Sbobina Lezione 4-1 PDF

4 lez Biologia, 14/11/2023 SISTEMA DELLE ENDOMEMBRANE Le vie biosintetiche secretorie e endocitiche uniscono le endomembrane in una rete interconnessa. La via secretoria: proteine partono dal RE, passano attraverso l’apparato di Golgi e poi attraverso una serie di vescicole vengono portate all'es...

4 lez Biologia, 14/11/2023 SISTEMA DELLE ENDOMEMBRANE Le vie biosintetiche secretorie e endocitiche uniscono le endomembrane in una rete interconnessa. La via secretoria: proteine partono dal RE, passano attraverso l’apparato di Golgi e poi attraverso una serie di vescicole vengono portate all'esterno attraverso un processo di esocitosi. La via endocitica: materiale esterno della cellula viene internalizzato attraverso un processo di endocitosi. Le vie biosintetiche secretorie endocitiche uniscono le endomembrane in una rete interconnessa di scambio di materiale nella cellula. La via secretoria può essere: 1. Costitutiva: cioè continua quindi cellula rilascia all’esterno sostanze in modo continuo, sostanze che sono importanti per il mantenimento dell’ambiente extracellulare. 2. Regolatoria: secrezione avviene a seguito di stimoli esterni cosi la cellula riceve uno stimolo a cui risponde e la risposta determinerà di sostanze importanti per la cellula. STUDIO DELLE ENDOMEMBRANE Il sistema di endomembrane è stato scoperto in seguito ad esperimenti in cui si cercava di capire il luogo in cui avvenisse la sintesi delle proteine di secrezione e tutto l’iter seguito dalle proteine per raggiungere poi l’ambiente esterno. Vediamo le varie tecniche: 1. AUTORADIOGRAFIA Tecnica che consente di rilevare posizione del materiale marcato radioattivamente in un tessuto o in una cellula o in un insieme di molecole. Il campione radioattivo viene posto a contatto con una emulsione fotografica che è esposta alle radiazioni del tessuto => questo consente di andare a vedere la posizione del materiale che viene marcato. I siti che contengono radioattività sono rivelati dai granuli di argento quando il film viene sviluppato. Tecnica usata per lo studio delle cellule acinose del pancreas da Palade e Jamlenson ( attraverso questa tecnica vinsero Nobel per la medicina). Le cellule pancreatiche vennero utilizzate perchè possiedono uno dei sistemi di endomembrane molto sviluppato infatti le cellule funzionano nella sintesi e nella secrezione degli enzimi digestivi dai dotti del pancreas, dove vengono sintetizzati. [ogni cellula ha delle caratteristiche peculiari: le cellule muscolari, deputate alla contrazione muscolare, avranno un reticolo endoplasmatico liscio più sviluppato]. Questi due scienziati presero le cellule acinose del pancreas e le misero in coltura con degli amminoacidi marcati radioattivamente per un tempo molto breve, ad esempio 3 minuti. Dopo i 3 min, le cellule sono state fissate e osservate al microscopio. E è stato visto che gli amminoacidi marcati erano presenti al livello del RE => quindi ipotizzarono che le proteine sono sintetizzate nel RE. Questi amminoacidi marcati venivano man mano incorporati dagli enzimi sintetizzati dalle cellule pancreatiche e venivano trovati nel RE. Dopodichè fecero l’esperimento del pulse-chase. Ad una fase di pulse, cioè la fase in cui venivano trattate le cellule con gli amminoacidi marcati, segue una fase chase, una fase in cui gli amminoacidi radioattivi vengono sostituiti da amminoacidi non marcati/radioattivi in eccesso. La fase di chase è importante perché ci permette di seguire il percorso degli amminoacidi marcati perché se continuassimo a inserire soltanto gli amminoacidi marcati non riusciremmo a capire qual è il percorso di quelli marcati dell’inizio; quindi gli amminoacidi non marcati che inserisco nella fase di chase sono importanti perché permettono di continuare la sintesi delle proteine. Più è lungo il tempo chase, cioè di incubazione con materiale non radioattivo, più è lungo il percorso di questi amminoacidi e dovremmo trovarli più avanti rispetto al RE. Se nella fase di chase gli enzimi sono incubati con amminoacidi non radioattivi per 20 minuti, vediamo che le proteine si spostano dal RE all’apparato di golgi. Andando avanti con la fase di chase, dopo 120 minuti le proteine marcate radioattivamente si trovano nelle vescicole e poi andranno incontro ad esocitosi. RISULTATI DI PULSE-CHASE Vediamo tutti i compartimenti: RE, apparato di Golgi, vacuoli di condensazione che originano dalla faccia trans del Golgi, granuli di secrezione. I risultati ottenuti con gli esperimenti di pulse-chase hanno mostrato che il percorso seguito dalle proteine secretorie parte dal RER poi alle vescicole periferiche sul lato cis del complesso di golgi e infine in circa 30 min ai vacuoli di condensazione. Se ci sono 3 min di pulse, la maggior parte delle proteine marcate radioattive (86%) si trova a livello del RER e se dopo questi 3 min di pulse, si applicano 7 min di chase, scende la percentuale delle proteine radioattive nel RER e aumenta la percentuale di proteine periferiche quindi proteine passano dal reticolo al Golgi. Poi andando avanti dopo 37 min, aumenta la percentuale di proteine che si trovano nei vacuoli di condensazione. Aumentando il tempo di chase (117 min) ci sono le proteine che si trovano nei granuli zimogeni che contengono enzimi che devono essere rilasciati all’esterno. Vediamo che nucleo e mitocondri non sono interessati nella via secretoria di queste proteine che partono dal RE. 2. GREEN FLUORESCENT PROTEIN (GFP) GFP è una proteina che emette luce fluorescente quando opportunamente eccitata. Scoperta nel 1962 in una medusa l ’Aequorea victoria, così chiamata perché raccolta nella baia dell’isola Victoria in Canada. È una proteine costituita da 238 amminoacidi, con un PM i 27.000 dalton e con 11 foglietti beta che vanno a formare la struttura del barile-beta + 2 segmenti alfa elica: uno di questi si trova alla base del barile, l’altro segmento alfa, che si trova al livello dell’asse centrale, contiene un fluoroforo cioè una porzione che assorbe luce e emette fluorescenza. Vantaggio della proteina: piccole dimensioni infatti può essere fusa a proteine cellulari per analisi del traffico e localizzazione delle proteine nella cellula. Come funziona? Una volta che una proteina di interesse viene associata alla GFP, la possiamo seguire perché diventa fluorescente e quindi riusciamo a vedere il percorso di questa proteine perché si muoverà. Nell’esperimento si utilizzano cellule infettate con il virus della stomatite vescicolare VSV nel quale uno dei geni virali (VSGV) è fuso con GFP. Questo gene virale ovviamente si esprimerà e darà origine ad una proteina che deve essere secreta. Viene utilizzato nell’esperimento un gene termosensibile, che ha una mutazione temperatura sensibile che impedisce alla proteina VSVG neosintetizzata di lasciare il RE. Questo gene termosensibile quando viene incubato ad una T di 40C° per 60 min, impedisce alla proteine di uscire dal RE => e tutta la fluorescenza si va a localizzare all’interno del RE. Se abbassiamo la T a 32 C° per 10 min, la proteina GFP associata al gene virale, che si localizzava nel RE, si sposta e la ritroviamo nell’apparato di Golgi. Quindi questa tecnica di fondere la proteina di interesse con la proteina GFP, ci permette di andare a capire come si sposta la proteina di interesse grazie alla fluorescenza data dalla GFP. Utilizzando diverse fluorescenze si possono individuare diversi organelli => attraverso il MERG, cioè sovrapposizioni, riusciamo a vedere diverse localizzazioni di proteine e diversi organelli. 3. STUDIO DEI MUTANTI Esperimento su lievito perché hanno un piccolo numero di geni che vengono fatti crescere come cellula aploide per cui mutazioni su un singolo gene producono effetti evidenti poiché non è presente la seconda copia che maschera il mutante. Mutazioni di geni che codificano per proteine coinvolte nel processo di secrezione, hanno permesso di capire come avviene la secrezione. Le due mutazioni rilevate: Mutazione sec12: normalmente il prodotto di questo gene è coinvolto nella formazione delle vescicole dalla membrana del RE => quindi la mutazione sec12 impedisce la formazione delle vescicole che si accumulano nel RE con un ingrandimento delle cisterne del RE. Mutazione sec17: normalmente il prodotto del gene è coinvolto nella fusione delle vescicole con la membrana del Golgi => quindi la mutazione sec17 porta ad un aumento delle vescicole nel citosol. 4. siRNA in generale l’insieme degli Rna di piccole dimensioni è chiamato smallRNA. I piccoli RNA sono RNA non codificanti, non codificano per le proteine MA agiscono come regolatori. Tale famiglia si divide in quattro famiglie, suddivisione che rispecchia le caratteristiche qualitative e funzionali dei vari smallRNA. Tali famiglie includono: - SiRNA: (Short Interfering RNAs) piccoli rna a doppio filamento di 21-22 nucleotidi generati da rna a doppio filamento molto più lunghi. Vanno ad appaiarsi a specifici mrna target. Tali RNAs mediano il silenziamento genico portando alla degradazione dell’RNA messaggero cui sono PERFETTAMENTE complementari, oppure provocano il silenziamento della trascrizione andando a rimodellare la cromatina a livello delle sequenze codificanti i geni cui sono complementari. Lo studio della mannosidasi II rende chiaro l’uso del siRNA come regolatori genici. Nell’esperimento che è stato svolto si è cercato di individuare le proteine coinvolte nel processo di spostamento della mannosidasi II, un enzima sintetizzato nel reticolo endoplasmatico ruvido, che si trasferisce nel Golgi (dove si localizza). Per individuare tali proteine, è stato fatto uso di un siRNA, che, andandosi a legare con l’mRNA complementare (che esprime un certo tipo di proteina, importante nel passaggio della mannosidasi II dal reticolo al Golgi), lo silenzia. Ciò impedisce il passaggio della mannosidasi II dal reticolo al Golgi, determinandone la ritenzione nel reticolo. La mannosidasi II (riconoscibile dalla fluorescenza), dopo aver finito la sua sintesi nel RER è trasportata da alcune proteine al Golgi, dove si localizza. Inserito il siRNA e legatosi all’mRNA complementare, quest’ultimo viene silenziato, impedendo l’espressione della proteina utile al trasporto della mannosidasi II. L’enzima fluorescente resta bloccato nel RER. Ciò ha permesso, perciò, di trovare tutte quelle proteine che consentono il passaggio da un compartimento della cellula ad un altro; tali proteine sono specifiche. ORGANELLI Gli organelli sono compartimenti separati, con attività specifiche; e sono: - Reticolo Endoplasmatico; - Apparato del Golgi; - Lisosomi; - Mitocondri;  - Perossisomi. RETICOLO ENDOPLASMATICO Il Reticolo Endoplasmatico è un sistema di membrane interconnesse e comprende regioni “lisce” e regioni “ruvide”, rendendo, così, possibile la sua suddivisione in: - Reticolo Endoplasmatico Liscio (REL); - Reticolo Endoplasmatico Ruvido (RER). Il RER (Reticolo Endoplasmatico Ruvido) è formato da una serie di cisterne interconnesse, sulla cui membrana sono adesi i ribosomi, organelli associati alla sintesi proteica. Il REL (Reticolo Endoplasmatico Liscio) si presenta sottoforma tubulare ed è privo di ribosomi. Questo (sotto) è un ribosoma che sta sintetizzando delle proteine. Tutte le proteine cominciano il processo di sintesi nel citosol; alcune proteine la terminano nel citosol, altre nel Reticolo Endoplasmatico Ruvido. Questa differenza è dovuta dalla destinazione delle proteine: in particolare, le proteine che hanno come destinazione la secrezione, la membrana plasmatica o i lisosomi (enzimi), terminano il loro processo di sintesi nel Reticolo Endoplasmatico; invece, le proteine che rimangono all’interno della cellula e sono rivolte agli altri organelli (mitocondrio, cloroplasto, perossisoma, nucleo,..), terminano la loro sintesi nel citosol. Come fa una proteina ad essere, effettivamente, dirottata verso il Reticolo Endoplasmatico Ruvido, o trattenuta nel citosol? Lo smistamento delle proteine ai diversi comparti cellulari dipende dalla presenza, sulla proteina stessa, di brevi sequenze (di circa 15-30 amminoacidi), dette sequenze segnale, che, localizzate sull’estremità N- terminale delle proteine stesse, le indirizzano al Reticolo Endoplasmatico Ruvido. Come avviene il passaggio delle proteine dal citosol al RER? IPOTESI DEL SEGNALE L’esperimento è stato condotto sui mielomi, tumori maligni dei linfociti B che secernono immunoglobuline. L’intenso "traffico" cellulare è costituito dalle vescicole che attraversano la cellula in direzioni opposte: dall'interno verso l'esterno o viceversa. Le proteine che si trovano libere nel citosol hanno come loro sede definitiva il nucleo, i mitocondri, i cloroplasti o i perossisomi. Le proteine che sono state prodotte sul RER finiscono nei lisosomi, sulla membrana plasmatiche nelle vescicole secretorie. La traduzione degli mRNA inizia sempre nel citoplasma ma in dipendenza di specifici segnali può continuare e ultimare nel citoplasma stesso o sui ribosomi legati al Reticolo Endoplasmatico. Lo smistamento delle proteine ai comparti cellulari dipende da specifiche sequenze di amminoacidi presenti sulla proteina stessa. Tali sequenze sono dette sequenze segnale. Pertanto, il destino della proteina è noto già al momento della trascrizione del gene corrispondente. Reticolo Endoplasmatico: RER funzione “Sequenze-segnale” sulle proteine secretorie nascenti indirizzano ai diversi comparti tutto il macchinario traduzionale La presenza delle sequenze segnali prevede che esse siano riconosciute da specifiche proteine (recettori di smistamento) che le indirizzano al compartimento bersaglio; qui si legano a specifiche proteine e/o a canali di traslocazione presenti sulla membrana del comparto bersaglio in modo da consentire l’inserimento della proteina o all’interno del comparto o alla sua membrana L’IPOTESI DEL SEGNALE In che modo le proteine attraversano le membrane? GLI ESPERIMENTI I mielomi sono tumori maligni dei linfociti B, che secernono immunoglobuline e quindi rappresentano un buon modello per studiare le proteine secrete. 3. Organuli cellulari 27/11/23 Pagina 33 DOTT.SSA CRISTINA NOCELLA In che modo le proteine attraversano le membrane? La traduzione in vitro di mRNA per le catene leggere utilizzando ribosomi liberi comportava la generazione di una proteina di dimensioni maggiori delle catene leggere secrete. Ta traduzione in vitro di mRNA utilizzando ribosomi legati a membrana produceva una proteina delle stesse dimensioni delle catene leggere segrete. Le catene leggere sintetizzate dai ribosomi che rimanevano legati alle vescicole attraverso il reticolo endoplasmatico erano resistenti alla digestione da parte delle proteasi e questo dimostrava che le catene leggere erano trasferite all'interno delle vescicole.  INSERIMENTO DI PROTEINE NELLE MEMBRANE DEL RE Le proteine integrali di membrana attraversano la membrana con regioni alfa-elica di 20-25 aminoacidi idrofobici, che possono essere inserite con diversi orientamenti. Alcune proteine possono attraversare la membrana una sola volta ma il loro inserimento è diverso: con il terminale carbossilico o con il terminale amminico sul versante citosolico. Oppure una proteina può attraversare la membrana con più regioni. INSERIMENTO DI UNA PROTEINE DI MEMBRANA CON UNA SEQUENZA SEGNALE REMOVIBILE: TIPO I La sequenza segnale è tagliata, quando la catena polipeptidica attraversa la membrana, e il terminale amminico esposto nel lume del reticolo endoplasmatico. La traduzione della catena polipeptidica attraverso la membrana è bloccata quando il traslocone riconosce una sequenza transmembrana. Questo fa sì che la proteina esca lateralmente dal traslocone e rimanga ancorata alla membrana del reticolo endoplasmatico. La traduzione prosegue e ne risulta una proteina che attraversa la membrana con il terminale carbossilico sul versante citosolico punto  Il segmento idrofobico più vicino all'estremità N-terminale inizia l'inserimento della catena proteica nascente nella membrana del reticolo con l'estremità N-terminale orientata verso il citosol; man mano che la catena nascente si allunga si sposta attraverso il traslocone fino a quando si forma una seconda alfa-elica idrofobica. Questa elica impedisce agli ulteriore fuoriuscita della catena nascente attraverso il traslocone. La sua funzione e quindi simile a una sequenza di arresto di trasferimento e di ancoraggio di una proteina di tipo I. Dopo la sintesi delle prime due alfa-eliche transmembrana, entrambe le estremità della catena polipeptidica nascente si orientano verso il citosol e l'ansa tra le due estremità sporge nel lume del reticolo. L'estremità c- terminale della catena continua poi ad allungarsi nel citosol fino a quando si forma una terza alfa elica che costituisce un'altra sequenza segnale, mentre la quarta invece sarà una sequenza di arresto e di ancoraggio. La topologia della proteina sulla membrana dipende dalle sequenze topogeniche → sono le sequenze di riconoscimento che determinano l’orientamento sulla membrana Reticolo Endoplasmatico: RER funzione Nel RE le proteine si ripiegano per assumere una struttura 3D funzionale Processo controllato e favorito da appositi chaperon molecolari CONTROLLO QUALITA’ delle proteine  Reticolo Endoplasmatico: RER funzione L’ ubiquitina è una proteina la cui principale funzione è quella di marcare le proteine che devono essere distrutte, un processo noto come proteolisi. Molte molecole di ubiquitina si attaccano alla proteina bersaglio (poliubiquitinazione), che viene trasportata al proteasoma, una struttura a forma di cilindro dove avviene la proteolisi.  3. Organuli cellulari La proteina disolfuro isomerasi è localizzata nel lume del RER e ha per funzione di catalizzare i legami disolfuri. Solo le proteine della via secretiva contengono legami disolfuro e il PDI è localizzato essenzialmente in compartimenti cellulari che sono parte integrante di tale via. L’enzima PDI facilita la formazione del corretto corredo di legami disolfuro durante il folding ex novo di proteine della via secretiva. Esso non determina la via di folding, ma piuttosto accelera la formazione di ponti disolfuro che altrimenti si formerebbero lentamente. La proteina disolfuro isomerasi svolge anche una funzione di correzione dei legami disolfuri non corretti. 1. Il reticolo endoplasmatico è un organello dove sono sintetizzate le proteine ( secretorie o di membrana) 2. Le proteine sono ripiegate in modo corretto grazie alla presenza degli chaperoni molecolari 3. Le proteine mal ripiegate sono translocate nel citoplasma e degradate nel proteasoma.  PERK: pancreatic endoplasmic reticulum kinase 1. La fosforilazione inibisce l'attività di eIF2α e quindi rallenta la traduzione proteica, dando alla cellula più tempo per tentare di ripiegare le proteine già presenti nel lume del RE 2. ATF4 (fattore di trascrizione attivante 4) è selettivamente sovraregolato quando la quantità di eIF2α limitata. L'espressione di ATF4 sovraregola trascrizionalmente CHOP (proteina omologa C/EBP; nota anche come GADD153), che orienta l'ER verso l'omeostasi attraverso l'induzione di un numero di geni correttivi, tra cui XBP1 e chaperon  Sostanze chimiche che inducono stress ER Sostanze chimiche come tunicamicina (è una miscela di antibiotici), tapsigargin (è un inibitore non competitivo della Ca ATPasi del reticolo sarco/endoplasmatico (SERCA), e ditioeritrolo sono solitamente usati per evocare lo stress ER in cellule o animali in coltura per scopi sperimentali 1.Il primo gruppo di fattori di stress ER comprende la inibitori della glicosilazione. La maggior parte delle proteine sintetizzate nel ER sono N-glicosilati e la N-glicosilazione è spesso essenziale per il ripiegamento delle proteine. Quindi, sostanze chimiche che disturbare la N- glicosilazione hanno il potenziale di indurre Stress. 2.Un'altra classe di fattori di stress ER è l’alterazione del metabolismo del Ca2+. La concentrazione di ioni Ca2+ nel ER è mantenuto ad un livello elevato e gli chaperonii ER come BiP richiede ioni Ca2+, sostanze chimiche che perturbano Ca2+ metabolismo nell'ER inducono stress ER. Ionofori Ca2+ come A23187 e l'inibitore della pompa Ca2+, tapsigargin, sono spesso usati per evocare lo stress ER. 3.La terza categoria di fattori di stress ER sono gli agenti riducenti. Poiché il lume del RE è altamente ossidativo, le proteine sintetizzate lì possono formare intermolecolari o legami disolfuro intramolecolari tra la loro cisteina residui. Poichè la formazione di legami disolfuro è importante per il ripiegamento delle proteine secretorie, gli agenti riducenti che interrompono i legami disolfuro evocano stress del ER. Ditiotreitolo e 2-mercaptoetanolo sono spesso utilizzato a tal fine.