Hibridación: Fundamentos y Fases PDF

HIBRIDACIÓN Fundamentos, fases ¿EN QUÉ CONSISTE? En la unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos que por complementariedad de B.N. originan una molécula híbrida (bicatenaria). Técnicas de...

HIBRIDACIÓN Fundamentos, fases ¿EN QUÉ CONSISTE? En la unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos que por complementariedad de B.N. originan una molécula híbrida (bicatenaria). Técnicas de hibridación: Permiten detectar secuencias específicas (dianas) mediante el empleo de secuencias DESNATURALIZACIÓN  Tº  Separación de la cadena bicatenaria (ADN)Rotura puentes de H  pH entre BN  Curva de fusión del ADN: Abs a 260nm en función a la TºC  Temperatura de fusión (Tm) Tm -----Tra 50% desnaturalización  Dependiente de la proporción G-C  En moléculas de RENATURALIZACIÓN  Para asociarse Choque aleatorio entre cadenas complementarias Dependiente de la concentración NO dependiente de la proporción de bases  Velocidad de renaturalización Complejidad de molécula (pb y repeticiones)  complejidad -  Cot1/2  complejidad – menos  RENATURALIZACIÓN Esta curva depende de la complejidad del ADN y por tanto, de si el genoma es de un organismo procariota o eucariota. CoT = [ ADN ] x tiempo (s) Concentración de ADN (mol/L) y el tiempo (s) de incubación Complejidad  - + PB (mayor longitud) - Menos secuencias rep C0T1/2 -----CoT 50% renaturalización-----Complejidad del genoma  RENATURALIZACIÓN Esta curva depende de la complejidad del ADN y por tanto, de si el genoma es de un organismo procariota o Eucariotas eucariota.-> escalonada (NO sigmoide) 3 tipos de secuencias - S. altamente repetidas - S. moderadamente repetidas - S. únicas (solo 1 vez) Complejidad  - + PB (mayor longitud) - + Secuencias únicas (- secuencias repetidas) C0T1/2 -----CoT 50% renaturalización-----Complejidad del genoma  FACTORES QUE INFLUYEN EN LA HIBRIDACIÓN Fuerza iónica Agentes de la solución desnaturalizant Carga neta – (fosfatos) es Dimetilsulfóxido (DMSO) y Cationes monovalentes formamida -> neutralizan la carga -> desestabilizan puentes de estabiliza la doble hélice H ->  Tm (repulsión electrostática) ->  Tm % de bases no complementarias = mismatch Una sonda puede unirse tanto a su secuencia diana como a secuencias parecidas a la diana que tengan algunas bases distintas no complementarias. Es decir, se pueden formar híbridos imperfectos que mantienen un  nº de puentes de H que los híbridos perfectos.  DESNATURALIZACIÓN/RENATURALIZACIÓN Disminuye la velocidad cuando la longitud incrementa complementarias  Velocidad < [cat monov]= 0,5 M < infiere en puentes de H Bp no  Ensayo de Hibridación  Objetivo básico: Identificación de una secuencia en una matriz compleja Secuencia diana (target)Cortes con enzimas de restricción No necesario para ARN  Requerimientos Oligonucleótido Secuencia conocida y Sonda (probe) complementaria al target Marcada (isótopos radiactivos, flurocromos, color) Diagnóstico de enfermedades genéticas Detectar mutaciones Estudios de expresión génica Medir niveles de ARNm (genes sobre expres  Utilidades Aplicaciones en virología Diagnostico infecciones -> material genético v Análisis filogenético Comparar secuencias genéticas de  organismo Ensayo de Hibridación PRINCIPIO BASICO  SONDAS SONDAS Isótopos radiactivos Tipo de marcaje ESPECIFICIDAD/ SENSIBILIDAD 32 P, P, 3H, 33 Fluorocromos Capacidad para Probabilidad de Luminol discriminar la detectar secuencia diana cantidades mínimas del híbrido Haptenos sonda/diana Digoxigenina ARN ADN (Mas estables pero sensibles a la contaminación (ARN asas) ADN RECOMBINANTE SINTESIS SÍNTESIS QUÍMICA PCR (Clonación y cultivo) QUÍMICA VENTAJAS Monocatenarias. No requieren Alta sensibilidad Alta especificidad Sensibilidad y especificidad media TRANSCRIPCIÓN desnaturalización (cientos/miles pb) Más rápida que ADN DE ADN Pequeño tamaño ( in recombinante CLONADO situ) ( Tm- 32ºC y Tm-16ºC (max Tm 25ºC) - Condiciones relajadas de HIBRIDACIÓN rigurosidad [cat. monov]  [formamida]  LAVADO POSTHIBRIDACIÓN PREHIBRIDACIÓN Mantener los Tratamientos híbridos previos perfectos y En función de la eliminar los DETECCIÓN DEL técnica híbridos HÍBRIDO imperfectos de la sonda Con tampón en el Marcaje radiactivo que se fijan las condiciones de Fluorocromos rigurosidad Haptenos Condiciones de elevada astringencia/rigurosidad Tº de lavado  [cat. monov]  Concentración de formamida  Rigor de la Hibridación: Astringencia (stringency) Ventajas Desventajas Factores a modular Rigor alto Apareamiento total. Mejora Puede impedir la unión Aumentar temperatura la especificidad estable sonda-diana Aumentar concentración formamida Disminuir concentración salina Rigor bajo Reconocimiento de Apareamientos inespecíficos Disminuir temperatura secuencias homólogas e intramoleculares. Falsos Disminuir concentración formamida positivos Aumentar concentración salina Rigor de la Hibridación: stringency Ventajas Desventajas Factores a modular Rigor alto Apareamiento total. Mejora Puede impedir la unión Aumentar temperatura la especificidad estable sonda-diana Aumentar concentración formamida Disminuir concentración salina Rigor bajo Reconocimiento de Apareamientos inespecíficos Disminuir temperatura secuencias homólogas e intramoleculares. Falsos Disminuir concentración formamida positivos Aumentar concentración salina