Introducción a las Técnicas moleculares PDF

Introducción a las Técnicas moleculares https://www.nagwa.com/fr/lessons/418182371019/ Traducido y modificado por: Aidamalia VARGAS L PhD. En esta lección describiremos el proceso de la maquinaria genética, la hibridación de ADN, y recordaremos algunas aplicaciones de estas tecnologías moleculares...

Introducción a las Técnicas moleculares https://www.nagwa.com/fr/lessons/418182371019/ Traducido y modificado por: Aidamalia VARGAS L PhD. En esta lección describiremos el proceso de la maquinaria genética, la hibridación de ADN, y recordaremos algunas aplicaciones de estas tecnologías moleculares. Objetivos Los estudiantes podrán explicar cómo puede utilizarse la maquinaria genética para producir las secuencias de ADN deseadas, explicar cómo pueden hibridarse las hebras de ADN, describir las ventajas y aplicaciones de la tecnología molecular. Prerrequisito Los estudiantes deben estar familiarizados con el hecho de que el ADN es el material genético de la célula, la estructura básica del ADN, incluidos los nucleótidos y los pares de bases complementarios. Contenido En este folleto aprenderemos acerca el proceso de la maquinaria genética y la hibridación de ADN, y recordaremos algunas aplicaciones de estas tecnologías moleculares. ¡El ADN es una molécula enorme! En humanos, el ADN total es de unos 3.200 millones de pares de nucleótidos, y en chimpancés es de unos 3.100 millones de pares de nucleótidos. ¡Esto puede sorprenderte, pero los humanos comparten el 99% de su ADN con los chimpancés! Esta información la conocemos gracias a las técnicas moleculares. ADN (ácido desoxirribonucleico) El ADN es la molécula que lleva las instrucciones genéticas de la vida. Se compone de dos hebras de nucleótidos que se enrollan uno alrededor del otro para formar una doble hélice. AIDAMALIA VARGAS L. 1 Figura 1. Identidad entre el genoma de los chimpancés y el de los seres humanos. Los cromosomas 2A y 2B del chimpancé fueron unidos para facilitar la representación. Las regiones de alta identidad tienen el mismo color en ambos genomas, a excepción del color blanco que representa segmentos de DNA sin secuencia o similitud alguna. H: Humano; C: Chimpancé. Técnicas moleculares Las técnicas moleculares utilizan diferentes técnicas de laboratorio para estudiar y modificar el ADN, el ARN o las proteínas para diferentes aplicaciones (por ejemplo, medicina, agricultura o medicina forense). *Nota. La identidad puede variar en función de cómo se mida. Si no se contabilizan las reorganizaciones genómicas entre humanos y chimpancés, somos 99% idénticos, pero si se consideran otras variaciones como las repeticiones, la identidad genómica entre ambas especies llega al 96% (Fuente: https://elrincondelcalmecac.wordpress.com/tag/genoma-de- chimpance/). El término «tecnología molecular» es amplio y designa diferentes técnicas de laboratorio para estudiar o modificar el ADN, el ARN o las proteínas. Diferentes tipos de técnicas moleculares están disponibles para ayudar a avanzar en la medicina, la agricultura, la medicina forense y muchos otros campos. Por ejemplo, usted puede recordar que la recombinación del ADN implica la asociación de dos moléculas de ADN fuentes para crear nueva información genética. Es un tipo de tecnología molecular que se puede utilizar para fabricar insulina para tratar la diabetes, insertando el gen de la insulina en bacterias. AIDAMALIA VARGAS L. 2 En esta ficha explicativa, vamos a repasar algunos ejemplos de tecnología molecular, a saber, la bioinformática, la maquinaria genética y la hibridación de ADN. Los humanos comparten el 99% de su ADN con los chimpancés. ¿Cómo lo sabemos? Uno de los métodos para determinar si dos organismos están relacionados es estudiar su morfología, es decir, sus características físicas, y buscar similitudes. La estructura de nuestra Vínculos en evolución Los vínculos evolutivos pueden determinarse comparando las similitudes morfológicas o moleculares entre los organismos. mano se parece más a la de un chimpancé que a la de una rana. A partir de ahí, podemos decir que estamos más estrechamente relacionados con los chimpancés que con las ranas. Además de la morfología, otra forma de estudiar los vínculos evolutivos entre los organismos es estudiar sus similitudes moleculares, lo que se puede hacer comparando secuencias de ADN o proteínas. La bioinformática es una disciplina que combina la biología y la informática, lo que permite analizar enormes cantidades de datos biológicos. ¡Los genomas humanos y chimpancés son extremadamente largos, y compararlos manualmente sería casi imposible! Usando computadoras, podemos alinear estas dos secuencias y ver qué es similar y qué es diferente. Un ejemplo se muestra en la figura a continuación: Figura 2. Alineamiento de secuencias de ADN de genoma humano y chimpancé. Las diferencias se resaltan en rojo. Gen Un gen es un segmento de ADN que contiene la información necesaria para producir una unidad funcional (por ejemplo, una proteína). Es la unidad funcional de la herencia. En el caso de los humanos y los chimpancés, sólo hay alrededor del 1% de diferencia entre nuestras secuencias de ADN. Esto muestra un fuerte vínculo evolutivo entre los chimpancés y nosotros. AIDAMALIA VARGAS L. 3 La bioinformática también puede utilizarse para comparar secuencias de proteínas de organismos. La insulina es una hormona implicada en la regulación del nivel de azúcar en la sangre y que se encuentra en muchos organismos. Recuerde que una proteína es una serie de aminoácidos, cada uno de los cuales puede ser representado por letras. Durante la evolución, el gen de la insulina ha acumulado mutaciones aleatorias que pueden cambiar esta secuencia de aminoácidos. Como puede llevar mucho tiempo, los organismos que están más alejados unos de otros tendrán más diferencias en sus secuencias proteicas. Esto se puede ver en la figura 3, donde hay más diferencias entre la insulina de pollo y la insulina humana que entre la de chimpancé y la humana. Esto sugiere que los humanos y los chimpancés están más cerca que los humanos y los pollos. Figura 3. Alineamiento de secuencias proteicas de un segmento de la insulina de pollo, humano y chimpancé. Las diferencias de las secuencias están resaltadas en rojo. Las letras corresponden a abreviaciones de las letras utilizadas para los aminoácidos. La bioinformática ha permitido conocer más sobre nuestro pasado evolutivo y es un poderoso ejemplo de tecnología molecular. Sin embargo, supongamos que queremos hacer copias del gen de la insulina para estudiarlo en el laboratorio. ¿Cómo podríamos hacerlo? Recuerde que cuando una proteína se produce en una célula, la secuencia de nucleótidos del ADN se transcribe al mRNA, y esta secuencia de mRNA se traduce luego por un ribosoma en una cadena polipeptídica, es decir, en secuencia proteica. Cuando queremos partir de una proteína para sintetizar un gen, podemos usar la tecnología para realizar este proceso en sentido contrario. Definición: Bioinformática La bioinformática es una disciplina que combina la biología y la informática. Se utiliza para analizar datos biológicos grandes y complejos, como secuencias de ADN o aminoácidos. AIDAMALIA VARGAS L. 4  Figura 4. Procesos genéticos de la producción de proteínas. Es posible sintetizar un gen simplemente introduciendo la secuencia de proteínas en un ordenador. Este proceso tiene varias etapas. El primer paso es seleccionar una proteína de interés. En este ejemplo, elegiremos la insulina de pollo, la insulina humana y la del chimpancé. Para ser más simple, centrémonos en una región más pequeña de la secuencia, los 14 aminoácidos que presentan más diferencias. Estas secuencias están resaltadas en amarillo en la figura 5. ARNm (ARN mensajero) El mRNA es un mensaje que se transcribe del ADN de un gen y se puede traducir para producir la proteína correspondiente. Figura 5. Alineamiento de secuencias proteicas de un segmento de la insulina de pollo, humano y chimpancé. Las diferencias de las secuencias están resaltadas en rojo y los segmentos de nuestro interés están en amarillo. El siguiente paso es determinar la secuencia de ADN a partir de la secuencia de la proteína. Quizás recuerden que un grupo de tres nucleótidos del mRNA, llamado codón, se traduce en un solo aminoácido, determinado según el código genético. Por lo tanto, para determinar la secuencia de ADN desde la secuencia de proteínas, primero debemos determinar la secuencia de mRNA. Observe el resultado en la figura 6. AIDAMALIA VARGAS L. 5 Figura 6. Secuencia proteica (negro), secuencia de ARNm (amarillo), secuencia de ADN (verde) correspondiente a un segmento del gen de la insulina de cada uno de los organismos indicados. Ejemplo 1: Vamos a entender los pasos dentro de la síntesis de un gen. Los genes pueden sintetizarse utilizando técnicas bioinformáticas y de laboratorio. ¿Qué hay que determinar antes de poder producir un gen por este método? A. La estructura cuaternaria de la proteína que codifica para el gen B. La localización del gen en el organismo C. Los factores que controlan la expresión del gen D. La secuencia de proteínas que codifican para el gen E. La secuencia de bases nucleotídicas que codifican para la proteína deseada Respuesta: Los genes son segmentos de ADN que pueden codificar para una proteína específica. Para que esto ocurra, primero el gen debe ser transcrito para dar el mRNA, y este mRNA debe entonces ser traducido para dar la proteína. Los grupos de tres nucleótidos en el mRNA, llamados codones, se traducen a aminoácidos individuales según el código genético. La secuencia resultante de aminoácidos puede entonces conformarse para formar una proteína específica, o unirse a otras subunidades para formar la estructura cuaternaria de la proteína. Por lo tanto, para sintetizar un gen, primero se debe determinar la secuencia de las bases de nucleótidos que codifican la proteína deseada. AIDAMALIA VARGAS L. 6 Figura 7. Un esquema de una máquina que sintetiza un gen automáticamente una vez que las secuencias de nucleótidos se introducen en el microprocesador (Fuente: https://biocyclopedia.com/index/genetics/genetic_engineering_and_biotechnology_isolation_sequencing_and_sy nthesis_of_genes/gene_synthesis_machines.php). Ahora que tenemos nuestras secuencias de ADN para esta sección de insulina, en el siguiente paso, podemos introducir esta secuencia en la máquina de genes. La máquina de genes luego sintetiza moléculas cortas de ADN llamadas oligonucleótidos que se pueden utilizar para ensamblar el gen completo. Los oligonucleótidos son trozos cortos de ADN o ARN producidos por síntesis, que generalmente son hebras simples. Pueden tener muchas aplicaciones en la tecnología molecular y, en las máquinas de genes, se pueden vincular para formar el gen entero. Oligonucleótido Los oligonucleótidos son trozos cortos de ADN o ARN producidos por síntesis, que generalmente son hebras simples. Pueden ser utilizados para diferentes aplicaciones en tecnología molecular. AIDAMALIA VARGAS L. 7 El gen entero puede ser ensamblado por una máquina de genes porque los oligonucleótidos se superponen. Un oligonucleótido se ensamblará en la dirección 5` - 3` una vez que la secuencia del gen entra, otro oligonucleótido se unirá en la dirección opuesta. Los oligonucleótidos pueden utilizarse como matriz para la síntesis de ADN mediante una técnica especializada denominada reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Durante esta etapa, se fabrica ADN de doble cadena a partir de los oligonucleótidos de una sola hebra. Ver la figura 8 a continuación. Figura 8. Esquema de la extensión de los oligonucleótidos durante la PCR (rojo) para obtener una molécula de ADN de doble hebra Ejemplo 2: Definición del término «oligonucleótido» En el proceso utilizado por las máquinas de genes se forman oligonucleótidos. ¿Qué es un oligonucleótido? A. Un segmento de ADN de origen natural B. Un segmento de ADN extraído de un genoma por enzimas de restricción C. Una cadena corta de ADN o de ARN producida por síntesis D. Una hebra de ADN formada a partir de una hebra de mRNA, catalizada por la transcriptasa inversa E. Una secuencia de aminoácidos que codifican para el gen deseado Respuesta Una máquina de genes es un equipo de laboratorio que puede ser programado para sintetizar genes de una secuencia de proteínas. Una vez determinada la secuencia de ADN correspondiente, la máquina de genes sintetiza entonces fragmentos cortos de ADN de una sola hebra, llamados oligonucleótidos, que pueden unirse para formar el gen completo. No se requiere ninguna enzima en la producción de oligonucleótidos por la máquina de genes. Los oligonucleótidos tienen muchas aplicaciones en tecnología molecular, y a veces se componen de ARN en lugar de ADN. Por lo tanto, un oligonucleótido es una hebra corta de la DNA o del ARN producida por síntesis. AIDAMALIA VARGAS L. 8 La tecnología básica de las máquinas de genes fue desarrollada por Har Gobind Khorana, quien fue la primera persona en ensamblar un gen sintético en los años 70. ¡Las máquinas de genes pueden usarse para hacer cualquier gen! Pero hay que señalar que les faltan los intrones, o ADN no codificante, que se pueden encontrar en el gen natural. Las máquinas de genes también pueden ser útiles para estudiar el funcionamiento de las proteínas. Por ejemplo, podríamos cambiar un solo nucleótido que cambiaría un aminoácido en el gen de la insulina y examinar el efecto que tiene en la función de la proteína. Ahora, consideremos una propiedad importante del ADN llamada hibridación, que puede ser utilizada en tecnología molecular. El ADN es una molécula de doble hebra que se mantiene mediante enlaces de hidrógeno entre los nucleótidos complementarios de las hebras opuestas, como se muestra en la figura 9. Cuando el ADN se calienta a altas temperaturas (generalmente a 95 oC - 100 oC), los enlaces de hidrógeno que conectan las dos hebras pueden debilitarse y romperse, dando dos hebras simples. El ADN de una hebra es inestable. Cuando se enfría rápidamente (a 5 oC-10 oC), puede combinarse con su cadena complementaria mediante un enlace de hidrógeno, formando de nuevo ADN de doble cadena. Figura 9. Estructura química de la molécula de ADN. AIDAMALIA VARGAS L. 9  Apareamiento de bases El apareamiento es el proceso por el cual dos moléculas complementarias de ADN o de ARN se asocian formando enlaces de hidrógeno. Las fuentes de ambas hebras de ADN no están obligadas a ser las mismas, así que una podría provenir de ADN humano y la otra de ADN de chimpancé. El ARN también puede combinarse con una hebra de ADN simple complementaria. La posibilidad de mezclar el ADN de cadena simple de dos fuentes o de mezclar el ADN y el ARN de cadena simple puede utilizarse para producir moléculas híbridas. Esto se llama hibridación. Hibridación La hibridación es la combinación de dos moléculas complementarias de ADN o ARN de cadena simple, a menudo de dos fuentes diferentes, para formar una molécula híbrida de doble cadena. Ejemplo 3: Comprender la hibridación del ADN El ADN de diferentes fuentes puede combinarse o hibridarse en una serie de pasos. En primer lugar, el ADN de doble cadena se separa en hebras simples. Después de eso, ¿cómo se empareja el ADN de diferentes organismos? A. Una enzima, la ADN ligasa, se utiliza para catalizar la formación de enlaces peptídicos. B. Otra enzima, la DNase, sirve luego para reparar los enlaces covalentes rotos entre las bases. C. La temperatura aumenta rápidamente para aportar la energía necesaria para la formación de enlaces de hidrógeno entre las bases. D. Las hebras son forzadas físicamente hasta que se unen. E. La temperatura se reduce para que puedan formarse enlaces de hidrógeno entre las bases complementarias. Respuesta El ADN es una molécula de doble hebra compuesta de nucleótidos que se asocian entre sí según las reglas de apareamiento de las bases complementarias. Esta combinación se realiza mediante enlaces de hidrógeno que unen las dos hebras de ADN. Estos enlaces de hidrógeno pueden romperse calentando la molécula de ADN a altas temperaturas. Romper los enlaces de hidrógeno, separa las dos hebras simples de ADN. Después del enfriamiento, estas dos hebras pueden formar nuevamente enlaces de hidrógeno entre sus bases complementarias para formar la molécula de doble hebra. Este proceso se llama apareamiento de bases. Podemos unir dos ADN (o ARN) de diferentes AIDAMALIA VARGAS L. 10 fuentes para formar un híbrido. No hay enzimas involucradas en este proceso; solo se necesita calor. Por lo tanto, el ADN de cadena simple de diferentes organismos puede emparejarse después del enfriamiento para que se puedan formar enlaces de hidrógeno entre bases complementarias. A veces, durante la hibridación, las dos secuencias no son completamente complementarias. En este caso, los nucleótidos no complementarios no formarán enlaces de hidrógeno y no se emparejarán. Un gran número de nucleótidos complementarios, y por lo tanto de enlaces de hidrógeno, hace que la interacción entre las dos secuencias sea más fuerte y requiere una temperatura más alta para separarlos. Esta propiedad se puede utilizar para evaluar la similitud de las secuencias de dos moléculas de ADN. Volviendo a nuestro ejemplo de los genes de la insulina del pollo, del hombre y del chimpancé, podemos aplicar esta noción de hibridación para ver hasta qué punto las secuencias son similares. Al calentar el ADN de un segmento del gen de la insulina humana y del pollo, y luego enfriar rápidamente la mezcla, se hibridarán dos hebras de ADN simple. Véase la figura 10. Figura 10. Esquema que muestra la forma en que dos hebras de ADN se hibridan. En este ejemplo, un segmento del ADN de la insulina del pollo (rojo) y del hombre son hibridados. Las líneas (|) indican el apareamiento de las bases gracias a la formación de los puentes de hidrógeno, mientras que las equis (X) indican la ausencia de la formación de los puentes de hidrógeno. El ejemplo anterior muestra cómo el ADN del gen de la insulina humana y el del pollo se hibridan, y lo mismo se puede hacer para el ADN humano y el del chimpancé. Las hibridaciones entre el hombre y el pollo y entre el hombre y el chimpancé se muestran en la figura 11 a continuación. Podemos ver que hay más enlaces de hidrógeno entre el gen de la insulina humana y el del chimpancé que entre el gen humano y el del pollo. Por lo tanto, una temperatura más alta sería necesaria para separar el ADN del hombre y del chimpancé. Este mayor grado de hibridación también indica que la insulina humana está más estrechamente relacionada con la insulina del chimpancé que con la insulina del pollo. AIDAMALIA VARGAS L. 11 Figura 11. Los segmentos del ADN de la insulina del pollo (rojo), del hombre (celeste) y del chimpancé (rosado) son hibridados. Las líneas (|) indican el apareamiento de las bases gracias a la formación de los puentes de hidrógeno, mientras que las equis (X) indican la ausencia de la formación de los puentes de hidrógeno. AIDAMALIA VARGAS L. 12 ¿Cuál de las siguientes propuestas es la hipótesis en la que los científicos basan esta técnica? A. El ADN de dos especies diferentes formará más enlaces de hidrógeno si ambas especies están estrechamente relacionadas. B. El ADN de dos especies diferentes formará menos enlaces de hidrógeno si ambas especies están estrechamente relacionadas. C. El número de enlaces de hidrógeno formados en el ADN híbrido no indica la estrecha relación entre estas especies. Respuesta Durante la evolución, una especie puede sufrir múltiples mutaciones aleatorias en su ADN. Como esto puede llevar mucho tiempo, los científicos suponen que los organismos que están más alejados tendrán más diferencias en su ADN. Por lo tanto, si comparamos la secuencia de ADN de un humano y un pollo (remotamente relacionados) o de un humano y un chimpancé (estrechamente relacionados), veremos más enlace de hidrógeno en el ADN híbrido humano-chimpancé: Por lo tanto, durante la hibridación de ADN, el ADN de dos especies diferentes formará más enlaces de hidrógeno si estas dos especies están estrechamente relacionadas. La hibridación se puede utilizar en diferentes aplicaciones de la tecnología molecular. Un ejemplo es el chip de ADN. Son chips pequeños con varios pocillos que contienen cada uno un oligonucleótido único específico para un gen. Un solo chip de ADN puede tener miles de pocillos y, por lo tanto, se puede utilizar para evaluar miles de genes diferentes. También llamadas microrredes, pueden ser utilizadas para estudiar la expresión génica: ver si diferentes tejidos expresan más ARNm, para un gran número de genes. El ARNm de diversos tejidos se puede marcar con diversos marcadores fluorescentes. Por ejemplo, el ARNm del tejido normal se puede marcar en verde, y el ARNm de un tumor se puede marcar en rojo. Cuando estas muestras se combinan y se cargan en un biopuerto para AIDAMALIA VARGAS L. 13 hibridar, cada pocillo emite fluorescencia en función del número de ARNm verdes o rojos presentes. Así, si el tumor expresa un ARNm particular más que el tejido sano, entonces el pozo para este gen correspondiente será más rojo. Esto se muestra en la figura 12. Figura 12. Esquema del funcionamiento de microarreglos de ADN. Metodología utilizada para determinar la expresión genética. Recapitulemos ahora los puntos clave que hemos abordado en esta ficha explicativa. Puntos claves 1. Las técnicas moleculares utilizan diferentes técnicas de laboratorio para estudiar y modificar el ADN o las proteínas para diferentes aplicaciones. 2. La bioinformática combina la biología con la informática y puede utilizarse para estudiar las relaciones en evolución. 3. Las máquinas genéticas pueden utilizarse para sintetizar la secuencia de ADN de un gen a partir de una secuencia de aminoácidos. 4. Se pueden combinar dos segmentos de ADN mediante calentamiento y enfriamiento para combinar las dos hebras. 5. La hibridación es la combinación de dos moléculas de ARN o ADN de hebra única de dos fuentes diferentes. AIDAMALIA VARGAS L. 14