Genética Molecular - Sebenta Simão Amaral (2019-2020) PDF

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS ABEL SALAZAR GENÉTICA MOLECULAR Ano Letivo 2019/2020 Baseado nas desgravadas de 2017 Simão Amaral Genética Molecular 2 ICBAS 2019/2020 Genética Molecular 3 ICBAS 2019/2020 O material genético contempla a informação genética do organismo. Qu...

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS ABEL SALAZAR GENÉTICA MOLECULAR Ano Letivo 2019/2020 Baseado nas desgravadas de 2017 Simão Amaral Genética Molecular 2 ICBAS 2019/2020 Genética Molecular 3 ICBAS 2019/2020 O material genético contempla a informação genética do organismo. Quase todos os organismos utilizam o DNA, com algumas exceções (os vírus, que também têm RNA de cadeia dupla ou simples)  Relacionado com a sua estrutura  Através da Replicação  Transcrição e Tradução  Mutação e Recombinação que possibilitam evolução  Princípio da Transformação!  Purificaram o “transforming principle” Utilizaram uma estirpe de bactérias Pneumococcus e dois subtipos:  Bactérias do tipo S (smooth, lisas) com cápsula – PATOGÉNICAS!  Bactérias do tipo R (rough, rugosas) sem cápsula (devido a mutação) – NÃO SÃO PATOGÉNICAS! Havia qualquer coisa nas bactérias que, quando transferido, tornava as bactérias R em bactérias patogénicas – Transforming Principle. Seria então o DNA, mas não se sabia! Purificaram/isolaram o “transforming principle” e demonstraram que era o DNA e não o RNA que provocava a transformação das bactérias R em bactérias S. Os críticos, que achavam que o material genético, contra-argumentavam dizendo que no material extraído ainda havia restos de proteínas. Genética Molecular 4 ICBAS 2019/2020 Descreveram o ciclo de vida de um fago lítico – fago T2 (vírus que infeta bactérias e provoca lise celular), determinando que o material genético do fago T2 é DNA!!! Bacteriofago ou Fago = Vírus que afeta bactérias. Marcaram radioactivamente P32 e S35, isto porque o fósforo só existe no DNA e o enxofre só em proteínas. Como é que este fago sobrevive? Os vírus NÃO SÃO autónomos!  O vírus encosta-se à cápsula da bactéria, injetando o DNA lá para dentro (radioisótopos de P32).  O DNA usa todo o mecanismo da célula (destrói os genes e inativa a formação de proteínas bacterianas) e duplica o DNA, formando muitos DNAs víricos, expressando as proteínas víricas.  Há a formação de NOVOS vírus que, quando o processo está completo, produzem enzimas que matam a bactéria e libertam os vírus que podem infetar novas células. Pondo bactérias numa placa de Petri com um meio de cultura e a uma certa temperatura, as bactérias dividem-se e formam colónias. Normalmente, o meio é claro e as colunas mais escuras. Com este tipo de vírus, funciona um pouco ao contrário. Ao colocar o vírus, este infeta uma célula, destrói-a e depois infeta outra célula, aparecendo locais clarinhos – placas víricas. As células eucarióticas em cultura (ou organismos) podem também ser transfectadas com DNA (“transfecção”). Colocando DNA com genes de timidina cinase, as células conseguem crescer. É um processo que se chama Princípio de Transformação. No caso das células humanas, chama-se transfecção. (?) Vírus do Mosaico do Tabaco. Afeta as folhas do tabaco. O material genético do TMV é o RNA. O que determina o fenótipo do vírus é o RNA e não as proteínas na cápsula. Genética Molecular 5 ICBAS 2019/2020  Determinaram a estrutura do DNA e como este poderia funcionar.  Nucleótidos ligados por ligações fosfodiéster: Núcleo de fosfato + Açúcar (Ribose ou Desoxirribose) + Bases azotadas;  As duas cadeias de DNA formam cadeias antiparalelas (5’ fosfato » 3’ açúcar);  Dupla hélice enrolada à direita (sentido dos ponteiros do relógio), com 10 pares por volta da hélice;  O número de bases adenina/timina eram sempre iguais e citosina/guanina eram diferentes;  A relação entre adenina/timina e citosina/guanina define as espécies;  As bases estão viradas para dentro e emparelham por pontes de hidrogénio (A=T e G≡C);  As bases têm capacidade de flip-out;  Distâncias de bases 0,34 nm e diâmetro de 2 nm;  Contém cavidades maiores e menores, que se formam devido ao tipo de emparelhamento das cadeias que não é exatamente perpendicular ao eixo. Estas cavidades são locais onde as proteínas se podem ligar. a) Mais compactado, devido ao MAIOR emparelhamento de bases. MENOS hidratado; b) Modelo mais visto; c) Em zig-zag, enrolado à esquerda. (As letras correspondem à figura abaixo) Nos livros, vê-se as moléculas de RNA desenhadas lineares, mas, na prática, o RNA tem sempre tendência a emparelhar e fazer “laços”. Genética Molecular 6 ICBAS 2019/2020 Interações intra e intermoleculares entre cadeias simples (RNA e DNA); Desnaturação reversível de ácidos nucleicos (separação das cadeias) e renaturação (emparelhamento), por aumento e diminuição da temperatura ou diminuição do sal; Emparelhamento de DNA desnaturado ligado a um filtro/suporte sólido, que se mistura com outro DNA complementar em solução. É possível marcá-los. Quanto mais complementares forem, mais próximas as espécies são na escala filogenética. O DNA das células está organizado em cromossomas (Humano = 23 pares de cromossomas = 3x109 pares de nucleótidos). Cada cromossoma corresponde a uma molécula de DNA. Uma célula de 15 µm possui 2 metros de DNA compactados. Vírus bacteriano muito conhecido com 1 cromossoma linear. Tem cerca de 50 mil pares de bases. Nas extremidades têm sequências em cadeia simples. O processo de replicação do DNA é complicado, mas gera uma molécula enorme com vários genomas do vírus (molécula em cadeia dupla), que quando infeta uma bactéria enrola-se – circularização do cromossoma – por emparelhamento das extremidades complementares em cadeia simples. Uma das possibilidades de compactar o DNA. Se for no mesmo sentido, é um super- enrolamento positivo e se for no sentido oposto é negativo. As topoisomerases controlam o super-enrolamento, abrindo o meio e criando tensão, o que provoca um novo emparelhamento. Genética Molecular 7 ICBAS 2019/2020 O genoma bacteriano (nucleoide) tem estruturas centrais onde o DNA liga (proteínas básicas, não histonas) e forma grandes numerosos laços (DNA duplex), que permite compactar o DNA. O nosso DNA está empacotado em cromossomas e compactado em fibras de cromatina de 30 nm. A estrutura base é o nucleossoma (núcleo principal) que consiste em DNA enrolado em proteínas com carga negativa – histonas (150 pares à volta de cada histona). Existem 5 tipos de histonas: H1 (promove uma compactação ainda maior em fibras de cromatina), H2A, H2B, H3, H4. O DNA está mais compactado na metáfase. Genética Molecular 8 ICBAS 2019/2020    O DNA está mais protegido das nucleases quando está ligado a proteínas;  (centrómeros);   Regiões MAIS DENSAS de DNA;  DNA MAIS DESCONDENSADO, utilizado para replicação.  Zonas de confluição com o citoesqueleto, essencial para a segregação eficiente dos cromossomas durante a mitose (divisão celular). Não são replicáveis, mas possuem sequencias especiais – Sequência Consenso (inespecífica, com diferentes zonas, encontrada nos vários cromossomas e que não é conservada). ex.: ACTA; ex.: ACT(A/G) Sequência consenso de centrómero de levedura Extremidades dos cromossomas, com estruturas especiais. Possui sequências altamente repetitivas em cadeia simples, com capacidade de enrolar e formar espécies de “laços” t-loop/d-loop. Normalmente não há genes (no sentido em que não codifica proteínas), mas são replicáveis. Cortam o DNA nas EXTREMIDADES Cortam o DNA por DENTRO. Modelo de Estrutura de Telómero Genética Molecular 9 ICBAS 2019/2020 Quanto maior for o organismo, maior é a quantidade de genes necessários. O Homo sapiens têm aproximadamente 20 000 genes. No entanto, o que interessa não é o número de genes, mas sim a possibilidade de com um gene fazer várias proteínas – splicing alternativo. Verificou-se que não há grande relação entre a evolução de um organismo e a quantidade de DNA/genes. Sequencia DNA ≠ Sintetizar DNA! Número de genes por unidade de espaço. À medida que os organismos evoluem, a densidade genética DIMINUI e o número de genes e o tamanho do genoma AUMENTAM (apesar das plantas terem maior genoma que os humanos).  Bactérias Intracelulares (Parasitas) = 500 genes  E. coli = 57 genes  Bactérias Free-living = 1.500 genes  Saccharomyces cerevisiae = 31 genes  Eucariotas Unicelulares = 5.000 genes  Drosophila = 9 genes  Eucariotas Multicelulares = 13.000 genes  Humanos = 2 genes  Vertebrados Superiores e Plantas = 25.000 genes  Mamíferos = 25.000 genes  Humanos = 20.000 genes!!!!! Um gene humano médio tem 9 exões (DNA que corresponde a aminoácidos numa proteína), 1 região NÃO TRADUZIVEL e 27.000 pares de bases (27kb). Os genes correspondem a 25% do genoma humano, sendo que apenas 1% codifica proteínas (exões) e os restantes são intrões. 50% do genoma humano são sequências de DNA repetitivas, com grandes repetições e pequenas repetições (telómeros). A maior parte do genoma humano deriva de transposões (45%) que são elementos genéticos móveis que “saltam” por movimentos ancestrais. Quantos nucleótidos são precisos para codificar 1 aminoácido? 3 nucleótidos! Quantos genes são essenciais? Realiza-se a contagem através da técnica do iRNA (de interferência). Os genes essenciais (aqueles genes sem os quais o organismo não sobrevive) são uma fração pequena no organismo. Ao pegar num organismo e inativar parte dos genes o que se verifica é que grande parte dos genes quando destruídos não acarretam consequências. Para o humano estão previstos 4.000 a 8.000 genes “letais”, havendo 1.300 casos conhecidos. Porque existem tantos genes que não fazem nada? Uma das explicações é a Redundância, isto é, redundância das vias metabólicas. Se existir uma via metabólica essencial e se destruir o respetivo gene, o organismo NÃO sobrevive. Mas se existir outra via metabólica para fazer basicamente o mesmo, ele sobrevive. Outra razão é que mais do que um gene desempenha a mesma função. Genética Molecular 10 ICBAS 2019/2020  Conjunto de genes. Não é tão importante a quantidade de genes que temos, mas sim eventualmente a capacidade de fazer proteínas. Hoje sabe-se que a maioria dos genes (mais de metade) em humanos estão inativos. São genes resultantes de replicações e que por mutação foram inativados. No mRNA, para a tradução do DNA, existe:  1 Codão de Iniciação = AUG (codifica metionina);  3 Codões STOP = TAA, TAG, TGA. A suscetibilidade para certas doenças pode ser explicada em casos em que determinadas famílias estão mais propensas para desenvolver a doença. Isto acontece porque já têm a mutação, a qual não tem qualquer efeito, mas que quando combinada com uma segunda mutação, poderá desenvolver a doença. Mutações num só gene podem não ser letais, mas mutações noutros genes com interações com o primeiro podem ser letais e promover certas doenças, ou seja, dois ou mais genes podem não ser essenciais sozinhos, mas em conjunto podem tornar-se essenciais – Letalidade Sintética.  Enzimas que reconhecem sequências específicas de DNA. Ao cortar nessas sequências, geram especificidade e são compatíveis com outras extremidades e permitem ligar 2 tipos de DNA.  Usam muito material presente nas próprias células (enzimas). Em poucas horas é possível obter uma grande quantidade do mesmo gene. Se se utilizar a eletroforese, esta permite ver exatamente a quantidade de genes.  Desnatura-se as cadeias e depois volta-se a juntar. Como se pode juntar 2 cadeias de DNA que sejam complementares, permite uma grande variedade de possibilidades.  A que mais tem acelerado. Consiste em determinar sequências de bases. Vários organismos foram estudados e hoje em dia temos a sequenciação de muitos genomas.  Normalmente usam chips. Permite analisar se os genes são ou não expressos. É possível ver se é mutante e quando é que se expressa. Geralmente, usa-se para ver em dois tipos de células diferentes (células do fígado e coração, por exemplo) se o gene está mais expresso numa ou noutra, ou fazer esta análise entre células em cultura ou células com uma droga qualquer. Polimerase Chain Reaction Algumas células do sistema imune fazem recombinação das sequências de DNA (o genoma não é igual em todas as nossas células). Estas técnicas usam enzimas que a própria célula usa para viver normalmente. Genética Molecular 11 ICBAS 2019/2020   É uma DNA polimerase que adiciona nucleótidos às extremidades 3’ do DNA (síntese de 5’ para 3’), mas não precisa de molde. Se tivermos 2 DNAs em cadeia dupla, é possível ligá-los, mas em solução é DIFÍCIL encontrarem- se. No entanto, se tiverem extremidades ligeiramente protuberantes e em cadeias simples, facilmente emparelham e torna-se MAIS FÁCIL ligarem-se Se pusermos sempre os mesmos nucleótidos e os complementares no outro DNA, as duas extremidades vão se ligar. Neste segundo caso, a DNA polimerase é utilizada para marcar DNA radioactivamente, usando como primer¸ um bocado de cadeia dupla e cadeia simples. Nas extremidades 3’ com OH, é iniciada a síntese de nucleótidos por complementaridade à outra cadeia. A DNAse (enzima que corta DNA) vai degradando a mesma cadeia de DNA no mesmo sentido que a DNA polimerase sintetiza, mas a DNAse vai à frente para ganhar espaço para mais síntese. Ao usar-se muita quantidade de DNA e pouca enzima, a enzima não é capaz de destruir TODO o DNA. Resulta em DNA com cortes, que são usados pela polimerase para sintetizar DNA. As enzimas polimerases têm esta capacidade de corrigir erros, pois se elas se enganam têm atividade de nucleasse e geram novos nucleótidos para ocupar o lugar do erro. Têm capacidade de digestão de 5’  3’. Quando encontram o corte, começam a degradar o DNA que está à frente e a sintetizar de novo. Fazendo as reações na presença de nucleótidos radioativos, ela pode incorporar nucleótidos radioativos no DNA, que fica marcado radioactivamente (sonda).  É uma polimerase a qual foi removida a atividade de nucleasse, só tendo a atividade de síntese. Normalmente, pega-se no DNA, desnatura- se, separam-se as cadeias, DNA abre e é misturado com pequenos nucleótidos (20pb – oligonucleótidos) de sequência aleatória que ligam algures no DNA onde tenham uma sequência complementar na cadeia molde. Esta polimerase de síntese pega nestas Genética Molecular 12 ICBAS 2019/2020  extremidades e sintetiza DNA. Na presença de nucleótidos radioativos, sintetiza DNA radioativo/marcado.  É capaz de sintetizar DNA complementar ao RNA (cDNA), que é diferente do DNA porque no RNA já foram removidos os intrões dos genes. Quando se faz cDNA, é possível ver como é que codifica uma proteína, porque já não tem intrões. Também permite identificar genes. A extração de RNA dos organismos permite a sua sequenciação e sequenciação da zona do genoma onde o RNA foi transcrito e, se é uma sequência transcrita em RNA, em princípio codifica um gene.  Digere DNA de 3’  5’, mas tem como substrato, DNA de cadeia dupla. Extremamente confiável, muito constante, 400 nucleótido/minuto. Se se pretender estudar um gene e saber que zonas do promotor são importantes para o gene, é possível digerir progressivamente o promotor, mantendo o gene intacto, com uma extremidade protegida, depois cortar mais um bocadinho, juntando aquilo ao gene e continua intacto. De seguida, ver se ainda se expressa.  Degrada ácidos nucleicos em cadeia simples, servindo para mapear intrões num gene ou saber onde é que um gene começa. Ao separar as cadeias de DNA e juntá-las com o RNA, cria-se uma zona RNA/DNA em cadeia dupla. Ao adicionar a enzima, tudo o que está em cadeia simples é degradado e fica-se exatamente com a zona de DNA que corresponde ao gene (porque está em cadeia dupla).  Usa ATP e faz ligações de DNA, tendo como substrato duas cadeias duplas ligadas a uma cadeia simples. A ligase faz ligações fosfodiestéricas. T4 é um vírus. T4 DNA ligase significa que a enzima foi isolada do vírus T4. Genética Molecular 13 ICBAS 2019/2020   Enzimas muito usadas para regulação genética. Em conjunto, podem ser usadas para marcação de DNA, nomeadamente DNA radioativo. Na extremidade 5’ do DNA, a fosfatase REMOVE o fosfato e a quinase ADICIONA outro fosfato. Ao usar o fosfato do ATP radioativo, o DNA vai incorporar a radioatividade. Quando se marca DNA obtém-se uma sonda, porém, hoje em dia, a marcação radioativa é pouco usada, usando-se outro tipo de moléculas (nucleósidos modificados).  A descoberta destas enzimas foi extremamente importante. Certos vírus infetavam determinadas bactérias, multiplicando-se. Mas, quando estes vírus eram usados para infetar outras bactérias, a maioria morria, exceto um ou outro. Existia um mecanismo de modificação/restrição. O DNA vírico, ao entrar numa bactéria, era modificado segundo as características dessa bactéria e eles não sobreviver. Estas enzimas de restrição cortam o DNA em sequências especificas que reconhecem. As bactérias têm outro sistema de proteção que é de modificação. As sequências de DNA bacteriano estão metiladas e as enzimas de restrição que as reconhecem não cortam esse DNA. Quando os vírus se multiplicam numa bactéria, não têm a modificação para aquela bactéria (o seu DNA não está metilado), o DNA é digerido e eles são eliminados. No entanto, um ou outro, ao infetar a bactéria, consegue que o seu DNA seja modificado antes de ser cortado e depois adquirem uma estrutura com modificação das sequências iguais à bactéria e sobrevivem na bactéria.  Locais de reconhecimento e de corte são DIFERENTES, ou seja, reconhecem uma sequência, mas cortam noutro local.  Reconhecem a sequência e cortam essa sequência. Genética Molecular 14 ICBAS 2019/2020 Se existirem 2 moléculas de DNA cujas extremidades em cadeia simples não são compatíveis, aqui entra a engenharia genética. Se uma extremidade for TAAG e a outra extremidade for TTA, há um nucleótido a mais na primeira extremidade. Então, estas enzimas permitem modificar as sequências de modo a emparelharem. É possível converter as duas moléculas a apenas DNA em cadeia dupla, retirando a sequência em cadeia simples, através da nucleasse S1. A clonagem é um processo in vivo, enquanto que o PCR é um processo in vitro. A PCR (polimerase chain reaction) consiste em adicionar nucleótidos, DNA polimerase e um molde de DNA, permitindo a síntese de DNA num tubo. A clonagem consiste na incorporação de um DNA alvo no DNA do organismo, formando um DNA recombinante. O próprio organismo, quando replica a sua informação genética, vai replicar o DNA alvo. O DNA na célula para ser usado precisa ter uma origem de replicação (local onde começa a separação das cadeias), cuja sequência é reconhecida pelos iniciadores. Ao colocar DNA estranho dentro de outra célula, o mais provável é a célula destruir esse DNA. Outro facto é que o DNA alvo que se pretende replicar não tem nenhuma origem de replicação. Deste modo, na clonagem são usados os vetores Moléculas que possuem origem de replicação, tendo capacidade de replicação numa célula. O vetor é recombinante e tem genes que funcionam como marca genética. Normalmente têm uma origem de replicação para vários organismos (bactérias, leveduras, células humanas, por exemplo). Também há vetores shuttle, que têm uma origem de replicação para bactérias e outra para leveduras. Genética Molecular 15 ICBAS 2019/2020 Neste processo, o DNA alvo e o vetor são cortados pela mesma enzima de restrição, para terem extremidades compatíveis (como se tratam de moléculas pequeninas, é mais fácil as extremidades encontrarem-se). A ligase liga 2 moléculas com origens completamente diferente, formando o DNA recombinante. Processo de incorporação do DNA alvo num vetor (plasmídeo) e sua passagem para dentro de uma bactéria. Ao replicar, a célula replica o vetor e o gene alvo. Os vetores utilizados são especiais, pois não têm contro de replicação e dividem-se várias vezes (ao contrário do cromossoma que só se divide 1 vez). A incorporação de DNA nas células é um fenómeno raro. É necessário fazer processos de seleção. Ao colocar milhões de células em placas de meio com antibiótico, a maior parte morre e apenas sobrevivem as que têm gene mutante de resistência ao antibiótico. Quando se meter o DNA na célula, o vetor utilizado tem de ter um gene de seleção (resistência a um antibiótico, por exemplo), conferindo resistência à célula. As que NÃO incorporam o DNA (vetor + gene alvo) são SENSIVEIS e MORREM. Numa cultura de bactérias em que todas são sensíveis ao antibiótico, pretende-se selecionar 1 ou 2 que se tornaram resistentes por mutação. Para tal, coloca-se as bactérias num meio com antibiótico, a maioria morre e as que sobrevivem são as resistentes. Isto é. Na situação contrária, numa cultura de células em que são todas resistentes ao antibiótico e há 1 ou 2 sensíveis, é mais complicado porque não há um meio que diretamente as selecione. É necessário fazer o “Replica-plating”. Genética Molecular 16 ICBAS 2019/2020  Plasmídeo (vetor) que tem:   (sequência de DNA em que há uma enzima que corta só uma vez. Se cortasse em vários sítios seria difícil reconstituir a molécula toda);  Como resultado, é possível obter algumas moléculas do vetor que ligaram a uma sequência de DNA e outras que não ligaram e o DNA fechou novamente. Coloca-se a mistura (vetor sozinho + DNA alvo sozinho + DNA recombinante) em bactérias:  Se a bactéria for sensível a estes antibióticos e NÃO incorporar o plasmídeo, irá MORRER;  Se incorporar o plasmídeo INTACTO, fica com resistência aos dois antibióticos e SOBREVIVE;  Bactérias transformadas com plasmídeo intacto  Resistentes aos 2 antibióticos;  Bactérias transformadas com plasmídeo recombinante  Resistentes à ampicilina, mas sensíveis à tetraciclina A bactéria fica apenas resistente à ampicilina, porque o local de clonagem onde o DNA alvo é incorporado fica no gene da resistência à tetraciclina, inativando este gene. Assim, tem de se pôr as bactérias num meio só com este antibiótico (ampicilina). As placas têm suporte com veludo, que funciona como milhões de agulhas, e retém as bactérias e inocula-as na segunda placa, exatamente na posição onde estavam na primeira. Se tiver primeiro só com ampicilina e segundo com ampicilina+tetraciclina, as que são sensíveis à ampicilina NÃO vão crescer. As bactérias que SOBREVIVEM na primeira e NÃO CRESCEM na segunda, são RESISTENTES à ampicilina e SENSÍVEIS à tetraciclina. Isto é Como vimos, na clonagem, usa-se um DNA recombinante (vetor com gene alvo incorporado) que é colocado dentro de uma célula hospedeira que se reproduz e replica o DNA. O método clássico consiste num plasmídeo recombinante com genes de resistência que vai ser clonado em bactérias. O problema neste caso é que vão existir plasmídeos resistentes à ampicilina e sensíveis à tetraciclina, mas o plasmídeo intacto dá resistência a ambos. Para selecionarmos o pretendido, coloca-se as bactérias num meio com ampicilina e depois num meio com tetraciclina e bactérias que NÃO CRESCEREM são as pretendidas, porque são as que inativaram o gene!  Capacidade de se reproduzirem em variadas células.  Têm origem de replicação para que sejam reconhecidos e replicados quando entram numa célula.  Têm marcas genéticas de seleção que dão resistência a um antibiótico, tornando assim de fácil reconhecimento as células que são clonadas (sobrevivem quando colocadas num meio com esse antibiótico). Genética Molecular 17 ICBAS 2019/2020   Têm local de clonagem, onde se insere o DNA.  Os vetores mais avançados têm um polylinker – local onde várias enzimas de restrição cortam, ou seja, é possível clonar qualquer bocado de DNA e cortá-lo com qualquer uma dessas enzimas. Quando um gene é clonado, esse mesmo gene pode ser inativado durante a replicação. Na figura abaixo, os plasmídeos são produzidos de modo ao polylinker estar dentro de um gene. Neste caso, o gene deste plasmídeo é o LakZ que codifica a β-galactosidade (degrada a lactose). O que acontece neste caso é que quando se faz a clonagem, esse gene é destruído. Colocando as bactérias num meio com uma substância que muda de cor com as bactérias com o gene LakZ ativo (expressam a β-galactosidade que degradando a lactose do meio, permite a mudança de cor), é possível distinguir plasmídeos recombinantes, os LakZ inativos (não mudam de cor), dos não recombinantes, os LakZ ativos (ficam avermelhadas/amareladas). Tipicamente crescem em bactérias, mas também podem crescer em leveduras. São pequenos e com capacidade de clonagem baixa. Genética Molecular 18 ICBAS 2019/2020  Um dos interessas da clonagem. As proteínas que estão codificadas no gene são expressas, permitindo a obtenção e o uso de grandes quantidades dessa proteína. (insulina, por exemplo). O mais utilizado é o fago lambda, que tem uma estrutura típica (cápsula + DNA). Este injeta o seu DNA dentro de uma célula e, depois de utilizar a maquinaria celular para se replicar, rebenta a célula. A replicação de DNA (aqui diferente) gera moléculas enormes de genomas do fago e quando termina, há uma enzima que corta o DNA, dando origem a DNA de 12 nucleótidos com extremidade em cadeia simples (fragmentos cos). Por isso, quando entra na bactéria, o fago vai circular o DNA viral, porque essas partes emparelham com as sequências complementares.  Adição de um gene de DNA alvo ao genoma do fago.  Substituição de um gene do fago por um novo gene de DNA alvo. É possível eliminar genes que NÃO são necessários e inserir nesse local o fragmento de DNA alvo. Os dois tipos diferem no tamanho do DNA alvo que podemos clonar (aproximadamente 25.000pb) O vírus é, por se multiplicar milhares de vezes numa célula, ótimo para clonagem e amplificação de genes. É possível identificar determinados vírus pelas proteínas que eles codificam. λ É simultaneamente um fago de inserção e um vetor de expressão (a clonagem do gene alvo permite a expressão da proteína desse gene). Tal como no plasmídeo, o local de clonagem do fago é um gene (LakZ), mas é usado numa perspetiva diferente. Quando se insere o fragmento de DNA no local de clonagem, o gene do fago é eventualmente inativado. Portanto, para garantir que a proteína que se pretende replicar vai ser lida de 3 em 3 nucleótidos, tem de ocorrer fusão correta do DNA alvo Genética Molecular 19 ICBAS 2019/2020  inserido com o gene do local de clonagem (proteína de fusão), porque o interesse deste método é apenas garantir a produção correta e numerosa da proteína. Nem todas as proteínas se tornam proteínas de fusão. Isso só acontece se o fragmento de DNA entrar na ordem de leitura correta (de 3 em 3). A probabilidade de um fragmento entrar numa ordem correta de leitura é 1/3, mas o fragmento pode entrar do “1” para o “3” ou do “3” para o “1”, logo a probabilidade é 1/6. Portanto, o vetor de inserção vai fazer uma proteína de fusão entre o gene da β- galactosidade e o gene que se coloca. Molécula pequena derivada dos fragmentos cos. Pode ser manuseado como o plasmídeo, mas tem a extremidade cos do fago, permitindo a inserção de grandes fragmentos de DNA que são adicionados dentro de um vírus. O nosso genoma tem cerca de 109 nucleótidos, portanto se pretendêssemos fazer uma biblioteca de genes seria necessário partir o DNA em bocadinhos, colocá-los em plasmídeos e, por fim, colocar cada plasmídeo numa bactéria. Isso implicaria milhões de bactérias para todo o genoma (seria só estupido, obviamente…). Porém, se em cada vetor/plasmídeo se colocar fragmentos cada vez maiores, são necessários menos plasmídeos para se obter o genoma completo! (que génio!) Como tal, usando os cósmidos, onde é possível guardar cerca de 20.000 pares de bases, são apenas necessárias cerca de um milhão de clones para se ter o genoma humano todo. São usados para clonar uma grande quantidade de DNA (até 1 milhão de pb). Depois do corte com enzimas de restrição, preparam-se os fragmentos de modo aos telómeros ficarem nas extremidades. Estes vetores apresentam  Origem de replicação;  Origem de clonagem;  Centrómero e Telómeros. BAC = Bacterial Artificial Chromosome YAC = Yeast Artificial Chromosome A biblioteca são todos os genes constituintes de um organismo. Nos cromossomas, temos o genoma que é cortado com enzimas de restrição. Esse DNA é colocado em plasmídeos e esses plasmídeos num hospedeiro. Obtém-se cada bactéria com um gene/clone diferente. Quando todos os genes de um organismo são clonados tem-se a tal biblioteca de genes. Quando um cromossoma é cortado em fragmentos pelas enzimas de restrição, obtêm-se fragmentos sobrepostos (cada fragmento apanha sempre parte do anterior, etc). Genética Molecular 20 ICBAS 2019/2020 Para se obter uma biblioteca representativa com todos os fragmentos, usam-se vetores que cortam na sequência GATC (muito frequentemente corta em 1 : 256 pb). Também se deve usar pouca enzima para pouco DNA. Contém, em princípio, todo o DNA do genoma representado, cortado em pequenos fragmentos, que são parcialmente sobrepostos. Cada fragmento de DNA está representado em média, mais do que uma vez. Quando se constrói uma biblioteca do género, tem-se o equivalente a 4/5 genomas. DNA sintetizado a partir de RNA purificado! Uma vez que se trata de cDNA, ocorreu anteriormente splicing, logo os intrões foram removidos. Portanto, NÃO está presente todo o DNA do organismo, porque aquilo que não é transcrito, não vai estar representado. Neste tipo de biblioteca, não há tRNA’s. Se houver uma célula que esteja a expressar determinada proteína em abundância, é possível ter muitas cópias desse DNA. Assim, por exemplo, se se pretender determinado gene muito ativo no cérebro, não se recolhe RNA do fígado (expressão proteica é muito distinta).     Genética Molecular 21 ICBAS 2019/2020  Cada bactéria (hospedeiro) tem um gene diferente da biblioteca. Colocando as bactérias clonadas numa placa de Petri, após destruição da parece celular, é possível marcar as proteínas produzidas por cada gene, usando anticorpos (preferencialmente radioativos). Se seguida passa-se por um filtro e o produto (anticorpo + proteína) fica agarrado ao filtro na mesma localização das colónias que as produziram. Por raios X, encontra-se a localização da marcação radioativa. Assim, consegue-se corresponder a bactéria à proteína que se quer identificar. Deteta-se o gene com uma sonda (DNA marcado radioactivamente). Passa-se a biblioteca genética por um filtro específico para ligar DNA, que depois é hibridizado com uma sonda com cDNA marcado (radioactivamente, por exemplo). Usa-se novamente o filtro raios X para localizar o DNA pretendido. Considere uma levedura com gene de seleção (gene responsável pela síntese de uridina/arginina). Se se colocar leveduras que não sintetizam uridina nem arginina e outras que foram transformadas com o plasmídeo recombinante com o gene para a síntese de arginina (gene alvo), no meio de cultura simples só crescem as leveduras com o plasmídeo recombinante. A levedura não consegue crescer porque não consegue sintetizar arginina, enquanto a outra é complementada pelo gene de síntese de arginina. Genética Molecular 22 ICBAS 2019/2020  É possível transformar uma levedura com um gene de uma bactéria (organismos diferentes), que também funciona na levedura. Os humanos NÃO POSSUEM ESTE MECANISMO!!!! Este processo de complementação é usado para reparação de DNA. Muitos dos genes humanos responsáveis por reparação do DNA foram clonados em leveduras, uma vez que não se podem fazer experiências humanas. Consiste em “andar ao longo do cromossoma”. É muito usado no humano, porque muitas vezes pretendem-se isolar genes que codificam doenças (quando há história familiar, pode-se seguir a doença por árvores genealógicas). É possível associá-los aos SNP’s (single nucleotide polymorphism), que no fundo são marcas genéticas. Por análise das árvores genealógicas, faz-se o estudo da segregação dos SNP e se forem segregados com o gene da doença, significa que são genes ligados (próximos uns dos outros). Assim, a probabilidade de recombinação é baixa. Quando esses genes vão para outros indivíduos, vão juntos, uma vez que estão ligados. Sabendo que o gene da doença está perto do SNP no cromossoma, pode-se isolar sequências sucessivas de DNA, marcá-las radioativamente e, fazendo delas uma sonda, pode-se ir à biblioteca buscar essas mesmas sequências e eventualmente isolar o gene pretendido. Genética Molecular 23 ICBAS 2019/2020 É uma das técnicas mais poderosas a nível do estudo de genes. A eletroforese consiste na separação de moléculas de DNA (ou proteínas) de acordo com o seu tamanho. Tem como base uma matraz sólida em gel (agarose polimerizada em “rede”) que está contida numa tina e banhada por um tampão, onde é aplicada uma corrente elétrica (diferença de potencial que percorre os fios de platina). Esta estrutura dificulta a passagem das moléculas (DNA vai do polo (-) para o polo (+)), portanto a distância percorrida por cada molécula é INVERSAMENTE PROPORCIONAL ao logaritmo do seu peso molecular. As moléculas mais pequenas vão percorrer uma maior distância, sendo que os fragmentos maiores afundam no gel muito mais cedo. As moléculas são separadas por tamanho, desde uma centena de pares de bases até cerca de dez mil pares de bases (limites/amplitude da separação). As moléculas migram e formam bandas, do tamanho maior ao mais pequeno. É colocada uma substância gel – brometo de etidio (agente intercalante) – que se intercala no meio do DNA (no meio da cadeia dupla), emitindo fluorescência de cor alaranjada quando é excitado por radiação UV. Através do fornecimento de um aminoácido radioativo, todas as proteínas vão ficar radioativas e não se consegue distinguir as que são produzidas num determinado momento (marcação). Num organismo ou célula, em que as proteínas são feitas no citoplasma, ao colocar metionina marcada radioactivamente, consegue-se marcar todas as proteínas sintetizadas nesse momento. De seguida, após esperar 1 minuto, fornece-se às células uma quantidade brutal de metionina não radioativa, para diluir. A partir desse momento, as células começam a incorporar metionina não radioativa, em vez da radioativa. Ao aplicar corrente alternadamente por períodos curtos, o DNA vai migrar em zig-zag, primeiro numa direção e depois noutra. Quando muda de direção, tem de se reorientar e isso permite fazer separação de grandes moléculas de DNA, desde 220 mil até milhões de pares de bases. Aqui usa-se um gel especial que permite separar moléculas que diferem entre si num só nucleótido. A partir desta técnica é possível determinar a sequência de DNA (sequenciação de DNA). Genética Molecular 24 ICBAS 2019/2020 A eletroforese permite obter mapas de restrição de DNA (molécula de DNA onde é possível determinar locais físicos onde atuam determinadas enzimas de restrição). A enzima A possui 2 locais de corte, gerando 2 fragmentos (um maior e um mais pequeno), separados na eletroforese. Quando se corta o DNA com a enzima B, o DNA vai linearizar, gerando uma banda que vai ser maior do que estes dois. A informação útil para construir os mapas de restrição é dada quando a enzima tem 2 locais de corte da molécula. Outra técnica aplicada ao DNA (apesar de ter começado a ser desenvolvida para RNA). Conjuga eletroforese e mapas de restrição. Consiste no ato de transferir DNA de um gel para o filtro. Técnica aplicada a RNA. Técnica aplicada a proteínas O DNA é cortado pela enzima de restrição e os seus fragmentos são separados num gel por eletroforese. De seguida, transferem-se os fragmentos do gel para um filtro, onde ficam expostos, passíveis de serem detetados. A solução alcalina desnatura o DNA (cadeia simples) e arrasta-o para o filtro, criando-se uma réplica do DNA que estava no gel. No entanto, se os fragmentos de DNA forem muito pequenos, ficam muitas bandas, que não se conseguem distinguir. De seguida, pode-se hibridar um gene específico com uma sonda radioativa (DNA radioativo) e essa parte do DNA hibridado vai ligar-se ao cDNA, marcando-o. Genética Molecular 25 ICBAS 2019/2020 Isto é usado para detetar mutações genéticas. Se existir uma mutação que altere o local de corte da enzima, encontram-se duas bandas mais pequenas. Quando a sonda se liga, não reconhece um, mas dois fragmentos. A sonda é cadeia simples, pelo que tem de ser usada uma solução alcalina desnaturante, ficando o DNA separado em cadeia simples. Depois quando passa para o filtro, por causa da solução desnaturante, aparece com cadeia dupla. A mesma técnica pode ser aplicada ao RNA. O RNA já está em cadeia simples, logo não é necessário fazer o passo da desnaturação. De resto, pode fazer-se na mesma a hibridação com uma sonda e detetar o RNA. Para além da marcação radioativa do DNA, é possível marcar o DNA com cromófros fluorescentes. Localização de genes específicos em cromossomas metafásicos ou localização da expressão genética (RNA). A sequenciação de DNA envolve síntese de DNA, na qual se podem utilizar os derivados de nucleótidos (di-desoxirribonucleótidos). Numa situação normal, quando um novo desoxirribonucleótido é adicionado, a polimerase insere um grupo fosfato que vai reagir com o grupo OH do desoxirribonucleótido que já lá está. No entanto, os di-desoxirribonucleótidos não têm o grupo OH em 3’ e, portanto, quando um destes é adicionado, a síntese de DNA para, sendo denominados também de “nucleótidos terminadores”. Na sua utilização, criam-se todas as condições normais para a síntese de DNA (primer, polimerase e desoxirribonucleótidos A, C, G e T), colocando-se depois alguns di- desoxirribonucleótidos numa concentração muito baixa. A síntese de várias moléculas de DNA vai terminar em pontos diferentes, obtendo-se cadeias sintetizadas com vários tamanhos. Existem vários terminadores (t-A, t-C, t-G, t-T), sendo que se encontra um codão STOP em 1:64 Genética Molecular 26 ICBAS 2019/2020 Na eletroforese só é detetada a cadeia molde. A cadeia que está a ser sintetizada pode ser detetada por raio-x. Cada terminador (A, C, G e T) é marcado com uma cor diferente, assim não é necessário separá- las no gel. O computador deteta e diz que nucleótido é. A “anotação” do genoma consiste em, por exemplo, localizar regiões codificantes, que codificam proteínas. Portanto, determinar onde se localiza um codão de iniciação, uma sequência e um codão STOP. No caso dos eucariotas, é necessário distinguir intrões de exões. Uma sequência de DNA é lida de 3 em 3 nucleótidos (codão). Portanto, há 6 formas diferentes de ler uma sequência. Probabilidade de aparecer um determinado codão STOP = ¼ x ¼ Prob. de aparecer um codão STOP qualquer = ¼ x ¼ x ¼ = 1/64. Corresponde ao nº de determinados codões STOP em relação ao total (64 é o número de codões possíveis). Frequência de codões STOP = 3/64 (é aproximadamente 1/20, logo é de esperar encontrar codões STOP de 20 em 20 codões. Genética Molecular 27 ICBAS 2019/2020 Técnica muito utilizada para amplificação in vitro de DNA. É uma técnica muito sensível, conseguindo obter milhares de sequências partindo de uma só cópia do gene, a partir de uma célula e um par de horas. O PCR consiste num ciclo-base repetido várias vezes (normalmente 20 a 30 ciclos), obtendo uma amplificação do DNA (Crescimento Exponencial) após 2 ciclos. Elevação da temperatura a 100ºC, para desnaturação do DNA (separação em 2 cadeias simples – substrato para a DNA polimerase); Diminuição da temperatura (50ºC), com posterior aumento para uma temperatura ótima (70ºC); Hibridação de 2 primers complementares (20 pares de bases), com grupo OH livre para a DNA polimerase atuar; Adição da DNA polimerase, a baixa temperatura para poder emparelhar os 4 nucleótidos com um tampão; Amplificação da cadeia entre os 2 primers. Para o ciclo seguinte, a DNA polimerase não sobreviveria à elevação da temperatura, portanto para repetir o ciclo seria necessário adicionar sempre mais enzima. Descobriu-se a enzima T aq polimerase (T aq = Thermus aquaticus, um organismo que vive a altas temperaturas), que resiste a elevadas temperaturas. Isolando a polimerase, funciona otimamente a 72ªC, mas resiste a 95ºC, permitindo executar múltiplos ciclos de PCR rapidamente numa espécie de robot. Genética Molecular 28 ICBAS 2019/2020 O substrato inicial é DNA em cadeia dupla, cujas extremidades correspondem a locais onde se desenham os primers, se delimita a zona de DNA que vai ser amplificada. Ao fim do 3º ciclo obtêm-se 2 produtos da PCR. Sabendo qual a região exata do cromossoma que se pretende amplificar, esta técnica pode ser muito útil. Por exemplo, existem genes do milho e genes do lagarto muito parecidos em certas regiões, porque quando as proteínas têm funções importantes, as suas sequências são conservadas. Quando se encontra uma região de interesse, hibrida-se, clona-se e amplifica-se essa região:  Pode-se clonar, colocar num vetor e num hospedeiro, e sintetizar a própria proteína codificada por este DNA, ou seja, obtenção de clones genómicos através do DNA;  Pode -se obter clones de cDNA, com recurso à enzima transcritase reversa, que copia RNA para DNA. A doença do exemplo ao lado é uma anemia falciforme, com mutações no gene da β- globulina. Num indivíduo normal, a enzima de restrição Dde1 corta o DNA deste gene em 3 locais, formando 2 fragmentos de DNA (após o DNA ser colocado num gel e por uma membrana). A mutação neste gene localiza-se num local de restrição da enzima, pelo que passam a haver apenas 2 locais de corte e, portanto, apenas 1 fragmento de DNA. A figura mostra o diagnóstico de uma doença hereditária efetuado por hibridação Southern. Resultados similares podem ser obtidos, mais facilmente, por PCR. Genética Molecular 29 ICBAS 2019/2020  É usado hoje em dia, em casos de crimes ou testes de paternidade. É um processo bastante rápido e fiável. Por exemplo, antigamente, só dava para excluir, mas hoje em dia dá para dizer “É este o pai!”. Os genes podem ser altamente polimórficos, variando de indivíduo para indivíduo. Pode-se analisar um determinado locus que é repetido (VNTR: nº variável de repetições seguidas). Se se analisar qualquer individuo, desenham-se primers que hibridam fora desses genes/locus, assim quando amplificam com PCR, dependendo das repetições que ali estão (ex.: CACACA), o fragmento que resulta é diferente, neste caso é maior do que este. Quando se analisar por gene, tem-se o resultado em que se vê 2 bandas, porque é 1 gene do pai e outro da mãe. Quando se analisa muitos loci, começam a fazer um padrão genético do indivíduo que é específico. Funcionam como impressões digitais genéticas. A amplificação do DNA depende do número de moléculas iniciais. A síntese de DNA é proporcional ao número de moléculas iniciais, por isso é possível quantificar PCR. É muito usado para vírus ou para saber a expressão genética. Por exemplo, pode-se expor um grupo de células a uma droga que induz morte celular e ter outro grupo de células não-expostas. É possível estudar as proteínas/transportadores ABC (exportam drogas para fora da célula): O gene desse transportador ABC é analisado com e sem a droga. O gene normalmente quase não é expresso, mas quando se coloca a droga, aumenta quase 100x. RT = Reverse Transcription Genética Molecular 30 ICBAS 2019/2020 Se se amplificar uma sequência, pode-se cloná-la num vetor, que normalmente tem um promotor (local onde as DNA polimerases ligam). Há genes que só são feitos em certas condições, por exemplo, se formos expostos a alta temperatura, expressamos diferentes tipos de genes. Normalmente, esses promotores só funcionam com esses estímulos. Neste caso, clonou-se o gene da helicase da bactéria, próximo de um promotor que responde a choque térmico/temperatura. Assim, basta colocar as células sobre um pequeno choque de temperatura, que em pouco tempo, permite produzir quantidades enormes da proteína. Uma grande quantidade de proteínas acaba por ser tóxica para a célula, principalmente se a célula ainda estiver a crescer. Assim, só se vai induzir o choque térmico em células adultas, que podem morrer porque já temos a quantidade necessária de proteína. Consiste na geração de organismos mutantes e transgénicos. Genética Molecular 31 ICBAS 2019/2020 Atualmente, existe a genética reversa – genotipar a proteína. Com a sequência da proteína, NÃO se consegue saber exatamente a sequência de DNA, mas pode-se deduzir as possibilidades. Quando se testam as possibilidades, alguma das sequências vai hibridar o gene. Antes, sequenciava-se parcialmente a proteína, depois com a sequência de nucleótidos não exata, marcava-se o DNA radioactivamente e, numa biblioteca de genes, isolava-se o gene correspondente e sequenciava-se o DNA. Depois, provocando mutações no DNA, fazem-se experiências para saber a função da proteína. Durante a reprodução dos organismos, o DNA tem de ser multiplicado de modo a não se perder. Quem faz esta duplicação são enzimas especiais chamadas DNA polimerases, que necessitam de alguns substratos para funcionarem:  Cadeia Dupla de DNA;  Cadeia Simples de DNA (cadeia molde), ligada a um primer/iniciador (oligonucleótido);  Primase (enzima que faz o primer);  Nucleótidos Trifosfatados (fosfato alfa, beta, gama) que perde um pirofosfato quando se liga ao DNA, ficando apenas o fosfato alfa – (ligação irreversível que liberta energia). Genética Molecular 32 ICBAS 2019/2020 As DNA polimerases NÃO conseguem iniciar uma cadeia e, portanto, elas precisam de um primer que fornece um grupo 3’-OH onde a polimerase vai adicionar nucleótidos. Contrariamente às RNA polimerases, que conseguem iniciar uma cadeia, as DNA polimerases têm de ter este grupo OH para sintetizar DNA. A polimerase NÃO é muito especifica, usando qualquer nucleótido. A DNA polimerase tem uma estrutura tridimensional com a forma de uma mão, com o local catalítico (onde se dão as reações) na palma. A síntese ocorre de 5’ para 3’ e a DNA polimerase garante o emparelhamento do nucleótido de tal maneira que o grupo OH-3’ livre fique alinhado e capaz de atacar o fosfato-5’, fazendo a ligação fosfodiastérica com o DNA. O que determina a especificidade é este emparelhamento. A DNA polimerase NÃO utiliza ribonucleótidos (rNTP’s), que são 10 vezes mais abundantes, porque o grupo OH extra no açúcar (o grupo OH-2’) não existe nos desoxirribonucleótidos, que altera o alinhamento do ataque. Genética Molecular 33 ICBAS 2019/2020 Estas enzimas usam iões metálicos que estabilizam o DNA e alteram a sua conformação. Quando surge um nucleótido para ser ligado, os iões de magnésio e zinco (Mg2+ e Zn2+, carregados positivamente) estabilizam-no interagindo com as porções de carga negativa (os grupos fosfato). São enzimas processivas, ligando-se a um substrato e fazendo muitas reações antes de se desligarem. A DNA polimerase demora 1 segundo a encontrar o substrato/cadeia molde de DNA e agarra-se fazendo a ligação. O processo de adição de nucleótidos que ocorre depois é extremamente rápido (milissegundos), ligando 1000 nucleótidos/segundo. De cada vez que se liga consegue sintetizar cerca de 50 mil nucleótidos, ou seja, 50.000 nucleótidos/ligação. Uma enzima não processiva forma o complexo enzima-substrato, origina um produto e liberta-se de seguida (corresponderia a 1 nucleótido/segundo). Característica importante da polimerase. Caso detete um erro, a DNA polimerase consegue sintetizar DNA e, ao mesmo tempo, degradá-lo. Quando a DNA polimerase está a fazer a síntese de DNA, adiciona o nucleótido que emparelha com o da cadeia molde:  Se o emparelhamento for correto, o processo prossegue;  Se o emparelhamento não for correto, a estrutura não consegue prosseguir. Os últimos nucleótidos sintetizados desaparelham localmente (atividade de exonuclease na extremidade de 3’ para 5’), ganhando afinidade ao local de nucleasse da enzima. O nucleótido errado é retirado e depois a síntese prossegue. De uma forma geral, o erro que a DNA polimerase comete é muito pequeno por duas razões: 1) Seletividade na escolha de nucleótidos a emparelha; 2) Quando escolhe o nucleótido errado, possui um mecanismo de correção desse erro. Genética Molecular 34 ICBAS 2019/2020 Para além do mecanismo de proofreading, há um mecanismo de reparação de mismatch dirigida, que atua depois da DNA polimerase. No total, o erro possível no DNA é mínimo (1 em cada milhão de nucleótidos). A replicação de DNA é considerada semi-conservativa, pelo que cada uma das cadeias serve de molde à síntese de uma nova cadeia. Também é semi-descontínua (segmentos de Okazaki na cadeia de lagging). Na replicação, as duas cadeias antiparalelas da molécula de DNA têm que abrir, formando o garfo de replicação. A molécula de DNA tem 2 garfos de replicação, um em cada sentido, constituindo uma bolha de replicação. Uma das novas cadeias é sintetizada continuamente de 5’ para 3’ (cadeia leading) e a outra cadeia é sintetizada de forma descontínua (cadeia lagging com segmentos de Okazaki sintetizadas a partir dos primers). Os segmentos são depois unidos e os primers removidos. Enzima que sintetiza os primers (constituídos por RNA) que servem para iniciar os fragmentos de Okazaki. Depois as polimerases utilizam um pequeno grupo OH-3’ para iniciar a síntese da nova cadeia de DNA; A RNAse consegue destruir RNA, mas não consegue destruir o último nucleótido dos primers, que é um híbrido. Uma exonuclease é uma enzima que degrada uma extremidade do DNA e as endonucleases degradam-no no meio (ex.: topoisomerase); Genética Molecular 35 ICBAS 2019/2020  Estabelece a ligação 5’ para 3’ entre a própria cadeia de DNA; Enzima que utiliza a hidrólise de ATP para desenrolar o DNA nos dois sentidos. É uma espécie de donut, constituído por 6 subunidades idênticas, que tem um buraco no meio que permite a passagem de cadeias simples de DNA, mas não de cadeias duplas; Estabilizam o DNA, depois de ele ser aberto, para que possa ser separado e posteriormente replicado. Estas proteínas apresentam ligação cooperativa, isto é, a ligação de uma, facilita a ligação de outra. Se uma proteína se ligar a uma molécula é favorecido progressivamente a ligação de várias proteínas à mesma molécula. Não dependem da sequência de DNA para se ligarem; Aliviam as tensões provocadas no DNA durante o seu desenrolamento, depois das helicases abrirem o DNA (separam as duas cadeias). Há dois tipos de DNA topoisomerases: Corta apenas uma cadeia de DNA. Tem uma tirosina com um grupo OH que ataca o fosfato da cadeia do DNA, provocando uma quebra que possibilita que as cadeias de DNA desfaçam a tensão, girando uma sobre a outra e se voltem a unir. Corta as duas cadeias de DNA. Tem a mesma função, só que como quebra as duas cadeias, passam a cadeia de cima para baixo e voltam a reestabelecer a ligação, ou seja, transformam o super-enrolamento positivo em super-enrolamento negativo. Genética Molecular 36 ICBAS 2019/2020  Em bactérias existem 5 polimerases, que são vários complexos proteicos. Acabam por formar uma grande estrutura chamada replissoma (da mesma forma que existe o ribossoma para sintetizar proteínas, este sintetiza DNA). Pol I Primer removal, repair Pol α Primer synthesis Pol II Repair Pol β Repair Pol III core Replication Pol γ mtDNA Replication Pol III holoenzyme Replication Pol δ Lagging-strand, repair Pol IV Repair, TLS Pol ε Leading-strand, repair Pol V TLS Several others Multiple A principal polimerase em bactérias é a polimerase III. A holoenzima é a polimerase mais longa. A polimerase mais pequena é a polimerase I, ótima para fazer a pré-síntese do DNA. Depois, o grosso de DNA é sintetizado pela polimerase III. Resumindo, a polimerase I e a polimerase III são as mais importantes na replicação, mas depois há outras polimerases que estão envolvidas na reparação de danos de DNA. Genética Molecular 37 ICBAS 2019/2020 Quando uma das duas cadeias de DNA tem nucleótidos danificados, na replicação, a DNA polimerase já não tem informação sobre aquele local. Então, a polimerase chega lá e não sabe que nucleótido meter, acabando por meter um qualquer, seguindo a lógica que é melhor reparar de qualquer forma do que ficar ali um buraco. Em eucariotas há muito mais enzimas:  Pol α: 2 subunidades de primases;  Pol δ e Pol ε: Atuam depois da Pol α e são especializadas nas cadeias que sintetizam (lagging e leading, respetivamente);  Pol γ: Polimerase especial. Sintetiza mtDNA; Há muitas outras polimerases que estão envolvidas na reparação de DNA. Genética Molecular 38 ICBAS 2019/2020 As polimerases são presas ao DNA pelo anel deslizante, o que permite que se liguem e sintetizem uma centena de nucleótidos e depois se desliguem. No entanto, como estão presas pelo anel deslizante, voltam-se logo a ligar novamente e começam a sintetizar outra vez. O anel deslizante tem a forma de um donut que se liga ao DNA e tem um orifício que permite apenas a passagem das duas cadeias de DNA e possivelmente algumas moléculas de água, formando uma estrutura deslizante. Este anel deslizante (= sliding clamp) que rodeia o DNA tem uma outra estrutura associada que é o carregador (= clamp loader), ligados através do gasto de ATP. O carregador tem proteínas θ (estrutura flexível) associadas às polimerases. O facto de na mesma estrutura existirem duas polimerases permite que uma delas esteja a sintetizar a cadeia contínua/leading e a outra esteja a sintetizar a cadeia dos fragmentos de Okazaki/lagging, tornando o processo muito mais eficiente! As polimerases ligam-se, começam a sintetizar DNA e o carregador adiciona o anel deslizante que segura o DNA. O anel deslizante é posteriormente removido, mas não é imediatamente removido, pois ele fica a servir de sinal a outras proteínas (RNAse que remove o primer e uma DNA polimerase que sintetiza esse local). Teoricamente a replicação poderia ocorrer em qualquer local da molécula de DNA. No entanto, a replicação começa em vários pontos específicos. Por exemplo, nas bactérias, que possuem uma origem de replicação, começa no meio. Molécula capaz de ser replicada. Sequência específica de DNA que dá o sinal para a replicação do DNA O replicão necessita um replicador com:  Zonas reconhecidas pelos iniciadores;  Zonas que abrem ligeiramente o DNA;  Zonas onde começa a síntese de DNA. Os replicadores variam consoante os organismos, sendo mais ou menos parecidos em termos de conceção, mas diferentes em termos de composição. Proteínas que reconhecem o replicador (reconhecem sequências especificas), atraem a helicase e iniciam a replicação. Genética Molecular 39 ICBAS 2019/2020 Em bactérias, o modelo de funcionamento é semelhante. O iniciador é o DNA-A, que se liga nos locais de origem de replicação, alterando a conformação do DNA para que haja desnaturação parcial das cadeias, atraindo outras proteínas (DNA-C e DNA-D, semelhante à helicase). As helicases ligam as cadeias simples e começam a desenrolar o DNA, atraem primases que fazem os primers, que depois atraem a DNA polimerase que começa a sintetizar o DNA numa das cadeias continuamente e noutra cadeia descontinuamente. Desde que as polimerases começam, têm o carregador do anel deslizante que fixa as polimerases ao DNA. A replicação é um processo extremamente preciso, eficiente e regulado. A célula tem de assegurar que o DNA é todo replicado só uma vez! A replicação quando termina, bloqueia os replicadores (quando um replicão chega a um replicador, este é inativado). Uma bactéria tem DNA circular e, portanto, uma só origem de replicação/replicador. É nesse local que o iniciador reconhece e o DNA é todo replicado. Em eucariotas, não existem apenas uma origem, mas sim várias origens de replicação para o processo ser mais eficiente. As células têm que garantir que as origens são usadas para replicar DNA apenas uma vez. Se esta origem for ativada porque o iniciador a reconhece e começa a Genética Molecular 40 ICBAS 2019/2020 sintetizar DNA, eventualmente vão chegar a uma zona em que estão a replicar origens de replicação. Ora, se estas zonas fossem ativadas, estas zonas seriam duplamente duplicadas. Como tal, quando há replicação, se esta passar por algum local de replicação, ele é INATIVADO, não podendo ser usado para iniciar a replicação, garantido que o DNA é só uma vez replicado. As cinases são muito importantes na regulação das células através da fosforilação de proteínas. As Cdk (cyclin-dependent kinases) são cinases que fosforilam a helicase e uma série de proteínas, ativando o complexo de pré- replicação. A helicase, ao ser fosforilada, começa a desenrolar o DNA e vai atrair uma primase que sintetiza o primer de RNA e, posteriormente, esta vai atrair polimerases. A Cdk também inibe formação de novos complexos. Inclui o iniciador, Cdk, helicase, polimerase α, primase, etc… Genética Molecular 41 ICBAS 2019/2020 Para garantir que o DNA é replicado uma só vez:  O complexo pre-RC é formado na fase G1;  O complexo é apenas ativado na fase S, podendo começar a replicar. A célula regula este processo através dos níveis de atividade da cinase:  Baixa Atividade: Criam-se os complexos pre-RC, mas não são ativados;  Elevada Atividade: Os complexos já existentes são ativados e inibem a formação de novos complexos pre-RC. Quando se replica moléculas de DNA circular de bactérias, no final da replicação, as duas moléculas ficam interligadas, sendo necessário a intervenção das topoisomerases, que separam os dois produtos de replicação. A topoisomerase II é uma proteína que cortas as duas cadeias do DNA, para uma molécula para o outro lado e volta a unir. No caso dos humanos, um cromossoma pode ser totalmente replicado sem ter moléculas sobrepostas, mas na prática também existe este problema devido à forma como o DNA é guardado “enrolado” nas células. Outro problema é o facto de uma cadeia ser sintetizada no sentido 5’3’ de forma contínua e a outra ser sintetizada de forma descontínua através dos fragmentos de Okazaki. A porção terminal 5’ do cromossoma iria ficando ao longo de gerações cada vez mais curta, porque, o pedaço terminal de primer ao ser removido, não se conseguiria sintetizar DNA naquele local através de DNA polimerases, já que sintetizam por cima de um grupo OH. Genética Molecular 42 ICBAS 2019/2020 Para resolver este problema, as bactérias e vírus usam, em vez de um primer, uma proteína que funciona como primer de RNA, que usa um aminoácido dela própria como primer. Em vez de ter uma molécula de RNA, ela adiciona um grupo OH ao primeiro nucleótido, podendo depois prosseguir a síntese. No caso dos humanos, existem enzimas especiais para replicar as extremidades dos cromossomas. Polimerase diferente das outras porque é uma ribonucleoproteína (tem moléculas de RNA). Repetições de sequências ricas em T e G. A telomerase consegue emparelhar parcialmente com a extremidade do DNA e estender a extremidade 3’, sintetizando nucleótidos como cópia do próprio RNA. Quando termina, desliga-se, emparelha mais à frente e assim sucessivamente. Depois, a cadeia de cima é replicada pelo processo normal, tendo a cadeia recentemente sintetizada em baixo como molde. Há teorias que referem que o tamanho dos telómeros está relacionado com o nosso envelhecimento, maior ou menor probabilidade de ter cancro, etc. As células utilizam proteínas que ligam os telómeros para controlar o tamanho e proteger os telómeros. Os telómeros têm de ser protegidos, já que o DNA está em cadeia simples e as cadeias simples de DNA normalmente recebem sinais para emparelhar em situações normais, mas, neste caso, esse processo tem de ser bloqueado. Genética Molecular 43 ICBAS 2019/2020 Atualmente, sabe-se que células mais velhas têm telómeros mais curtos, pois as células à medida que envelhecem têm menor atividade da telomerase. A replicação do DNA é usada como alvo de gentes anti-víricos (ex.: AZT, Acyclovir) e anti-tumorais:  Inibem a síntese de nucleótidos (5- fluorouracilo, 6-mercaptopurina);  Inibem a síntese de DNA (citosina arabinósido);  Danificam DNA e bloqueiam replicação (cisplatin). A mutação surge pelo processo de mutagénese, induzido por um mutagénico. O gene resultante é um gene mutante. Mutação num par de bases Transforma uma purina+pirimidina em purina+pirimidina; Transforma uma purina+pirimidina em pirimidina+purina; Adição ou remoção de 1 ou 2 nucleótidos, existindo mais consequências. Altera um codão e o respetivo aminoácido; Genética Molecular 44 ICBAS 2019/2020  Altera um codão para um codão STOP (TAA/TAG/TGA); Alteração de um codão para outro codão com as mesmas características; Não causa alteração no codão ou no aminoácido, devido à redundância do código (ocorre na 3ª base do codão). A mutação volta ao estado original. Nos mutantes em cultura, a probabilidade de reverter a mutação é igual à probabilidade inicial de surgir neles a mutação. A mutação suprime o efeito de uma primeira mutação. Adição ou remoção de nucleótidos. Podem ser intra-génicas ou inter-génicas:  Mediadas por tRNA supressores. Os codões STOP continuam ser lidos.  Diferentes genes. Genes cuja mutação origina mutações noutros genes, que fazem parte dos sistemas de reparação. Um organismo que tenha deficiência nos genes que estão envolvidos na reparação do DNA e sofra a mesma taxa de mutação que os outros, não as corrigirá e estas vão-se acumulando. As mutações provocadas por terem mutações nesses sistemas de correção são denominadas MutS. Proteínas homólogas bacterianas e humanas têm função semelhante, o que significa que suas sequências de genes e de aminoácidos são iguais. Em biologia, homólogo é um termo que caracteriza uma origem ancestral comum e, portanto, as funções são um pouco diferentes.  (Setas Vermelhas);  (Setas Azuis);  (Setas Verdes);  Remoção da base púrica;  Remoção de amoníaco, com transformação de citosina em uracilo, detetável facilmente, ou metil-citosina em timína, HOT-SPOT;  Surgem por exposição solar e impedem o emparelhamento com a adenina. Genética Molecular 45 ICBAS 2019/2020  A hipoxantina emparelha com a citosina (C) Genética Molecular 46 ICBAS 2019/2020  Emparelhamento diferente. Aumentam a distâcia entre nucleótidos para o dobro, porque se intercalam entre as cadeias de DNA. Pode ocorrer deleção ou adição. Provocam mutações frameshift (alteração do padrão de leitura). Ex.: Etídio, Proflavina, Acridina. Correção de Erros da replicação “mismatches” Fotoreativação Dímeros de pirimidinas Excisão de Bases Bases Danificadas Excisão de Nucleótidos Dímeros de pirimidinas e Bases danificadas Reparação de DSB Quebras na cadeia dupla de DNA Síntese de DNA Dímeros de pirimidinas “translesion” e local apurínicos Genética Molecular 47 ICBAS 2019/2020  A célula reconhece uma distorção na hélice do DNA, provocada por um emparelhamento ERRADO de bases por erros da DNA polimerase. Há um mecanismo celular que permite à célula saber qual a cadeia que deve ser corrigida (a cadeia replicada e não a molde original tem citosina metilada) a fim de evitar causar uma mutação. Quando um fragmento de DNA metilado é replicado, a As células metilam cadeia fica num estado semi-metilado, em que a cadeia citosinas para fazer regulação pré-existente está metilada, mas a sintetizada de novo genética. não. Posteriormente, a metiltransferase coloca o grupo metilo na nova cadeia. É durante esse intervalo de tempo que a célula tem oportunidade de corrigir a mutação. Este mecanismo tem o envolvimento de várias enzimas:   Corta a cadeia não metilada, que é a cadeia replicada;  Degrada o DNA e faz um “buraquinho” que é preenchido pelo normal sistema de replicação da célula (polimerase sintetiza o DNA e depois vem uma ligase que liga tudo). Se a lesão ocorrer no sentido 5’3’ (em que a eliminação desse fragmento ocorre também nesse sentido), intervém a Exo VII e se ocorrer no sentido 3’5’, intervém a Exo I Mutações em homólogos de MutS (MSH2) estão na origem de predisposição genética para cancro do colon. Genética Molecular 48 ICBAS 2019/2020  Típico das mutações que se sofre quendo se está exposto a radiações ultravioleta, ou seja, dímeros de timina ficam adjacentes e covalentemente ligados, impedindo que se liguem a adenina. A DNA fotoligase reconhece o dímero, usa energia (um fotão de luz) para desfazer o dímero de timinas (milhares de correções por minuto). As metiltransferases transferem o grupo metilo do DNA para a própria enzima. Há um elevado gasto enzimático, já que a enzima, uma vez metilada, não pode ser regenerada. Consiste na reparação de pares de bases púricas oxidadas. Essa oxidação de purinas é um erro (provoca mutações que podem originar tumores), daí a atual preocupação com a toma de antioxidantes. Num caso particular de oxidação de guanina, esta vai originar o anormal emparelhamento com a adenina, que, se não for corrigida, origina uma mutação. Pode-se excisar a base (fica um “buraco” e tem que ser “preenchido”) ou, como método de recurso/salvaguarda, usar uma glicosilase que retira a base danificada (ex.: um uracilo que resulte da desaminação da citosina). A glicosilase específica de salvaguarda retira a adenina que, entretanto, está emparelhada com a guanina oxidada, a oxoG. Se tudo correr bem e os mecanismos de reparação não falharem, culminará com a adição de uma citosina à tal guanina. Se isto não for corrigido, obtém-se um par GC que passa a ser TA, que é uma mutação (transversão de GCTA) comum em cancros. Genética Molecular 49 ICBAS 2019/2020 Consiste na eliminação de bases (pela glicosilase) ou excisão de nucleótidos. Posteriormente, essa sequência é re-sintetizada pela DNA polimerase. A desaminação da citosina dá uracilo, o que resulta em uracilo-guanina no DNA em vez de citosina-guanina. Como o uracilo não é normal no DNA, uma enzima específica retira essa base, deixando um “buraquinho”. Na replicação, a célula pode colocar uma qualquer base lá, provocando uma mutação ou a falta da base nesse buraquinho gera um local apurínico ou apirimidínico. As endonucleases removem o fosfato e o açúcar no local desse nucleótido em falta, para depois a polimerase e a ligase normalizarem esse buraquinho. Não é apenas retirada a base danificada, mas também alguns nucleótidos à volta. Neste processo, entram os genes Uvr (A, B e C), que, quando ausentes, os organismos ficam extremamente sensíveis a raios ultravioleta e a mutações em genes responsáveis pela correção de erros. Reconhecem o problema Corta o DNA e remove o fragmento problemático É uma helicase Posteriormente, o sistema normal das células é responsável por adicionar de forma correta as bases no local de onde o fragmento foi removido. A TF2 (transcription factor) da DNA polimerase II recruta o sistema de reparação por excisão. Responsável por extrema sensibilidade ao sol (cancro da pele), em humanos. Desenvolvem-se danos graves por consequência de 7 mutações nos genes responsáveis por estes mecanismos de reparação do DNA (excisão de nucleótidos). Das 15 polimerases envolvidas na reparação de DNA, uma está afetada nesta doença – DNA polimerase Pol η (“eta”) – que está associada aos dímeros de timina. Esta polimerase também está afetada em cancros e tumores, gerando células que sofrem e acumulam mutações! Em situações exposição aos raios UV, a DNA polimerase coloca nucleótidos aleatórios para “minimizar os danos” de não poder ocorrer replicação pelos dímeros estarem covalentemente ligados. Nos dímeros de timina, esta DNA polimerase coloca adeninas (reparação bem-sucedida), o que não acontece em pessoas com mutações nesta Genética Molecular 50 ICBAS 2019/2020 polimerase. Essas pessoas utilizam as outras polimerases que estão a funcionar bem (MAS NÃO SÃO ESPECÍFICAS PARA ESTAS SITUAÇÕES), porém não colocam exclusivamente adenina, podendo levar a mutações!!! Quando há mutações no DNA, há problemas a nível da replicação de DNA, como também ao nível da sua transcrição. Há subunidades de RNA polimerases que, nessas situações, atraem proteínas de reparação de DNA. Depois da reparação feita, a transcrição ocorre normalmente. Dímeros de Timina são um problema para a transcrição. Explica a recombinação de DNA na célula. Quando há quebra de DNA rapidamente há enzimas que começam a degradar esse DNA (exonucleases). Como se perde informação, vai se ao outro cromossoma buscar a informação em falta e o “buraco” é reparado. É preferível haver a junção de duas extremidades de DNA do que ficar uma quebra no DNA, mesmo que essa junção leve à perda de nucleótidos, formando mutações. Este sistema também é usado para gerar diversidade de células T e anticorpos, através de alterações de nucleótidos. Genética Molecular 51 ICBAS 2019/2020 As proteínas principais são resultado do gene KU70/80. Estas reconhecem as extremidades da quebra e atraem cinases e ligases, que vão processar as extremidades e conseguir ligá-las. Deficiências nestas proteínas dão origem a patologias raras (devido à falha na reparação de mutações geradas por exposição a radiação), como:  Síndromes hereditários com hipersensibilidade a radiação ionizante e a mutagénicos;  Imunodeficiência. Quando a DNA polimerase encontra dímeros de timina, vai inserir nucleótidos de qualquer maneira, o que leva a uma maior propensão a erros. Participam todas as 15 polimerases de reparação de DNA. Durante a replicação, a DNA polimerase III no anel deslizante é substituída pela Pol IV ou V que adicionam nucleótidos nos locais de erro. Em relação aos dímeros de timina, anteriormente foi dito que a DNA Polimerase η colocam apenas adeninas, o que consiste numa reparação correta. No entanto, outras polimerases atuam neste sistema adicionando nucleótidos com guaninas ou citosinas que não são as “corretas” para as timinas. Para a frente da mutação, o DNA continua a síntese normal pela DNA polimerase III. Genética Molecular 52 ICBAS 2019/2020   A polimerase normal é substituída por uma polimerase que vai reparar o DNA.  A polimerase normal para a síntese e recomeça alguns nucleótidos à frente. Depois a polimerase especial vem corrigir o erro. O sinal para estes processos ocorrerem é uma ubiquitinação do anel deslizante de DNA (ubiquitina é um pequeno péptido). Esta marcação por ubiquitinação é um processo que as células usam para marcar proteínas para “lixo”, neste caso marca a substituição da polimerase normal para correção. Em bactérias, normalmente, estes genes para reparação de DNA não estão ativos. Ora, se as células estiverem submetidas a mutagénicos ou altas temperaturas, têm possibilidade de induzir estes sistemas e começarem a sintetizarem as polimerases especiais de reparação. Este processo chama-se resposta SOS. Para haver a correção de danos no DNA é preciso haver expressão dos genes que codificam para as proteínas de correção, como as polimerases. Normalmente, estes genes encontram-se inativos por ação de genes repressores – o lexA. Proteína envolvida em recombinação de DNA em bactérias. Liga o DNA em cadeia simples, é ativada e provoca a destruição do repressor (lexA). Genética Molecular 53 ICBAS 2019/2020 O recA procura DNA parecido àquele que se pretende recombinar. Depois, promove a troca de material genético (envolvida na reparação de DNA). Quando encontra DNA de cadeia simples (depois de degradado) é um sinal para recombinação. O recA é ativado quando encontra DNA de cadeia simples (ou seja, quando há o sinal). De seguida, o recA promove a destruição/clivagem do repressor lexA, eliminando a inibição dos genes do sistema de reparação de DNA. DNA em cadeia simples pode resultar da exposição a radiação, formando várias quebras no DNA. Este sistema de regulação genética (com uso de repressor) é muito frequentemente usado em bactérias. Avalia os efeitos dos mutagénicos. Tradicionalmente, os produtos da indústria química, farmacêutica e cosmética têm de ser testados para mutagénicos e cancerígenos. Antes faziam-se testes em ratinhos, mas descobriu-se que podiam ser feitos em bactérias, dando resultados mais rápidos, mais baratos e mais fáceis. Como se testa se uma substância é mutagénica ou potencialmente mutagénica? Usa-se uma espécie de salmonela específica. São muito pouco exigentes em relação a nutrientes, pois apenas precisam de água, sais minerais e de uma fonte de carbono (normalmente, açúcar). Usando uma placa de Petri com o meio adequado e bactérias, estas dividem-se, formando uma colónia visível. Para uma bactéria normal, o meio de cultura atrás descrito é suficiente para sobreviverem. Neste teste, usa-se uma espécie especial de salmonela que possui uma mutação pontual que o incapacita de crescer num meio simples como descrito anteriormente. Este mutante cresce apenas com a presença de histidina, pois é incapaz de a sintetizar. Colocando as bactérias num meio simples, elas não se desenvolverão porque o meio NÃO tem histidina. Algumas, ao sofrerem, entretanto, mutações, revertem a mutação pontual, conseguindo sobreviver e proliferar! A lógica do teste é muito simples: há uma substância potencialmente mutagénica. Faz-se um grupo controlo SEM mutagénico e outro COM mutagénico. É de esperar que no tubo de controlo haja uma pequena percentagem que reverta a mutação (força do espontâneo) e no tubo com o alegado mutagénico, se ele for mesmo mutagénico, haja um aumento da frequência de mutação quando comparada com o controlo. Percebeu-se que algumas substâncias que se ingere NÃO são mutagénicas, MAS podem tornar-se nisso após metabolização no fígado. Portanto, pode-se colocar essas mesmas enzimas hepáticas em conjunto com as substâncias alegadamente mutagénicas pós metabolização e avaliar os efeitos Genética Molecular 54 ICBAS 2019/2020  Rearranjos de DNA, onde se verifica o alinhamento dos cromossomas na meiose e a troca de material genético (recombinação propriamente dita). Para além da troca de material genético, tem função de reparação. Ocorre entre duas sequências de DNA homólogas, normalmente situadas no mesmo cromossoma. Mecanismos pelos quais ocorre recombinação geral parecem ser idênticos em todos os organismos. Reação entre pares específicos da sequência de DNA. Divide-se em dois tipos: Elementos do DNA que se movem de um sítio para outro. Permite a inserção de uma sequência de DNA noutra molécula de DNA, sem qualquer homologia entre as duas moléculas. Não implica a formação de DNA heteroduplex. Uma molécula de DNA é clivada em ambas as cadeias em dois locais específicos e as extremidades são religadas às novas cadeias. Envolve a produção de uma curta ligação heteroduplex, sendo necessária a intervenção de uma curta sequência de DNA que é a mesma no doador e no recetor das moléculas de DNA. A recombinação ocorre durante a segregação dos cromossomas durante a meiose. Permite que haja porções de material genético trocado, resultando na criação de novas combinações de sequências de DNA em cada cromossoma. Existem nas zonas de recombinação. Podem ter vários nucleótidos. Correspondem ao local de união das duas hélices (a cadeia de DNA de uma molécula é semelhante à outra). Como vem de progenitores diferentes, o DNA não é exatamente igual (uma cadeia vem da mãe e outra do pai). São quebras na cadeia dupla de DNA e servem de substrato para a recombinação. Genética Molecular 55 ICBAS 2019/2020 A quebra da cadeia de DNA pela ação de endonucleases (extremidade 5’) é degradada pela ação de uma exonuclease, que forma extremidades simples. Estas re-emparelham com o outro cromossoma, pois procuram uma hélice de DNA homóloga para emparelhar, através de Sinapses de DNA. É possível mimetizar este processo em condições laboratoriais (hibridação), havendo reformulação de uma cadeia de DNA a partir de duas cadeias simples separadas. Trata-se de um modelo de recombinação por Robin Holliday. Durante o emparelhamento de DNA, forma-se uma junção Holliday, nos cromossomas crossed-over. Nesta junção, as duas hélices homólogas que emparelham são mantidas juntas pela troca recíproca de duas das quatro cadeias presentes. A junção contém dois pares de cadeias:  Duas cruzadas;  Duas não cruzadas. Esta estrutura pode sofrer isomerização, sendo submetida a uma série de movimentos de rotação catalisados por proteínas específicas, formando uma estrutura mais aberta. A estrutura pode isomerizar para uma estrutura semelhante à inicial, mas na qual as cadeias são convertidas em não cruzadas e vice-versa. Quando obtemos 4 cadeias cruzadas (DNA hétero-complexo), estas podem sofrer isomerização. Consoante o plano de corte, obtém-se diferentes cadeias. Considere dois casos da imagem do lado: Origina moléculas quase iguais à Zona Híbrida = Zona heteroduplex, molécula original; representada pelos asteriscos a vermelho! Origina verdadeiros recombinantes. Como as moléculas são todas semelhantes/homólogas umas às outras, o ponto de cruzamento pode ser deslocado e migrar mais para um lado do que para outro. Genética Molecular 56 ICBAS 2019/2020 Trata-se da transformação de um gene noutro gene! Funciona como a segregação de Mendel, no entanto, neste caso não há uma segregação de 2:2 (sem conversão), mas sim uma de 3:1 (com conversão genética), como consequência direta dos mecanismos de recombinação geral e reparação de DNA. Isto significa, por exemplo, ter 3 cópias da versão materna e 1 cópia da versão paterna do gene. Como o DNA dos progenitores não é exatamente igual, implica a existência de zonas de DNA em que este não emparelha completamente, onde se vai formar DNA heteroduplex. Se a célula, antes de replicar o DNA, reconhecer isto como anormal, vai reparar por mecanismos de correção mismatch – por excisão (representado abaixo a verde) e preenchimento pela DNA sintetase (representado abaixo a vermelho). No entanto, a célula pode não detetar antes da replicação, o que torna as modificações permanentes! No decorrer deste processo, é transferida uma sequência de DNA de uma hélice que se mantém inalterada para outra hélice cuja sequência é alterada (sequência recetora). Neste modelo de recombinação, não há cruzamento das 4 cadeias. Para recombinar 2 moléculas, a cadeia é cortada, dá-se alguma degradação e as pontes onde o DNA que foi degradado sofrem síntese de novo DNA. Há uma estrutura intermédia com a ligação entre as quatro cadeias, que depois é cortada. Neste modelo, não chega a haver cruzamento. Genética Molecular 57 ICBAS 2019/2020 O DNA em cadeia dupla sofre um corte e as extremidades sofrem ligeira degradação, ficando a extremidade 3’ livre que é o substrato de uma enzima específica. Depois de atuar esta enzima, as cadeias não procurar homólogos do DNA homólogo e emparelham, fazendo a típica síntese de DNA (5’ para 3’) – reparando o que foi degradado na fase anterior. Há quebra e degradação de DNA, seguido de reparação a partir da informação da outra cadeia de DNA! O sistema de correção mismatch impede a recombinação geral, pois deteta bases mal emparelhadas de DNA sem correção. A resolução dos intermediários na recombinação geral é diferente durante a mitose e a meiose:  Recombinação  Reparação de DNA Ocorre frequentemente o emparelhamento de sequências que parecem homólogas (mas são só semelhantes) entre dois cromossomas. Se elas forem muito diferentes uma da outra, o sistema de correção deteta que há bases mal emparelhadas e impede esta recombinação. Quando as sequências são repetidas, se o DNA quebra e há degradação, pode haver emparelhamento de algumas sequências (as que forem semelhantes), ligação e perda de algumas sequências que não emparelham (as do meio). As consequências da recombinação dependem da orientação das cadeias. As consequências são minimizadas quando a célula reconhece que certas sequências NÃO são para recombinar. Genética Molecular 58 ICBAS 2019/2020  Se existir uma quebra no DNA, a célula vai buscar a informação ao outro cromossoma, sendo que se encontrar uma sequência parecida no outro cromossoma (sequências repetidas, etc.), pode fazer recombinação. Ao fazer recombinação, o cromossoma pode ir buscar a informação por translocação, ou seja, quando há perda de DNA, se as enzimas encontrarem sequências equivalentes no outro cromossoma há, no fundo, translocação entre cromossomas. Proteína bacteriana de recombinação. Esta enzima possui a capacidade de procurar DNA homólogo. Quando ocorre quebra da cadeia dupla, a enzima reconhece a extremidade 3’ livre e procura uma cadeia dupla com extremidade simples, com DNA complementar para emparelhar (branch migration). É um processo muito rápido. As bases saem quase do DNA e experimentam emparelhar com a cadeia. Se houver complementaridade entre as duas cadeias dupla e simples, o processo de emparelhamento pode ocorrer de forma espontânea. Na presença da enzima, esta vai polimerizar na extremidade 5’, promovendo este emparelhamento. Promove a separação de uma cadeia simples da cadeia dupla se ocorrer emparelhamento. Genética Molecular 59 ICBAS 2019/2020  Em bactérias, são sistemas que geram o substrato de recombinação, porque as bactérias possuem determinadas sequências chi abundantes, que significam recombinação. Podem estar dispostas num laço, mas funcionam num só sentido! Como se gera o substrato (cadeia simples)? A recB (lenta) e a recD (rápida) são helicases, que desenrolam o DNA, sendo que uma funciona de 5’3’ e a outra de 3’5’. A enzima lenta vai acumular anéis de DNA de cadeia simples. Há uma pausa, levando à degradação das moléculas. A extremidade 3’ livre é usada pela recA para encontrar uma sequência homóloga, promovendo a recombinação! As enzimas ruvA e ruvB formam um complexo que faz a ligação dos ramos, deslocando o ponto de cruzamento, para trás ou para a frente! A enzima ruvC é uma nuclease, cortando o DNA. Corta segundo 2 sentidos. Resolve os complexos. Genética Molecular 60 ICBAS 2019/2020  E coli Eucariotas Emparelhamento de DNA e recA Rad51, Dcm1 (meiose) invasão de cadeias Introdução de DSB Nenhuma Spo11 (meiose), HO (mating) Processamento de quebras recBCD Complexo MRX para gerar cadeias simples e invasão Reconhecimento da junção ruvAB Desconhecidas Holliday e migração dos ramos Resolução das junções ruvC Complexo Rad51c-XRCC3 e Holliday outras Nas bactérias, não ocorrem as quebras do DNA (DSB) e nova síntese de DNA por recombinação ou reparação. Nos eucariotas, há várias proteínas intervenientes, nomeadamente proteínas específicas na meiose, na quebra de cadeias duplas de DNA – Spo11 -, potenciando a recombinação e induzindo o crossing-over. A tirosina desta enzima possui um grupo OH que ataca os fosfatos do DNA. Se não ocorrer recombinação, este processo é facilmente revertido. Estas proteínas são importantes, não só no processo de recombinação, como no que diz respeito a propensão/predisposição genética para ter cancros da mama. Metade dos cancros da mama são resultado numa mutação BRCA2 que interage com Rad51, sendo que esta não está envolvida diretamente na recombinação, mas sim no sistema de reparação de DNA por recombinação. Em eucariotas, a proteína Spo11 vai atuar em conjunto com o complexo MRX, que vai ser responsável pelo processamento de DNA, com ligeira degradação das extremidades 5’ para gerar DNA de cadeia simples livre. Esta serve de substrato para a procura de homólogos das sequências de DNA pelo Dmc1 e Rad51. Genética Molecular 61 ICBAS 2019/2020 Esquecendo um pouco a associação da recombinação com a reparação de DNA, aqui a recombinação é usada para regulação genética, sendo que constitui um caso muito específico de conversão génica (gene transformado em outro). As leveduras (fungos unicelulares) existem de dois tipos (géneros das leveduras): α e a. Estas podem transforma-se no outro tipo e podem cruzar entre si, gerando uma levedura aα (célula diploide), obtendo no final das separações da meiose 2 tipo a e 2 tipo α. Estas células têm 3 loci que codificam o sexo. Dois dos genes estão silenciados, tendo apenas um deles expressão genética:  Expressão