakteristike vina. Što se tiče temperature fermentacije opći je stav da ako se tijekom fermentacije uspije održati relativno niska temp. i ukupan sadržaj viših alkohola će biti niži. Razlike u količinama v. alkohola između bijelih i crnih vina postoje zahvaljujući različitim tehnologijama proizvodnje, gdje bijela vina uvijek imaju niži sadržaj (162 – 266 mg/L) nego crna (140 – 417 mg/L) (Moreno-Arribas i Polo, 2009.). MASNE KISELINE Lipidi (zasićene i nezasićene slobodne masne kiseline, triacilgliceroli, fosfolipidi, steroli) imaju fundamentalnu ulogu u metabolizmu kvaščeve stanice, budući su stanične membrane većinom građene od lipida (Di Stefano 1996). Sinteza masnih kiselina (katalizirana multienzimatskim kompleksom sačinjenim od 6 različitih enzima) ide dodatkom fragmenata od dva ugljikova atoma na molekulu acil-CoA.Ovi ugljikovi atomi potječu od malonil-CoA nastalog karboksilacijom acetil- CoA. Ta ireverzibilna reakcija predstavlja odlučujući korak u sintezi masnih kiselina. O O II II H3C – C – S- CoA + ATP + HCO3- ==> C – CH2 – C – S – CoA +ADP + - acetil - CoA O m Pi + H+ Finalni produkt sinteze su masne kiseline sa 16-18 ugljikovih atoma, koje moraju biti u nezasićenom (tekućem) stanju da bi osigurale semifluidno stanje bioloških membrana (Di Stefano, 1996). Masne kiseline srednjeg lanca (C6 – C10) koje čine bitnu komponentu arome vina sintetiziraju kvasci kao međuprodukt pri biosintezi masnih kiselina dugog lanca. Vino sadrži masne kiseline kratkog lanca (C2 - C4), srednjeg lanca (C 6 - C10), dugačkog lanca (C12 - C18) i skupinu masnih kiselina razgranatog lanca ( 2-metil propanonska, 2-metil butanonska i 3-metil butanonska kiselina). Masne kiseline srednjeg lanca (C6 - C10) važne su za ukupnu aromu vina, a sintetiziraju ih kvasci kao međuprodukt pri biosintezi masnih kiselina dugog lanca (Jackson, 2014.). Među njima najznačajnije su kapronska, kaprilna i kaprinska kiselina. Slika 8. Masne kiseline srednjeg lanca bitne za aromu vina: a) kapronska kiselina, b) kaprilna kiselina i c) kaprinska kiselina Biosinteza hlapljivih masnih kiselina odvija se tijekom fermentacije od strane kvasaca i bakterija, a njihovo podrijetlo može biti različito. Stoga heksanska, oktanska i dekanska kiselina nastaju katabolizmom masnih kiselina dugog lanca (Pérez Olivero i Pérez Trujillo, 2011), dok su nezasićene masne kiseline dugog lanca C18 i C20, povezane sa metabolizmom lipida (Ribéreau-Gayon, 2006). Smatra se da su masne kiseline srednjeg lanca toksične za stanice kvasca i usporavaju fermentaciju (Styger i sur., 2011). Uvjeti pri kojima se odvija fermentacija ključni su čimbenici u stvaranju hlapljivih masnih kiselina (Pérez Olivero i Pérez Trujillo, 2011). Masne kiseline zajedno sa značajnom količina etanola prekursori su za stvaranje estera. Masne kiseline mogu doprinijeti kompleksnosti vina, dok u visokim koncentracijama negativno utječu na aromatska svojstva (Swiegers i sur., 2005). Iako većina masnih kiselina negativno utječe na arome, doprinoseći aromama kao što su sir, maslac i kiselo, služe kao preteče poželjnijih spojeva, estera i laktona (IlcWerck-Reichhart i Navrot, 2016). Sadržaj hlapivih kiselina vina kreće se uglavnom između 500 i 1000 mg/L (10 – 15 % ukupne kiselosti), a u normalnim uvjetima više od 90% hlapive kiselosti čini octena kiselina (Hensche, Jiranek, 1993.) Koncentracije C6 – C10 masnih kiselina usko su vezane uz soj kvasca, sastav mošta i uvjete fermentacije: temperaturu, pH, aeraciju (Edwards et al., 1990), a na sastav utječu male promjene uvjeta rasta (ph, temperatura, otopljeni kisik, prisutnost ili odsutnost hranjivih tvari) i brzina rasta samog organizma (Lambrechts i Pretorius, 2000). Sa smanjenjem temp. fermentacije povećava se sadržaj kapronske kiseline, dok signifikantno ne varira sadržaj kaprilne i kaprinske kiseline (Usseglio – Tomasset, 1995.). Povećani sadržaj netopivih čestica porijeklom iz grožđa (mutniji mošt) tijekom fermentacije rezultira smanjenjem koncentracije masnih kiselina u vinu (Edwards et al., 1990.). Osim toga koncentracija m. kiselina je ovisna i o ravnoteži između njihove proizvodnje i upotrebe za sintezu lipida i masnih kiselina dugog lanca, njihovog izlučivanja u okolni medij i kemijskih modifikacija. Osim enzimatske esterifikacije, kemijske esterifikacije s etanolom razlog su dvostrukog smanjenja koncentracija m. kiselina tijekom zadnjih sati fermentacione aktivnosti. Utjecaj soja kvasca na proizvodnju hlapljivih masnih kiselina Utvrđeno je da Saccharomyces uvarum proizvodi vrlo male koncentracije octene kiseline te da je također proizveo najniže koncentracije hlapljivih kiselina (oko 0,1 g L-1). Saccharomyces cerevisiae proizvodi 0,3-1,2 g L-1 octene kiseline, Kloeckera apiculata 1-2,5 g L-1, Candida stelata 1-1,3 g L-1, Metschnikowia pulcherrima 0,1-0,15 g L-1, Candida krusei 1g L-1, Hansenula anomala 1-2 g L-1 (Fleet i Heard, 1993; Lambrechts i Pretorius, 2000). Herraiz i suradnici (1990) objavili su da kvasac Saccharomyces cerevisiae proizvodi velike količine kapronske, kaprilne i kaprinske kiseline, a kvasci Torulaspora delbrueckii i Kloeckera apiculata ih proizvode u manjim koncentracijama. Ipak, kvasac Kloeckera apiculata proizvodi značajne količine laurinske, miristinske, palmitinske i palmitoleinske kiseline. Tablica 11. Koncentracije i olfaktivni pragovi masnih kiselina u vinima, (mg/L) Sastojak Prosječna konc. u Koncentracija u Olfaktivni prag - Miris vinu - literaturni vinu Malvazije prag osjetljivosti podaci Kapronska 6.0 6.2 – 7.1 0.42 - 8.0 cvjetni, kiselina duhan, mg/L lješnjak Kaprilna 9.1 9.5 – 10.3 0.5 - 13.0 cvjetni kiselina mg/L Kaprinska 4.5 3.0 – 3.4 1.0 - 10.0 užeglost kiselina mg/L Izvor: Radeka S. (2001): Kakvoća vina Malvazije od kasno branog i od prosušenog grožđa Koncentracije pojedinačnih masnih kiselina u vinu uglavnom ne prelaze olfaktivne pragove, ali u interakciji s drugim hlapivim komponentama vina pozitivno utječu na njegove aromatske karakteristike (Tamborra et al. 1990). HRZZ projekt: „Utjecaj različitih vinifikacijskih tehnologija na kvalitativna svojstva vina od autohtonih hrvatskih sorti: uloga vina u ljudskoj prehrani - VINUM SANUM” (IP-2018-01-5049), 2018.-2022. Tablica 2. Koncentracija hlapivih estera (mg/L) u vinima Malvazije istarske berbe 2019. proizvedenih različitim tretmanima maceracije masulja (CRIO, M7, M14, M21, M42); kontrolni tretman „brza prerada” (K). Bestulić, 2024.