Généralités sur les méthodes chromatographiques PDF

# CHAPITRE I : Généralités sur les méthodes chromatographiques ## CHAPITRE 1 ## GENERALITES SUR LES METHODES CHROMATOGRAPHIQUES ### 1- HISTORIQUE - En 1906, un botaniste russe Mikhail Semenovich TSWETT (1872-1919) purifie des pigments végétaux, comme la chlorophylle, sur une colonne de craie. -...

# CHAPITRE I : Généralités sur les méthodes chromatographiques ## CHAPITRE 1 ## GENERALITES SUR LES METHODES CHROMATOGRAPHIQUES ### 1- HISTORIQUE - En 1906, un botaniste russe Mikhail Semenovich TSWETT (1872-1919) purifie des pigments végétaux, comme la chlorophylle, sur une colonne de craie. - Il donne alors à ce phénomène de séparation le nom de chromatographie (du grec khrôma, couleur et graphein, écrire) qu'il définit comme l'enregistrement graphique des couleurs. - On assiste alors à la naissance de la chromatographie. - En 1952, les biochimistes A.J.P Martin et R L M. Synge reçoivent le prix Nobel de chimie pour leur contribution au développement de la chromatographie Moderne. - La chromatographie a connu un essor important durant ces 50 dernières années dont l'origine tient, dans une large mesure, au fait que se trouvent associés une méthode séparative rapide et performante couplée à des détecteurs sensibles et variés. ### 2- INTRODUCTION - L'industrie pharmaceutique utilise de façon intensive la majorité des techniques d'analyses reconnues et cela aussi bien dans les phases de recherche et de mise au point de nouvelles molécules que pour le contrôle qualité des médicaments. - Pour chaque production, des milliers d'analyses sont réalisées quotidiennement et cela lors des principales étapes suivantes : - **Recherche et développement** Pour des analyses à chaque étape de la recherche et développement - **Contrôle qualité des matières premières** Pour l'identification, puis la caractérisation des matières premières avant leur intégration au processus de production: pureté, concentration, teneur en eau, granulométrie, - **Validation du nettoyage** Pour supprimer les risques de contamination d'une production sur la suivante. - **Contrôle qualité des produits finis** Pour la vérification des teneurs, la stabilité, les propriétés physicochimiques des médicaments, - De nombreuses techniques d'analyses sont disponibles à chaque étape dont les: **TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES** ### 3- DEFINITION (International Union of Pure and Applied Chemistry) (IUAPC) - Séparer les constituants d'un mélange liquide ou gazeux - Identifier et quantifier des composés au sein d'échantillons divers. - Les molécules à séparer sont entrainées par un fluide (liquide ou gaz)= **Phase Mobile (PM)** - Les molécules interagissent (ou pas) avec un support fixe (solide ou liquide fixé) = **Phase Stationnaire (PS).** - Elle est utilisée dans de nombreux domaines : chimie, biologie, l'alimentation, la pharmacologie et plus largement dans les différentes disciplines scientifiques. ### 4- PRINCIPE 1. On immobilise dans une colonne un solide finement divisé appelé PS. 2. On place au sommet de cette colonne un petit volume de l'échantillon à séparer. 3. On force cet échantillon à traverser la colonne de haut en bas au moyen de la PM afin d'entraîner ses divers constituants. - Si les composés présents migrent à des vitesses différentes, ils pourront être recueillis séparément, chacun en solution dans la phase mobile. ### 5- LE CHROMATOGRAMME - A chaque séparation correspond un enregistrement appelé CHROMATOGRAMME - Le passage de chaque composé au niveau du détecteur donne un PIC ### 6- LES PICS D'ELUTION GAUSSIENS - Un pic d'élution idéal a le même aspect que la courbe de Gauss. - Pour modéliser le signal on utilise la fonction densité de probabilité: $$y = \frac{1}{2\pi\sigma^2}exp(\frac{-x^2}{2\sigma^2})$$ - **y: représente le signal** - **x: représente le temps** - **Signification des $\bf{3}$ paramètres classiques:** - 1- L'écart type: σ qui correspond à la moitié de la longueur du pic mesuré à 60,6%. - 2- Largeur à mi hauteur: δ = 2,35σ - 3- la base du pic: ω, ω = 4σ, ω = 1,7σ ### 7- LE COEFFICIENT (OU CONSTANTE) DE DISTRIBUTION DE NERNST (K) - Chaque composé est aussi caractérisé par son coefficient de distribution de Nernst (appelé aussi coef de partage ou de partition) défini comme suit: $$K = \frac{C_S}{C_M}$$ - **Cs:** Concentration du soluté dans la phase Stationnaire - **Cm:** Concentration du soluté dans la phase Mobile - **Soluté:** échantillon à analyser - Plus la valeur de K est élevée plus le soluté est retenu - A l'origine de ces phénomènes d'adsorption, il ya des paramètres physiques (taille des particules, porosité...) et des paramètres chimiques (interaction intermoléculaires, liaisons H, Van der Walls...) ### 8- MODELE DES PLATEAUX THEORIQUES - Fictivement, on assimile la colonne à une suite de plateaux sur lesquels s'établit l'équilibre du soluté entre les PS et PM - La colonne est divisée en petits tronçons de longueur H [tels que la concentration de soluté dans la phase mobile qui sort du tronçon est en équilibre avec la concentration du soluté dans la PS du tronçon]. - Plus le nombre de ces tronçons est élevé et plus la séparation sera efficace. - On admet que PM progresse de façon successive d'un plateau à l'autre . Dans chaque on observe une RETENTION du soluté S entre la PM et la PS ### 8-1-Dispersion d'un soluté dans une colonne et traduction sur le chromatogramme (voir fig.3) - *La courbe de gauche correspond à la concentration du composé élué à l'instant t* ### 9- LES GRANDEURS DE RETENTION - **Le temps de rétention tr (déjà vu plus haut) temps entre l'injection et le max du pic.** - **Le temps de rétention dépend** - Du couple soluté-PS en CPG - Du triplet soluté-PS-PM en CL - Du débit de la PM - De la masse de PS dans la colonne - De la température de la colonne - De la longueur de la colonne - **Le temps de rétention ne dépend pas** - De la quantité de soluté injecté - De la nature et de l'abondance des autres constituants - De la nature de la PMen CPG - **Le volume de rétention VR**: volume de phase mobile nécessaire à l'élution du composé : $$VR = TR X D$$ - avec D: débit de la PM - **le volume d'un pic Vpic** $$Vpic = W x D$$ - **Le volume mort Vm**: volume de PM nécessaire à l'élution d'un composé non retenu par la colonne = volume de PM dans la colonne $$Vm = Vo = tm x D = to x D$$ - **Le volume de rétention réduit:** différence entre volume de rétention et volume mort $$VR' = VR-VM$$ - **Le volume de la PS: Vs volume occupé par la PS.** - **Le rapport de phase β:** rapport entre le volume mort et le Volume de la PS (Caractéristique essentielle de toute colonne): $$\beta = Vm/Vs$$ - **Le facteur de rétention ou de capacité k # K** - k = temps passé dans la PS /temps passé dans la PM - k=ts/tm, ts = t'r=tr-tm - k = (tr-tm)/ tm on a donc tr = tm (1+k) - **k est révélateur du comportement de la colonne vis-à-vis du composé. On préfère avoir k faible pour ne pas rallonger la durée de l'analyse.** - **Le facteur de sélectivité α entre deux solutés, il caractérise la séparation de 2 pics** - **α permet de préciser les positions relatives de deux pics adjacents 1 et 2 sur un chromatogramme.** ### 10- INFLUENCE DU PASSAGE DE LA PM SUR LA PS (équation de Van Deemter) - La hauteur d'un plateau théorique H est liée à des paramètres qui dépendent de la vitesse de la PM. - La théorie des plateaux néglige la vitesse de la PM sur la PS. - Cette vitesse a une influence sur la progression du soluté. - Cette influence a été mise en évidence par Van Deemter qui a proposé l'équation cinétique suivante. ### Equation de Van Deemter : $$H = HEPT = A + \frac{B}{u} + Cu $$ - H: Hauteur Equivalente à un plateau théorique - N (H = L/N) grand pour avoir H petit donc meilleure séparation - Unités: H (cm), A (cm), B (cm²/s), C (s) et U (cm/s) ### 13- OPTIMISATION D'UNE CHROMATOGRAPHIE - Optimiser = avoir bonne résolution avec un temps minimum d'analyse - Trois critères sont nécessaires pour bien faire une chromatographie: la résolution, le temps d'analyse et la quantité à injecter. ### 14- CLASSIFICATION DES METHODES CHROMATOGRAPHIQUES - Elles se classent en trois façons: 1. **Classification selon la nature physique des phases** - Selon la nature de la phase mobile on distingue: - la chromatographie en phase liquide (CPL) - la chromatographie en phase gazeuse (CPG) - la chromatographie en phase supercritique (CPS) - Selon la nature de la phase stationnaire on distingue: - la chromatographie liquide/solide (CLS) - la chromatographie liquide/liquide (CLL) - la chromatographie gaz/solide (CGS) - la chromatographie gaz/liquide (CGL) 2. **Classification selon le mécanisme de rétention** - Cette classification repose sur la nature de la phase stationnaire et son interaction avec les molécules à séparer : - la chromatographie d'adsorption, - de partage - d'échange d'ions - d'exclusion - d'affinité. 3. **Classification selon la technique mise en jeu** - Selon la technologie mise en jeu on distingue: la chromatographie sur colonne la chromatographie de surface (chromatographie sur papier ou chromatographie sur couche mince). ### 15- CHOIX DE LA TECHNIQUE - Les différentes techniques sont complémentaires plutôt que concurrentes. Le choix de l'une ou l'autre dépend : - de la nature du soluté : gaz, liquide volatil, liquide peu volatil, solide, macromolécule, espèce organique, polaire, ionique,... - du but de l'analyse : identification, contrôle de pureté, purification de produits (colonnes préparatives), suivi de réaction en continu pour optimiser des paramètres, dosages, quantification...