BIO 1101, Structure de l'ADN et du génome PDF

BIO 1101 Chapitre 1 : La structure de l’ADN 1) Les atomes, liaisons chimiques et molécules Atome :  Veut dire indivisible.  Est la plus petite unité possédant les propriétés d’un élément (chaque élément est constitué d’un type d’atome qui lui est propre)  Constitu...

BIO 1101 Chapitre 1 : La structure de l’ADN 1) Les atomes, liaisons chimiques et molécules Atome :  Veut dire indivisible.  Est la plus petite unité possédant les propriétés d’un élément (chaque élément est constitué d’un type d’atome qui lui est propre)  Constitué de + de 200 particules dont le neutron, le proton (+) et électron (-)  Son noyau est formé à l’aide du neutron et du proton Les électrons bougent rapidement au tour du noyau de l’atome soit environ la même vitesse qu’une année lumière (300 000 km /s) Configuration électronique des 18 premiers éléments Les électrons autour d’un noyau atomique sont organisés en couches ou niveaux d’énergie. Chaque couche correspond à un nombre quantique principal ( n ) (1, 2, 3, etc.). Chaque couche ( n ) est divisée en sous-couches (s, p, d, f). La dernière couche voir le dernier niveau d’énergie, est la couche de valence. La couche de valence :  permet des interactions entre les atomes et des liaisons chimiques  peut avoir maximum 2 ou 8 électrons Utilisez la formule ( 2n^2 ) pour déterminer le nombre maximal d’électrons que la couche peut contenir.  Pour ( n = 1 ) : ( 2 \times 1^2 = 2 ) électrons.  Pour ( n = 2 ) : ( 2 \times 2^2 = 8 ) électrons.  Pour ( n = 3 ) : ( 2 \times 3^2 = 18 ) électrons.  Pour ( n = 4 ) : ( 2 \times 4^2 = 32 ) électrons. Les propriétés d’un atome et sa capacité à faire des liaisons dépendent donc de sa dernière couche : électrons de valence  Pour être stable, l’atome doit compléter sa dernière couche avec 8 électrons (pas le cas pour He et H) en faisant des liaisons chimiques avec d’autres atomes. À l’état électriquement neutre :  Le nombre de protons = au nombre d’électrons pour un atome donné  Ce n’est pas l’équivalent d’être énergétiquement stable (- de mouvement = + de stabilité) La formation d’une liaison chimique entre 2 atomes dégage de l’énergie ( - de mouvement) Briser une liaison, il faut fournir de l’énergie (les 2 atomes retournent à leur mouvement initial) Les liaisons covalentes sont des types de liaisons chimiques où deux atomes partagent des électrons. Elles peuvent être classées en deux catégories principales : Liaisons covalentes non polaires : Dans ce type de liaison, les électrons sont partagés de manière égale entre les atomes. Cela se produit généralement lorsque les atomes impliqués ont des électronégativités similaires. Liaisons covalentes polaires : Ici, les électrons sont partagés de manière inégale entre les atomes, car l’un des atomes a une électronégativité plus élevée que l’autre. Cela crée une distribution inégale de la charge électrique, avec une partie de la molécule légèrement positive et l’autre légèrement négative. Les chaînes carbonées :  Sont formées par des atomes de carbone reliés entre eux par des liaisons covalentes non polaires  Servent de base pour la formation de diverses molécules organiques.  Les atomes de carbone peuvent s’associer entre eux par des liaisons doubles, simples, triples et finissent par former des chaînes parfois longues et rectilignes, ramifiées ou cycliques (Ce sont les squelettes des macromolécules biologiques)  Forment ces squelettes  Peuvent faire des liens avec d’autres molécules (ex : formation de tissus, de groupements fonctionnels) Les diverses propriétés d’une molécule organique dépendent des autres atomes qui s’y lient. Les groupements fonctionnels sont les groupements d’atomes qui participent le plus aux réactions chimiques des molécules organiques. Ils contiennent des liaisons covalentes polaires et ils sont parfois ionisés. Une liaison ionique est un type de liaison chimique où un ou plusieurs électrons sont transférés d’un atome à un autre, créant ainsi des ions de charges opposées qui s’attirent mutuellement12. Quel est l’avantage de posséder des liaisons covalentes polaires, par rapport aux liaisons covalentes non polaires ? Pour l'équilibre énergétique= efficacité= stabilité entre les molécules= bon fonctionnement Les liaisons covalentes polaires peuvent rendre les molécules plus réactives. La différence de charge partielle crée des sites réactifs sur la molécule, facilitant les réactions chimiques2. Une macromolécule :  Structure 3D dont la forme dépend de la séquence  Les différents monomères se lient par des liaisons covalentes  La structure 3D est stabilisée par des liaisons covalentes et non covalente La survie de la cellule dépend des nombreuses interactions entre les molécules qui la composent. En général, elles vont interagir ensemble par des liaisons non covalentes. + les deux molécules s’assemblent bien (la complémentarité), + elles forment des liens non covalents entre elles. . Ce sont des interactions de faible énergie, mais elles peuvent être nombreuses 1956= Création du dogme central 2) La structure de l’ADN Le nucléotide :  Sucre + base azotée + gr. Phosphate  Peut avoir entre 1 à 3 P (mono, di, triphosphate)  Molécule organique Nucléoside :  Sucre + base azotée  Molécule organique La différence entre ADN et ARN réside dans le sucre. Purines :  Incluent deux des bases azotées de l’ADN et de l’ARN : l’adénine (A) et la guanine (G)  Production d’énergie Pyrimidines :  Cytosine et Thymine Uracile remplace la thymine dans l’ARN. La polymérisation d’ADN nécessite un apport en nucléotides (3-p). Mais pourquoi ? Car :  La polymérisation de l’ADN nécessite de l’énergie. Cette énergie est fournie par l’hydrolyse des deux groupes phosphate supplémentaires présents dans les dNTPs (nucléotide). Lorsque ces groupes phosphate sont libérés, ils fournissent l’énergie nécessaire pour la formation de la liaison phosphodiester 2.  Les nucléotides, spécifiquement les désoxyribonucléotides triphosphates (dNTPs), sont les unités de base qui sont ajoutées au brin d’ADN en croissance. Chaque nucléotide fournit un groupe phosphate pour former la liaison  phosphodiester avec le nucléotide précédent, ce qui est crucial pour l’élongation de la chaîne d’ADN1  Les ADN polymérases utilisent les nucléotides pour vérifier et corriger les erreurs pendant la réplication. La complémentarité des bases nucléotidiques permet à l’ADN polymérase de s’assurer que chaque nucléotide ajouté est correct, minimisant ainsi les erreurs dans la séquence d’ADN3 Fonctions des nucléotides :  Les nucléotides sont une source d’énergie chimique via la liaison entre les groupements phosphate facilement hydrolysable. Exemple : ATP  Association avec différents groupements chimiques pour former des coenzymes.  Molécules de signalisation intracellulaire ou second messager. La polymérisation :  L’ADN est un polymère (macromolécule composée de plusieurs monomère) de nucléotides. La polymérisation se fait grâce à la formation du lien phosphodiester qui relie les deux sucres de deux nucléotides différents via le groupement phosphate. La liaison entre le groupe phosphate d’un nucléotide et le sucre d’un autre forme une liaison phosphodiester.  Nécessite une enzyme (polymérase= synthèse des acides nucléique comme ADN et ARN ) et un apport en nucléotides triphosphate Chaque nouveau nucléotide est ajouté sur le carbone 3’(sucre) du nucléotide précédant et une molécule du pyrophosphate est libérée. Le pyrophosphate (PPi) est un composé chimique formé par la condensation de deux molécules de phosphate. Il joue un rôle crucial dans divers processus biochimiques, notamment dans le transfert d’énergie au sein des cellules12. Il est souvent produit lors de l’hydrolyse de l’ATP  La polymérisation se déroule du 5’ vers 3’ (flèche verte ) La charge négative à pH neutre sur le gr. p. confère une charge globale négative à l’ADN une fois la molécule polymérisée. Polymérisation perdu deux phosphates qui va être libéré = charge négative de l'adn Les liaisons phosphodiesters entre les nucléotides assurent la polymérisation de la charpente sucre-phosphate d’un brin d’ADN. Les chaines de nucléotides ont a leurs extrémités un groupe phosphate C5’ et un groupe hydroxyle libre C3’, a partir duquel l’élongation, peut se poursuivre. Comme les sucres sont identiques mais que les bases diffères alors la séquence est identifiée avec les bases du 5’ vers 3’ Adénine – thymine (A-T) : 2 liens H Cytosine- Guanine (C-G) : 3 liens H Les liaisons hydrogènes assurent la formation de la structure secondaire bicaténaire de l’ADN. Liaisons H sont faibles, mais leur grand nombre donne beaucoup de stabilité à l’ensemble. La complémentarité des bases azotées est essentielle à la réplication de l’ADN. c) Les caractéristiques de l’ADN La complémentarité et l’effet antiparallèle Pour former des ponts H entre les nucléotides (leurs bases) : o Il faut avoir un couple compatible: A ne peut lier que T (avec 2 liens H), et G ne peut lier que C (avec 3 liens H) o Même dans les couples compatibles, les liens H ne se forment que si l’orientation des deux nucléotides est antiparallèle (c’est à dire C5’ de l’un en face du C3’ de l’autre). Chaines hélicoïdales Les sillons majeurs et mineurs sont formés à cause de l’angle entre 2 liens glycosidiques d’un couple de nucléotides. 1.3. La dénaturation et l’hybridation Dénaturation: perte de la structure quaternaire, tertiaire ou secondaire présente dans la forme « native» de la molécule. Les nucléotides sont assemblés par des liens covalents phosphodiesters forts Les chaînes antiparallèles sont maintenues ensemble par des liens H faibles Si on chauffe (ou applique un traitement alcalin) une molécule d’ADN double brin(bicaténaire): on brise les liens H et on obtient 2 chaînes à un brin(monocaténaire) ayant leurs liens phosphodiesters intacts = la dénaturation. Lorsque la température redescend, les brins se réassocient selon la complémentarité de leurs bases  l’hybridation (renaturation)= réformation des liens H L’hybridation peut se faire entre les deux brins initiaux OU, avec d’autres molécules monocaténaires d’ADN ou d’ARN ajoutées dans la solution : l’hybridation est possible entre un brin de départ et un brin ajouté. Cette propriété permet de détecter la présence d’une séquence spécifique dans un échantillon. Température d’hybridation : C’est la température à laquelle les brins d’ADN s’apparient. Si la température est trop basse, les brins peuvent s’apparier de manière non spécifique, c’est-à-dire avec des séquences qui ne sont pas parfaitement complémentaires. Si la température est trop élevée, les brins ne s’apparieront pas du tout. Température de dénaturation : C’est la température à laquelle les deux brins d’ADN se séparent. Plus cette température est élevée, plus les liaisons entre les bases complémentaires sont fortes. Spécificité de l’hybride : Cela signifie que les brins d’ADN s’apparient uniquement avec leurs séquences complémentaires exactes. Donc, la phrase signifie que plus la température d’hybridation est élevée (proche de la température de dénaturation), plus l’appariement entre les brins d’ADN sera spécifique. En d’autres termes, à des températures élevées, seuls les brins parfaitement complémentaires s’apparieront, ce qui augmente la spécificité de l’hybridation12 Chapitre 2 : La structure du génome 1) Les protéines a) Structure primaire Les acides aminés (a. a.) sont des modules de construction pour la structure primaire des protéines :  - unis par des liens peptidiques (liaisons covalentes entre le groupe carboxyle d’un a.a. et le groupe amine du suivant). - Une protéine moyenne comporte 1000 a.a., commence par le ‘N’ (le début de la protéine est un gr. Amine) et finit par le ‘C’ (la fin est un gr. Carboxyle). b) Structure secondaire La structure primaire se replie en structures secondaires qui sont les modules de construction de la structure tertiaire. Les structures secondaires se forment spontanément dans l’eau grâce aux liens H au niveau des « cœurs » des acides aminés: l’hélice α(un cylindre ayant les  chaines R à l’extérieur) ou le feuillet β (une surface plane ayant les chaines R en haut et en bas). c) La structure tertiaire La structure tertiaire d’une protéine est un agencement d’hélices et/ou de feuillets. Elle possède les domaines fonctionnels (régions ayant des activités enzymatiques et/ou des sites de liaisons pour d’autres molécules). Un domaine donné se replie toujours de la même façon, peu importe le contexte dans lequel il se trouve. C’est la forme qui détermine la fonction. Un même domaine peut faire partie de plusieurs protéines (exemples : kinase, SH2, SH3) et la fonction de la protéine peut être interprétée par ses domaines. d) Structure quaternaire Certaines protéines (pas toutes) possèdent une structure quaternaire. Il s’agit de l’interaction entre plusieurs chaînes peptidiques pour former une protéine fonctionnelle. La structure primaire = la séquence d’acides aminés La structure secondaire = l’hélice ou le feuillet La structure tertiaire = la protéine repliée correctement La structure quaternaire = plusieurs chaînes protéiques  Les protéines Des séquences spécifiques se replient pour former des structures spécifiques avec des fonctions spécifiques. Les séquences jouent un rôle dans la forme des protéines. 2.2. Les chromosomes et la chromatine L’ensemble de l’ADN génomique d’un organisme est réparti sur un ou plusieurs chromosomes. Les bactéries (procaryotes) possèdent généralement un seul chromosome circulaire o Les eucaryotes possèdent plusieurs chromosomes. Souvent un ensemble de chromosomes différents est présent 2 fois (les organismes diploïdes).  23 pairs de chromosomes chez l’humain. a) Compactage de l’ADN chez les procaryotes Les bactéries ont un génome beaucoup plus petit que les eucaryotes.  o Forme une structure appelée nucléoïde ( région située à l’intérieur des cellules procaryotes, où se trouve la majeure partie du matériel génétique. Le nucléoïde joue un rôle crucial dans la régulation et la réplication de l’ADN procaryote.) o Situé directement dans le cytoplasme. o Des petites protéines aident à l’organisation spatiale de l’ADN, rôle similaire aux histones eucaryotes. Le génome des bactéries est situé dans le nucléoïde, une région du cytoplasme qui n’est pas délimitée par une membrane. Le nucléoïde est dynamique car il peut changer de forme en fonction des besoins et des phases de la cellule.  b) Compactage de l’ADN chez les eucaryotes L’ADN doit être condensé 200 000 fois! L’état de l’ADN dépend à quelle phase du cycle cellulaire se trouve la cellule. Deux niveaux de condensation :  Chromosome mitotique : ADN très condensé  Chromatine : ADN moins condensé Plus condensé ≡ moins accessible pour les protéines de transcription, réplication, réparation et recombinaison À l’interphase (la vie normale d’une cellule) : L’ADN dans le noyau, sous forme de longs filaments appelés la chromatine. À la mitose (division cellulaire) : Le noyau disparait et l’ADN condensé en chromosomes mitotiques. Les protéines représentent la moitié de la masse moléculaire d’un chromosome. Même si la chromatine est dans un état moins condensé que le chromosome, elle diminue l’accessibilité de l’Adn pour les enzymes. La chromatine :  Ensemble d’ADN + protéines associées  Majorité de ses protéines sont des histones (protéines de condensation)  Les protéines non-histones, ont des rôles durant la transcription, réplication, réparation et recombinaison de l’ADN. Deux types de chromatine :  Hétérochromatine : + condensé, - transcrite  Euchromatine : - condensé. + transcrite Passage de l’hétérochromatine à l’euchromatine grâce aux histones. Les histones contrôlent le passage d’une forme à l’autre grâce à des complexes remodelant et une 5 -ème histone (H1). 2.3. Les histones et le nucléosome Le noyau du nucléosome («core») est constitué de 8 histones (octamère). L’ADN s’enroule 1,65 fois autour de chaque noyau et cela représente ~146 pb(«coreADN»).  L’ADN reliant 2 noyaux mesure entre 20 et 60 pb et est appelé intercalaire («linker»). a) Interaction des histones avec l’ADN 1. : Les histones sont des protéines riches en acides aminés basiques comme la lysine et l’arginine, qui sont chargés positivement. L’ADN, quant à lui, est chargé négativement en raison de ses groupes phosphate. Cette attraction électrostatique entre les charges opposées permet à l’ADN de s’enrouler étroitement autour des histones12. b) La composition du nucléosome 2 dimères H2A-H2B et d’un tétramèreH3-H4 pour un total de 8 histones (2 de chaque type).  Les dimères et les tétramères sont des intermédiaires du nucléosome. Ils sont en solution en absence d’ADN disponible. o Les 2 intermédiaires ont une configuration permettant de garder les queues N-terminales à l’extérieur. Le noyau du nucléosome ne peut s’agencer qu’en présence d’ADN. c) L’assemblage du nucléosome Le tétramère H3-H4 se lie à l’ADN en premier plie l’ADN et l’enroule. o Les deux dimères H2A-H2B se joignent ensuite au complexe et le stabilisent. o Chacune des 8 histones du noyau a une longue queue N-terminale qui ressort du nucléosome.  Elles stabilisent davantage l’ADN autour du noyau et permettent des interactions entre les nucléosomes. effet domino, formation de nucléosome= attire d'autres histones a formé d’autres liens d) La position des queues d’histones Stabilité et régulation : L’enroulement de l’ADN autour des histones crée une structure stable qui protège l’ADN des dommages et régule l’accès aux gènes. Les modifications des histones, comme l’acétylation ou la méthylation, peuvent influencer la compaction de la chromatine et, par conséquent, l’accessibilité de l’ADN23. Ces mécanismes permettent à la cellule de compacter efficacement son ADN tout en régulant l’expression génique et en protégeant le matériel génétique. Enroulement de l’ADN : L’ADN s’enroule autour du noyau d’histones, formant environ 1,65 tour autour de l’octamère d’histones. Cet enroulement est nécessaire pour la formation correcte du nucléosome et pour la compaction de l’ADN dans le noyau12. Ces interactions permettent au nucléosome de jouer son rôle dans la compaction de l’ADN et la régulation de l’expression génique. Acétylation : cache la charge ‘+’ sur les lysines des histones et donc il y a une perte d’interaction avec l’ADN chargé ‘-‘ (=perte des liens ioniques) = l’ADN se détache ( car il n’est plus attiré par la charge positive) et donc moins condensé Phosphorylation: le P ajouté sur les sérines et il va neutraliser une charge ‘+’ voisine de la lysine ou d’arginine. Le P peut aussi augmenter l’effet de répulsion de l’ADN (en ajoutant plus de charges ‘-‘). Méthylation et ubiquitination : L’ajout de ces groupements rend l’histone compatible à d’autres protéines (plateforme de recrutement pour les autres; = permettent les changements de configuration de la queue N la rendant complémentaire à d’autres protéines … ou d’autres possibilités avec interaction protéine-protéine). Positionnement du nucléosome Les interactions avec l’ADN sont dynamiques et non spécifiques à des séquences.  L’assemblage d’un nucléosome nécessite une certaine longueur d’ADN, (au moins150 pb: core+linker): assez d’ADN = formation d’un nucléosome par-dessus. Inhibition du positionnement: - des protéines lient l’ADN à des intervalles inférieurs à 150 pb. -ADN facilement accessible car décondensé. Assemblage préférentiel: - des protéines se lient aux nucléosomes existants et aident au recrutement d’autres nucléosomes dans la région 2.4. Les fibre 11 nm et 30 nm a) Euchromatine Nucléosome essentiel au maintien des niveaux de compaction supérieurs. Une cellule eucaryote nécessite une compaction d’ADN d’un facteur de 1000 ou 10 000, l’assemblage en nucléosomes ne permet qu’un facteur de 6. La condensation de l’ADN continue et les étapes suivantes impliquent l’organisation spatiale des nucléosomes construits. Euchromatine : constituée de fibres étendues de 11 nm d’épaisseur.  L’histone H1 interagit avec l’ADN intercalaire (linker) entre les nucléosomes et avec une partie de l’ADN autour du nucléosome : permet effet de resserrer les nucléosomes entre eux et d’enrouler 20 pb de plus. b) Hétérochromatine Les queues-N des histones des nucléosomes adjacents forment de nombreuses interactions : permet aux nucléosomes de se rapprocher davantage: 2 modèles possibles, le solénoïde et le zigzag. Organisation spatiale des nucléosomes= plus de repliement H1 permet plus de compaction. L’hétérochromatine peut s’organiser en boucles (“DNA loops”) de 40-90 kb. Les protéines Sir se lient sur les nucléosomes des fibres 30 nm. Ces protéines sont auto-complémentaires (se lient entre elles).  La fibre 30 nm se plie donc sur elle-même. La base de chaque boucle formée par les protéines Sir, est stabilisée par des agrégats protéiques appelés « nuclear scaffold » (échafaudage nucléaire). Les protéines de l’échafaudage nucléaire: o les topoisomérases II: participent dans le maintien de la structure et s’assurent que les boucles demeurent séparées l’une de l’autre = éviter les nœuds o les protéines SMC ou condensines: pinces auto-complémentaires (les protéines similaires, cohésines, sont impliquées dans l’agencement de 2 chromatides sœurs en 1 chromosome mitotique) =maintenir dans un état condensé c) Le chromosome mitotique Chromosome mitotique = Assure la transmission efficace des gènes aux cellules filles lors de la division: structure stable, taille compacte, protection de l’information. 2.5. Les chromosomes et ADN extra chromosomique a) Le génome Génome ≡ ensemble des informations contenues dans l’ADN dont les séquences sont nécessaires pour coder tous les ARN et toutes les protéines de l’organisme. Le génome est distribué sur 1 ou plusieurs chromosomes. Les fonctions d’un chromosome: o Compacter l’ADN pour qu’il puisse être contenu dans la cellule ou noyau. o Protéger l’ADN ( l’association à des protéines donne plus de stabilité) o Organiser l’ADN(expression génique et recombinaison) o Transmettre l’ADN durant la mitose. b) La ploïdie Ploïdie(n) ≡ nombre de copies de chaque chromosome. Les bactéries ont un seul chromosome haploïde (n) circulaire dans le nucléoïde. Les eucaryotes ont plusieurs chromosomes linéaires dans le noyau. Plusieurs organismes eucaryotes sont diploïdes (2n) au niveau de cellules somatiques et haploïde (n) pour les gamètes. Certaines cellules sont polyploïdes(#n).  Il s’agit d’une amplification globale du génome= une production accrue d’ARN et des protéines. Ex: mégakaryocytes (24n) –les cellules spécialisées dans la production des plaquettes sanguines. d) ADN extra chromosomique Chez les procaryotes : les plasmides sont de petites molécules d’ADN circulaires généralement indépendantes du chromosome et susceptibles d’être transmises d’un individu à un autre. Les plasmides sont capables de réplication autonome et sont non essentiels à la survie de la cellule, mais apporte un avantage à la survie. Deux organites eucaryotes ont leur propre génome: les mitochondries et les chloroplastes. Leurs points communs :  Existent en plusieurs copies par organite,   Réplication indépendante du reste de la cellule  Transmission non mendélienne  Génomes circulaires  Séquences ressemblant aux génomes bactériens. 2.6. Le gène et la densité génique Un gène: un caractère transmissible (héréditaire) porté par l’ADN. Un ensemble de segments d’acides nucléiques contenant l’information nécessaire pour produire un ARN fonctionnel de façon contrôlée (ARNm sont traduits en protéines). Les gènes bactériens: généralement organisés en opérons et donnent des transcrits d’ARN polycistroniques (contenant l’information pour plusieurs protéines). Les gènes eucaryotes: plus longs et discontinus (présence des introns). L’ARNm code pour une seule protéine (avec nuance, les transcrits peuvent être modifiés par l’épissage alternatif) La densité génique: nombre de gènes/ Mb d’ADN Les exons sont les segments d’ADN d’un gène qui codent pour des protéines. Les séquences codantes sont les parties de l’ADN ou de l’ARN qui sont traduites en protéines. Les séquences régulatrices sont des segments d’ADN qui contrôlent l’expression des gènes. Les introns sont des segments d’ADN au sein d’un gène qui ne codent pas pour des protéines. La densité génique (le nombre de gènes par mégabase (Mb) d’ADN) est faible chez les organismes plus complexes : plus grand génome, mais pas plus de gènes. Les introns ≡ portion non-codante d’ADN située dans un gène, transcrite puis éliminée par épissage dans les ARN matures. 2.7. L’accès à l’ADN a) La relation dynamique entre les histones et l’ADN Les protéines liant une séquence spécifique de l’ADN ne peuvent la trouver que si cette section est « déroulée». La chromatine doit être constamment remodelée pour permettre réplication, réparation, transcription... Chapitre 3 : La réplication 3.1. Le Cycle cellulaire eucaryote Le cycle de division cellulaire (CDC) a 4 phases : o La phase S (réplication d’ADN) se situe entre 2 phases « gap » o Les phases G1 et G2. o La phase M (mitose + cytokinèse) Durant le CDC, le noyau subit des changements majeurs ainsi que l’ADN qu’il contient: la disparition-reconstruction du noyau, la réplication et la condensation d’ADN en chromosomes mitotiques, la séparation des chromatides sœurs. Les points de contrôle dépendent des signaux du cycle cellulaire. Les signaux du cycle cellulaire: Cdk (cycline dépendant kinase) et cyclines CDK jouent un rôle crucial dans la régulation du cycle cellulaire Régulation du cycle cellulaire : Les CDK sont essentielles pour contrôler les différentes phases du cycle cellulaire, notamment les transitions entre les phases G1, S, G2 et M1. 1. Association avec les cyclines : Les CDK doivent se lier à des protéines régulatrices appelées cyclines pour être activées. Cette association permet aux CDK de phosphoryler des substrats spécifiques, ce qui est crucial pour la progression du cycle cellulaire1. 2. Rôle dans la transcription et la différenciation cellulaire : En plus de leur rôle dans le cycle cellulaire, certaines CDK sont impliquées dans la régulation de la transcription, le traitement des ARN messagers et la différenciation des cellules nerveuses1. Phosphoryle (active) différentes protéines nécessaires à la réplication d’ADN. 1. La phosphorylation peut activer ou désactiver des enzymes et d’autres protéines, modifiant ainsi leur fonction et leur activité. 2. Elle joue un rôle central dans les voies de signalisation cellulaire, permettant aux cellules de répondre à divers stimuli externes. 3.2. L’ouverture de la double hélice : origine de réplication et hélicase La double hélice d’ADN sert de matrice pour sa propre réplication: les nucléotides d’un “nouveau” brin sont insérés selon la complémentarité des bases avec le “vieux” brin – brin matrice. Il est nécessaire d’ouvrir la double hélice initiale pour rendre accessibles ses 2 brins à la réplication. L’ouverture doit se faire dans les régions spécifiques, appelées origines de réplication (ORI).  Un organisme peut avoir une seule ORI par chromosome (procaryote) ou plusieurs (eucaryote) a) Origine de réplication Chez certains organismes, comme la levure, les ORIs sont des séquences précises (toujours les mêmes) riches en AT. D’autres organismes dont l’humain, ne possèdent pas de séquence consensus (tous les ORI sont différents). Un chromosome peut avoir plusieurs ORIs ce qui réduit le temps nécessaire pour la réplication. Durant la phase S, chaque ORI s’ouvre (séparation du double brin d’ADN) et donne naissance à 2 fourches de réplication où travaillent plusieurs protéines responsables de la réplication. La protéine initiatrice est la seule protéine dans la réplication qui reconnait une séquence spécifique de bases pour se lier à l’ADN. Les autres utilisent plutôt des interactions protéine-protéine et la reconnaissance de la forme générale d’ADN. La protéine initiatrice a 3 fonctions: o trouver et lier l’ORI o recruter d’autres protéines nécessaires à la réplication (formation d’un complexe d’initiation, hélicases) o chez certains organismes (procaryotes) ouvrir la double hélice de l’ORI La protéine initiatrice recrute 2 hélicases (enzymes spécialisées dans l’ouverture d’ADN). Réplicateur : ensemble complet des séquences suffisantes pour permettre l’initiation de la réplication. Origine de réplication: le site spécifique où commencent la séparation des deux brins et la réplication (riche en A:T). L’ORI fait partie du réplicateur. b) Chez les procaryotes  c) Chez les eucaryotes Le complexe de reconnaissance de l’origine de réplication (ORC), un complexe de six protéines o La liaison d’ORC au réplicateur n’aboutit pas à la dénaturation de l’ADN adjacent (contrairement au DnaA). Le passage de la phase G1 vers la phase S est marqué par l’activation des kinases dépendantes de cycline (Cdk).  Niveau élevé de Cdk jusqu’à la fin de la division cellulaire, qui assure le passage du complexe pré-réplicatifs (pré-RC) vers un complexe actif et empêche la formation de nouveau pré-RC au niveau des réplicateurs. 1. La phase G1 est une période de croissance cellulaire et de préparation pour la réplication de l’ADN. La transition vers la phase S, où l’ADN est effectivement répliqué, est marquée par l’activation des kinases dépendantes des cyclines (CDK). Ces enzymes jouent un rôle crucial en phosphorylant des protéines spécifiques pour initier la réplication de l’ADN1. 2. Niveau élevé de CDK : Une fois activées, les CDK restent à un niveau élevé jusqu’à la fin de la division cellulaire. Cela garantit que le complexe pré-réplicatif (pré-RC), qui se forme en G1, se transforme en un complexe réplicatif actif en phase S. Ce processus empêche également la formation de nouveaux complexes  pré-RC, assurant ainsi que chaque segment d’ADN est répliqué une seule fois par cycle cellulaire1. L’importance des CDK dans la régulation précise et ordonnée de la réplication de l’ADN, empêchant toute réplication excessive ou insuffisante. La reconnaissance de l’origine de réplication chez les eucaryotes ne passe pas nécessairement par une séquence spécifiquement reconnue, mais plutôt par des motifs structurels impliquant :  Des séquences riches en AT ou en ilots CpG  Une structure d’ADN particulière  Des régions libres de nucléosomes  Des régions impliquées dans l’initiation de la transcription. Les ORI ne sont pas déclenchées en même temps: Complexification en fonction du développement et des stress. d) Hélicase et topoisomérases Hélicase : enzyme hexamèrique en forme d’anneau qui entoure l’ADN simple brin et se déplace rapidement (1000 nucléotide/sec) le long de la chaîne. Son déplacement nécessite l’hydrolyse d’ATP et entraîne la séparation des brins. Sa forme lui donne une haute processivité= =plusieurs réactions successives sur la même molécule sans s'arrêter(catalyser). Lorsque l’hélicase ouvre la double hélice, les protéines SSB s’attachent sur l’ADN monocaténaire tout en formant des liens entre elles. Les protéines SSB :  Stabilisent les 2 brins séparés de l’ADN matriciel jusqu’à la synthèse des nouveaux brins complémentaires.  Empêchent la formation d’épingles par appariement de nucléotides complémentaires dans le même brin d’ADN. La formation d’épingles bloquerait la réplication. L’hélice d’ADN fait un tour chaque 10 pb. Lorsque l’hélicase travaille, un surenroulement de l’ADN intervient: o L’enroulement supplémentaire d’ADN (“supercoils”) est une source de tension. o Les topoisomérases coupent et ressoudent le double brin pour enlever les supertours. Topoisomérase I : coupe et ressoude un des brins d’ADN Topoisomérase II : coupe et ressoude les deux brins d’ADN À chaque ORI il y a formation d’un “oeil” de réplication par des hélicases qui ouvrent la double hélice d’ADN (devant l’hélicase, se placent les topoisomérases et derrière l’hélicase, se fixent les SSB). Une fourche de réplication à chaque extrémité d’un œil de réplication est le siège de l’élongation des nouveaux brins d’ADN. 3.3. La synthèse d’un nouveau brin : la polymérase et ses particularités La synthèse de l’ADN est catalysée par une enzyme appelée ADN polymérase. L’ADN polymérase a besoin d’une amorce présentant un 3’-OH libre commencer la synthèse d’un brin de novo. La primase (ARN polymérase) est responsable de la synthèse de l’amorce : o Elle ajoute de courtes séquences d’ARN (env. 10 nt) sur le brin matrice. o Ces séquences seront ensuite utilisées comme référence par l’ADN polymérase pour synthétiser le reste du fragment. o Les ribonucléotides de l’amorce seront ensuite remplacés par des désoxyribonucléotides. Une amorce est une courte séquence d’ADN ou d’ARN qui sert de point de départ pour la synthèse d’un nouveau brin d’acide nucléique. Fonction : L’amorce fournit une extrémité 3’-OH libre nécessaire pour que l’ADN polymérase puisse ajouter des nucléotides et synthétiser un nouveau brin d’ADN.  Le terme 3’-OH fait référence à un groupe hydroxyle (-OH) attaché au carbone 3’ d’un sucre dans une molécule d’acide nucléique, comme l’ADN ou l’ARN. L’ADN polymérase synthétise le nouveau brin en ajoutant des desoxynucleosides-3-P complémentaires au brin matrice (dNTP). Ils sont toujours ajoutés à l’extrémité 3’ (OH) d’un nucléotide déjà en place (formation du lien phosphodiester). L’ADN pol a donc besoin d’une amorce. L’ADN polymérase a besoin d’une amorce pour initier la synthèse d’un nouveau brin d’ADN. Voici pourquoi : 1. Point de départ : L’ADN polymérase ne peut pas commencer la synthèse d’un brin d’ADN de novo (à partir de rien). Elle a besoin d’une extrémité 3’-OH libre pour ajouter des nucléotides. L’amorce fournit cette extrémité nécessaire1. 2. Amorce d’ARN : Lors de la réplication de l’ADN, une enzyme appelée primase synthétise une courte séquence d’ARN (l’amorce) qui est complémentaire au brin matrice. Cette amorce sert de point de départ pour l’ADN polymérase1. 3. Stabilité et précision : L’utilisation d’une amorce permet à l’ADN polymérase de commencer la synthèse de manière stable et précise, en s’assurant que les nucléotides sont ajoutés correctement 1.  Besoin d’énergie pour ajouter des nucléotides : o La rupture du lien avec le premier P pour former le lien phosphodiester avec la chaîne naissante o La rupture du lien dans le pyrophosphate libéré par la pyrophosphatase.  Il s’agit d’un processus couplé et le total de l’énergie émise permet une réaction irréversible! Ce passage explique comment l’énergie est utilisée et libérée lors de l’ajout de nucléotides à une chaîne d’ADN en croissance. Voici une explication détaillée : 1. Rupture du lien avec le premier phosphate (P) : Lorsqu’un nucléotide est ajouté à la chaîne d’ADN, il est sous forme de nucléoside triphosphate (comme l’ATP, qui a trois groupes phosphates). La rupture du lien entre le premier phosphate et les deux autres (pyrophosphate) libère de l’énergie. Cette énergie est utilisée pour former une liaison phosphodiester entre le nucléotide entrant et la chaîne d’ADN en croissance1. 2. Rupture du lien dans le pyrophosphate : Le pyrophosphate (les deux phosphates restants) est ensuite hydrolysé par une enzyme appelée pyrophosphatase. Cette hydrolyse libère encore plus d’énergie1. 3. Processus couplé et irréversibilité : Ces deux étapes sont couplées, ce qui signifie qu’elles se produisent ensemble pour fournir suffisamment d’énergie pour rendre la réaction d’ajout de nucléotides irréversible. Cela garantit que la synthèse de l’ADN progresse de manière efficace et sans retour en arrière1. Les ADN polymérases distinguent rNTP et dNTP: Bien que les rNTPs soient présents dans les cellules à des concentrations environ dix fois plus élevées que celles des dNTPs, ils sont incorporés à un taux plus de 1 000 fois plus basse. Cette discrimination est due à l’exclusion stérique des rNTPs du site actif de l’ADN polymérase. Sélectivité cinétique: n’importe quel nouveau nucléotide peut entrer dans l’ADN pol, mais seulement le nucléotide qui arrive à faire un bon appariement avec le nucléotide de la matrice est dans une bonne position pour permettre la catalyse de son P est alors adjacent à 3’-OH. Cette phrase décrit un aspect crucial de la fidélité et de la précision de la synthèse de l’ADN. Voici une explication détaillée : 1. Appariement des nucléotides : Lors de la réplication de l’ADN, chaque nouveau nucléotide doit s’apparier correctement avec le nucléotide complémentaire sur le brin matrice. Par exemple, l’adénine (A) s’apparie avec la thymine (T) et la cytosine © s’apparie avec la guanine (G)1. 2. Position pour la catalyse : Seul le nucléotide qui s’apparie correctement avec le nucléotide de la matrice est positionné de manière optimale pour que l’ADN polymérase puisse catalyser la formation de la liaison phosphodiester. Cette liaison se forme entre le groupe phosphate (P) du nouveau nucléotide et le groupe hydroxyle (3’-OH) du dernier nucléotide du brin en croissance1. 3. Adjacence du groupe phosphate et du 3’-OH : Pour que la réaction de catalyse se produise, le groupe phosphate du nouveau nucléotide doit être adjacent au  groupe 3’-OH du nucléotide précédent. Cette proximité permet la formation de la liaison phosphodiester, allongeant ainsi la chaîne d’ADN1. En résumé, cette phrase souligne l’importance de l’appariement correct des nucléotides pour la précision de la réplication de l’ADN. Seuls les nucléotides correctement appariés sont dans la bonne position pour permettre la formation de la liaison nécessaire à l’élongation du brin d’ADN. La forme de l’ADN pol ressemble à une main qui tient l’ADN avec 3 domaines : o la paume: site catalytique et vérification de l’appariement via le sillon mineur (ralentissement si erreur) o les doigts: plient l’ADN matrice pour exposer 1 nucléotide à la fois et referment la main en cas du “bon” nucléotide dans la paume o le pouce: aide à tout retenir ensemble en s’attachant à la charpente sucre-P (cela joue un rôle dans la processivité de l’enzyme Le site catalytique de la paume est formé d’ions métalliques (Mg2+ et Zn2+) qui permettent: o de favoriser l’interaction entre l’amorce et le nouveau nt en préparant l’O à « l’attaque » o de stabiliser le pyrophosphate produit en neutralisant les charges négatives. Les ions métalliques (Mg²⁺ et Zn²⁺) dans le site catalytique de l’ADN polymérase jouent un rôle crucial en préparant l’atome d’oxygène (O) du groupe hydroxyle (3’-OH) pour l’attaque nucléophile. Cela signifie que l’oxygène est activé pour attaquer le groupe phosphate du nouveau nucléotide entrant, facilitant ainsi la formation de la liaison phosphodiester. En résumé, le “O” dans cette phrase se réfère à l’atome d’oxygène du groupe hydroxyle à l’extrémité 3’ de l’amorce, qui est préparé pour attaquer le groupe phosphate du nouveau nucléotide, permettant ainsi l’élongation de la chaîne d’ADN. Une nucléase est une enzyme qui coupe les acides nucléiques (ADN ou ARN) en séparant les liaisons phosphodiesters entre les nucléotides. Types de nucléases : o Endonucléases : Elles coupent les liaisons phosphodiesters à l’intérieur des chaînes d’ADN ou d’ARN, créant des fragments plus petits1. o Exonucléases : Elles détachent les nucléotides situés aux extrémités des chaînes d’ADN ou d’ARN, en les dégradant progressivement 1. Exonucléases: nucléases qui ne peuvent dégrader l’ADN qu’à partir d’une extrémité Endonucléases: nucléases qui peuvent couper l’ADN en cours de chaîne. Un brin continu et discontinu par fourche: la conséquence d’un besoin en 3’-OH. Brin continu (directeur, brin de tête, précoce, avancé, leading strand) : Brin qui peut être synthétisé en continu par l’ADN polymérase avec 1 amorce. L’ADN pol avance en même temps et dans la même direction que la fourche de réplication. Brin discontinu (brin de queue, tardif, retardé, en retard, lagging strand) :La polymérase se déplace sur le brin matrice 3’ → 5’, s’éloigne de la fourche en synthétisant un court fragment d’ADN = fragment d’Okazaki. Au fur et à mesure que l’oeil de réplication s’agrandit, la synthèse d’un nouveau fragment démarre: plusieurs amorces. 3.4. La coordination des événements Holoenzyme: terme général décrivant un complexe multiprotéique dans lequel une enzyme « noyau » est associée à des partenaires qui renforcent son activité. Les ADN polymérases travaillant sur chacun des brins à polymériser, sont associées entre elles via le complexe de réplication ou réplisome. Le réplisome avance dans le sens de la fourche de réplication, malgré le caractère antiparallèle de l’ADN. La coordination des événements chez E. coli (la mieux étudiée) : 2 ADN polymérases sont liées entre elles et forment un large complexe protéique nommé ADN pol III holoenzyme. Le brin discontinu est plié en boucle pour respecter la lecture de 3’ vers 5’ et la synthèse de 5’ vers 3’. L’holoenzyme + les autres protéines essentielles à la machinerie de réplication = réplisome. a) Le réplisome chez E. coli o réplisome  Chez E. coli, action coordonnée de 2 ou 3 polymérases (selon les modèles) sur le brin continu et le brin discontinu. b) Chez les eucaryotes o Les mêmes fonctions sont remplies par une plus grande variété de protéines et de complexes. o Les modifications post-traductionnelles (Cdk) dépendantes du cycle cellulaire assurent l’assemblage du réplisome.  Les nucléosomes se réassemblent (les anciens) et s’assemblent (les nouveaux) aussitôt que la réplication produit des nouveaux brins. La réplication de l'ADN est semi-conservative. Les « anciens » nucléosomes sont partagés entre 2 nouveaux brins. Les « nouveaux » nucléosomes sont recrutés par le clamp (indique un nouvel ADN) et s’assemblent entre les « vieux » à partir des intermédiaires solubles. La conservation des “anciens” nucléosomes permet de maintenir l’identité de la cellule. Le passage de la machinerie de réplication nécessite un désassemblage partiel des nucléosomes :  Les H3-H4 tétramères restent attachés et transfèrent sur un nouvel ADN après la réplication. Ils sont distribués de manière aléatoire entre les deux chromatides sœurs (mais une distribution conservative a été observée également).  Les dimères H2A-H2B quittent et se réassemblent après la réplication (ls vont revenir de façon aléatoire et vont être en compétition avec de nouveaux dimère (H2A, H2B)). L’ancien” H3-H4 tétramère reste attaché au réplisome et non à l’ADN directement. 3.5. La réplication des extrémités a) Chez les procaryotes Séparation des chromosomes circulaires : Quand la réplication d’un chromosome circulaire est terminée, les deux molécules filles restent liées comme deux maillons d’une chaîne. La séparation est assurée par une ADN topoisomérase de type II. Cette enzyme a la capacité de couper l’ADN db et de passer une deuxième molécule d’ADN db à travers cette coupure. Cette réaction permet de séparer les deux chromosomes et de rendre leur ségrégation possible. c) Chez les eucaryotes Les bouts des chromosomes linéaires : Comme les ADN polymérases ont besoin d’une amorce, l’extrémité 3’ d’un chromosome linéaire ne peut pas être répliqué. La dernière amorce sur le brin discontinu est excisée et la polymérase n’a pas de 3’OH nécessaire pour combler  le vide. Il en résulterait un raccourcissement progressif du chromosome à chaque génération cellulaire (chaque réplication ). La solution réside dans les enzymes télomérases. Elles sont actives dans les cellules souches et dans les cellules germinales. Télomérase = une polymérase qui contient un ARN. Elle utilise sa partie ARN comme matrice pour allonger l’extrémité 3’ des chromosomes : Elle ajoute des nucléotides en 3’ d’un brin en formation. Elle fait des séquences répétitives (télomères) complémentaires à sa propre matrice. Les télomères rallongent le bout 3’ et cet espace sert à faire un autre fragment Okazaki sur le brin 5’. Le bout 3’ qui dépasse est protégé par une protéine ou il fait une boucle pour se « cacher ». Boucle de rétrocontrôle négatif: plus le télomère est long, moins la télomérase est active La T-loop joue un rôle crucial dans la protection des extrémités des chromosomes et la prévention de la réparation inappropriée de l’ADN. Structure protectrice : La T-loop est formée lorsque l’extrémité 3’ simple brin du télomère s’invagine et s’apparie avec une région complémentaire du double brin d’ADN télomérique, créant une boucle. Cette structure masque l’extrémité du chromosome1. Prévention de la reconnaissance comme bris d’ADN : Les extrémités des chromosomes pourraient être confondues avec des cassures double brin par les mécanismes de réparation de l’ADN. La formation de la T-loop cache ces extrémités, empêchant ainsi les enzymes de réparation de les reconnaître comme des dommages à réparer2. Stabilisation par des protéines : Des protéines spécifiques, comme celles du complexe shelterin, se lient aux télomères et stabilisent la T-loop. Ces protéines jouent un rôle clé en empêchant les mécanismes de réparation de l’ADN de traiter les télomères comme des cassures double brin2. En résumé, la T-loop protège les extrémités des chromosomes en les masquant et en empêchant leur reconnaissance par les systèmes de réparation de l’ADN, évitant ainsi des réparations inappropriées qui pourraient entraîner des fusions chromosomiques ou des pertes de matériel génétique. Sans l’action de télomérases, on assiste à un raccourcissement progressif du chromosome à chaque génération cellulaire (vieillissement cellulaire). Les télomérases sont actives dans les cellules souches et dans les cellules germinales. Leur « activité » est programmée et change au fur et à mesure du développement. Ainsi, les cellules souches ont une limite de multiplication, au-delà de laquelle, les télomérases sont désactivées. 3.6. Le séquençage Séquençage : Utilisation des principes (et les enzymes!) de la réplication pour séquencer le génome. Les défis du séquençage: o Savoir « comment » (la méthode Sanger et al., 1977) o Obtenir l’ADN sous forme manipulable, en petits morceaux (banques génomiques) o Capacité de grande échelle (automatisation) o Assembler et annoter les données (bio-informatique) a) La méthode de Sanger 1- Besoin de séquencer seulement 1 brin: dénaturation de l’ADN et le brin gardé devient le brin matrice. (L’ADN est extrait de plusieurs cellules, vous avez donc beaucoup de brins matrices) 2- Production d’1 amorce connue et radiomarquée (on en produit beaucoup) qui va être utilisée tout le long de l’expérience. 3- À partir de la jonction amorce-matrice l’ADN polymérase réplique l’ADN. 4- La réplication est arrêtée avec 1 ddNTP spécifique connu. 5- On recommence les étapes 3 et 4 plusieurs fois, toujours à partir de la même amorce et en arrêtant la réaction avec différents ddNTP. La méthode Sanger est faite pour déterminer la séquence des bases nucléotidiques dans un fragment d’ADN12. Principe de la méthode Sanger 1. Préparation de l’ADN : o L’ADN à séquencer est d’abord dénaturé pour obtenir des brins simples. 2. Réaction de séquençage : o On utilise une enzyme appelée ADN polymérase pour synthétiser de nouveaux brins d’ADN à partir des brins simples. o La réaction de séquençage inclut des nucléotides normaux (dNTPs) et des didésoxyribonucléotides (ddNTPs) marqués par des fluorochromes. Les ddNTPs manquent d’un groupe hydroxyle (-OH) à l’extrémité 3’, ce qui empêche l’ajout de nouveaux nucléotides et termine la chaîne. 3. Électrophorèse sur gel : o Les fragments d’ADN synthétisés sont séparés par électrophorèse sur gel en fonction de leur taille. Chaque fragment se termine par un ddNTP marqué, ce qui permet de déterminer la séquence en lisant les marques fluorescentes. 4. Lecture de la séquence :  o Un détecteur lit les marques fluorescentes et un ordinateur compile les données pour reconstituer la séquence d’ADN. b) Banque génomique Construction d’une banque génomique: o L’ADN est isolé et fragmenté (coupé par des enzymes de restriction). o Les fragments sont insérés dans un vecteur plasmidique. o Les vecteurs sont transformés dans des bactéries (pour les multiplier de façon indépendante, clones). c) Automatisation d) L’assemblage Une fois les fragments du génome ont été séquencés (et on s’assure que tout est là en séquençant 10X plus d’ADN que le génome contient: construction de 10 banques génomiques en utilisant des enzymes de restriction différentes), l’étape suivante est l’assemblage. Durant l’assemblage les séquences superposées permettent de déterminer l’ordre dans lequel les fragments doivent être placés  La présence de régions répétées dans le génome rend le processus difficile. 3.7. PCR La PCR (Réaction de Polymérisation en Chaîne) est utilisée pour produire une grande quantité de copies d’une séquence d’ADN précise, à l’aide d’une ADN polymérase. Cette séquence est délimitée par les amorces utilisées. Le choix des amorces est déterminant! Il faut concevoir deux amorces complémentaires à chaque bout 3’ de la séquence visée. Le nombre de cycles est programmé d’avance selon la quantité de copies d’ADN désirée.  Chaque cycle double la quantité initiale de molécules d’ADN.  Les brins d’ADN nouvellement formés deviennent à leur tour ADN matrice et permettent l’augmentation exponentielle du nombre de produits (amplicons). L’expression “augmentation exponentielle” dans le contexte de la PCR signifie que le nombre de copies d’ADN (amplicons)double à chaque cycle de la réaction. o Au début de la PCR, tu commences avec une petite quantité d’ADN cible. o À chaque cycle de PCR, chaque brin d’ADN est copié, ce qui double le nombre total de brins d’ADN. 2. Cycle de PCR : o Cycle 1 : 1 copie d’ADN devient 2 copies. o Cycle 2 : 2 copies deviennent 4 copies. o Cycle 3 : 4 copies deviennent 8 copies. Cela permet d’obtenir une grande quantité d’ADN à partir d’une petite quantité initiale. Le terme “produits” du PCR fait référence aux molécules finales délimitées par les amorces.  À partir de 5 cycles d’amplification, elles représentent la majorité des molécules synthétisées. Le nombre de produits dépend : o du nombre de cycles (n), o du nombre de molécules initiales d’ADN servant de matrice (x) o de la quantité de réactifs (dNTP, amorces, enzymes).  Dans les conditions optimales: (2n -2n)x. Chapitre 4: La réparation de l’ADN et la transposition 4.1. Le code génétique et les mutations Dans la cellule, les ARNt apportent les acides aminés aux ribosomes. Les ribosomes lisent le message de l’ARNm, qui est écrit en groupes de trois lettres (codons). Chaque codon indique quel acide aminé doit être ajouté à la chaîne. Les ribosomes assemblent les acides aminés dans l’ordre correct, en les attachant avec des liaisons peptidiques pour former une protéine. Génon(1):3 désoxyribonucléotides consécutifs du brin matrice de l’ADN. Il est transcrit en codon. Codon(2): 3 ribonucléotides consécutifs d’une molécule d’ARNm complémentaires à un génon. Anticodon(3): 3 ribonucléotides consécutifs d’ARNt complémentaires à un codon spécifique de l’ARNm. Les séquences sont nommées de 5' vers 3’. Les séquences complémentaires sont antiparallèles.  Les différents types de codons : Codons d’initiation: marquent le début de la lecture de l’ARNm. o Tous: AUG Codons des acides aminés: codent pour les 20 acides aminés Codons de terminaison (STOP): indique la fin de lecture de l’ARNm Pour trouver un cadre de lecture, il faut chercher (sur l’ARNm ou sur l’ADN codant 5’ vers 3’) le premier codon «AUG» (ou «ATG»). À partir de lui, la séquence codante se poursuit, par triplets, sans chevauchement, jusqu’au codon «STOP». Les mutations ≡ tous les changements de la séquence de l’ADN. Les mutations peuvent être néfastes, bénéfiques ou nulles. a) Mutations ponctuelles (modifications simples) Mutations ponctuelles = Substitution de nucléotides= pendant la réplication ex délétion + insertion ( Indels) Insertion = se produit lorsqu’une ou plusieurs bases nucléotidiques sont ajoutées à une séquence d’ADN = modifier la séquence d’acides aminés dans la protéine produite. Délétion = survient lorsqu’une ou plusieurs bases nucléotidiques sont supprimées d’une séquence d’ADN = suppression d’une base peut avoir des conséquences importantes sur la fonction de la protéine. Les substitutions : le remplacement d'un nucléotide. La réplication ( de ADN )suivante assure ensuite d'intégrer la modification de manière permanente sur les deux brins b) Différents effets des mutations Un changement dans la séquence qui code une protéine  une protéine différente dont la forme, l’activité ou l’association à d’autres protéines a été changée. Un changement dans la région régulatrice de l’expression génique ou dans la structure globale de l'ADN. La protéine n’est pas modifiée, mais elle n’est plus produite au moment adéquat ou n’est plus produite du tout. Les séquences non codantes sont importantes dans le génome. À la base du polymorphisme, des allèles, de l'évolution et de certaines maladies. 4.2. Les erreurs durant la réplication: les mutations ponctuelles et les microsatellites a) Les mésappariements Les substitutions : le mésappariement d'un nucléotide. La réplication suivante assure ensuite d'intégrer la modification de manière permanente sur les deux brins. Impliquent les mécanismes de réplication de l'ADN :  une erreur est introduite pendant la réplication et n'est pas réparée.  une modification de la structure chimique d’un nucléotide déjà présent induit une erreur de lecture de la polymérase qui associe la mauvaise base azotée. Deux classes: o La transition d’une pyrimidine à une autre (C à T) ou d’une purine pour une autre (A à G) o La transversion d’une pyrimidine pour une purine (T pour A ou G) ou le contraire. RÉPARATION DES MÉSAPPARIEMENTS La réparation doit identifier l’erreur, identifier le brin qui contient l’erreur, corriger et tout cela très vite, avant la prochaine réplication.  Chez E. coli L’activité exonucléase des polymérases permet d’améliorer la fidélité de réplication d’un facteur 100 et le système de réparation des mésappariements augmente encore cette fidélité par 1000. c) Les microsatellites Les microsatellites sont des motifs de 2 à 10 nucléotides hautement répétés ex: CTTCTTTT … o Selon les séquences, possibilité d’appariement simple brin en ‘épingle’. o Les enzymes de la réplication copient difficilement les microsatellites avec fidélité et effectuent des ‘dérapages’ : Augmentation ou diminution du nombre des répétitions présentes  Polymorphisme. Le système Mut-homologue des eucaryotes détecte les dérapages de polymérase et les corrige.  Sans réparation, certaines pathologies peuvent apparaître. Elles sont associées à l’expansion des triplets répétés à l’intérieur des gènes. 4.3. Les altérations chimiques des bases: “spontanées” et “environnementales” a) Spontanées Plusieurs modifications chimiques des bases surviennent spontanément en présence d’eau et peuvent entraîner des altérations dans la séquence d’ADN.  Altérations spontanées = altérations hydrolytiques. La déamination (perte d’un NH3) 2 cas fréquents: -La cytosine devient uracile(a) - La cytosine-CH3 devient thymine (c)  La méthylation de C est un mécanisme répandu de l’inhibition transcriptionnelle chez les vertébrés  Altération la plus fréquente chez l’humain. Vitesse de déamination de la cytosine = indicateur de la vitesse de la perte d’information génétique. La dépurination (coupure du lien glycosidique reliant purine-sucre)  un site apurique(AP) (b). b) Environnementales Les altérations chimiques peuvent également être provoquées par les facteurs environnementaux: o les substances mutagènes (agents chimiques qui augmentent le taux de mutations) o les radiations. Les mécanismes de mutagènes: o Alkylation: ajout de gr. chimiques sur les bases Résultat: mésappariement/pas d’appariement. Ex: G + CH3= incapacité à faire des liens H o Oxydation: ajout d’un “O” ou perte d’un “H”. Résultat: un mésappariement. Ex: Oxo-G fait un lien avec A.  Une des mutations les plus communes dans le cancer humain. o Analogue de base: une autre molécule remplace une base et l'appariement se fait selon la molécule ajoutée. o Agent intercalant : une molécule s’insère entre les bases (intervient dans réplication/transcription). Les altérations chimiques provoquées par les radiations: o Les rayons UV: la lumière proche de 260 nm (ondes) est fortement absorbée par les bases. Cela cause la fusion photochimique de deux pyrimidines adjacentes sur le même brin (formation d’anneau cyclobutane entre T et T). Ces dimères sont impossibles à apparier et provoquent l’arrêt de la polymérase. o Les radiations ionisantes (rayons γ et X)  directement, en s’attaquant au sucre (désoxyribose) : cassure double brin de l’ADN (DSB),  Indirectement en favorisant l’apparition des radicaux libres (agents oxydants: O2-, H2O2, OH) c) Les systèmes de réparation Inversions directes des altérations: des enzymes spécialisées sont capables de reconnaître directement les bases altérées et de les «corriger». La photolyase (proca et euca): o Reconnaît les dimères de pyrimidine (causés par UV) et se lie sur eux. o Lors de l’exposition suivante à la lumière, elle clive l’anneau de cyclobutane. La méthyltransférase (humain et souris) : o Reconnaît G-CH3 (causé par une alkylation par un mutagène) et catalyse le transfert du CH3 de l’O6- méthylguanine vers une de ses cystéines. o Réaction irréversible, l’enzyme ne peut pas être réutilisée. La Réparation par Excision d’une Base, la voie BER (proca et euca): Les ADN glycosylases parcourent l’ADN et analysent le sillon mineur. Elles peuvent détecter une base altérée et/ou une base qui a été insérée par mésappariement avec une base altérée. Une enzyme spécifique par type d’altération (8 enzymes différentes identifiées chez l’humain). Lorsqu’une base altérée est détectée, la glycosylase lui fait un « flip-out» (la sort de l’autre côté de la charpente) et clive son lien glycosidique. Cela donne un nucléotide apurique ou apyrimidique (AP). L’endonucléase AP/exo enlève l’AP (2 coupures: endo en 5’ et exo en 3’). L’ADN polymérase et l’ADN ligase peuvent ensuite réparer la brèche (besoin d’un brin intact comme matrice). La réparation par excision d’un fragment d’ADNsb, la voie NER (proca et euca): Même mécanisme chez les eucaryotes, mais avec 25 protéines différentes. Si ces protéines sont elles-mêmes mutées, le cancer de la peau se développe (UV!). La réparation translésionnelle ( proca+ euca): - Dernier recoure - Durant la réplication, lorsque la progression de la polymérase normale est bloquée par une altération non réparée, l’ADN polymérase translésionnelle réplique l’ADN sans respecter les appariements  Utilise la matrice que pour s’attacher (un processus forcément mutagène, mais mieux qu’une réplication incomplète du chromosome). Certaines polymérases translésionnelles sont spécifiques à un type d’altération et répliquent l’ADN correctement.  Exemple : Reconnaitre les dimères T*T et ajoute AA en face. Chez E. coli cette polymérase n’est pas présente tout le temps. Elle est synthétisée seulement lorsque la bactérie subit TROP de mutations (partie de la réponse SOS). 4.4. La cassure bicaténaire d’ADN Les coupures db ne peuvent pas être réparées en utilisant un brin comme matrice. La réparation peut se faire via : o Le mécanisme de la recombinaison homologue (HR) o La ligature directe des extrémités non homologues. Ligature directe des extrémités non homologues: un mécanisme présent durant tout le cycle cellulaire. Il aboutit souvent à la perte d’un fragment du chromosome (processus mutagène). La ligation directe est un processus de réparation de l’ADN où les extrémités cassées de l’ADN sont directement reliées sans l’utilisation d’une séquence homologue. Ce mécanisme est souvent utilisé dans la voie de réparation par jonction d’extrémités non homologues (NHEJ), où les extrémités de l’ADN sont simplement alignées et reliées par une enzyme appelée ligase. Ce processus est rapide et efficace, mais il peut être sujet à des erreurs, car il ne nécessite pas de séquence homologue pour guider la réparation, ce qui peut entraîner des insertions ou des délétions. La voie NHEJ est impliquée dans la production des anticorps. Intermédiaires entre les voies HR et NHEJ: o SSA (non conservative single- strand annealing) o alt-NHEJ (alternative-NHEJ) Les voies de réparation de l’ADN HR (recombinaison homologue) et NHEJ (jonction d’extrémités non homologues) sont cruciales pour réparer les cassures double brin (CDB) de l’ADN. Entre ces deux voies principales, il existe des mécanismes intermédiaires comme la SSA et l’alt-NHEJ. SSA (Single-Strand Annealing) La SSA (Single-Strand Annealing) est une voie de réparation non conservative. Elle utilise des séquences homologues répétées flanquant une cassure db pour joindre les extrémités de l’ADN1. Ce processus est considéré comme non conservatif car il entraîne la perte des fragments d’ADN situés entre les séquences répétées, ce qui peut conduire à des délétions1. La SSA est souvent impliquée dans les délétions observées dans les cellules cancéreuses1. alt-NHEJ (Alternative Non-Homologous End Joining) L’alt-NHEJ (Alternative Non-Homologous End Joining), également connue sous le nom de MMEJ (Microhomology-Mediated End Joining), est une voie de réparation alternative à la NHEJ classique23. Contrairement à la NHEJ classique, l’alt-NHEJ utilise de courtes séquences homologues pour aligner les extrémités de l’ADN avant de les liguer2. Cette voie est plus sujette aux erreurs et peut entraîner des insertions ou des délétions, contribuant ainsi à l’instabilité génomique3. 4.5. La transposition La recombinaison génétique : permet un échange génétique et/ou un réarrangement chromosomique. o Recombinaison homologue (“crossing over”): un échange d’ADN entre deux chromosomes de la même paire, l’ordre des gènes est conservé:  Réparation de la cassure bicaténaire: entre 2 chromatides sœurs.  Méiose : entre 2 chromosomes homologues (1 maternel et 1 paternel)  Transposition: un réarrangement d’ADN par le déplacement d’un segment, l’ordre des gènes peut changer (non homologue). Les transposons peuvent être : o Réplicatifs, ils se dupliquent, une copie est laissée derrière et la nouvelle copie s’intègre à une autre place dans le génome. o Non réplicatifs, une seule copie voyage dans le génome). 3 classes principales de transposons o Transposons ADN (non réplicatifs) o Rétrotransposons viraux (avec LTR) o Rétrotransposons non viraux (poly-A) Les Rétrotransposons viraux (avec LTR) et les Rétrotransposons non viraux (poly-A) sont des intermédiaires de l’ARN car ils utilisent l’ARN comme intermédiaire pour se déplacer dans le génome. 1. Les rétrotransposons se déplacent via un mécanisme appelé “copier- coller”. Ils transcrivent leur ADN en ARN, puis cet ARN est rétro-transcrit en ADN complémentaire ( ADN c) par une enzyme appelée transcriptase inverse. 2. Leur ARN est rétro-transcrit en ADN, ce qui permet leur intégration à un nouveau site dans le génome. Diversité et Adaptabilité : L’utilisation de l’ARN comme intermédiaire permet aux rétrotransposons de générer des copies multiples et de se disperser largement dans le génome, augmentant ainsi leur diversité et leur capacité d’adaptation. Deux catégories majeures : -Type I, ou rétroéléments, dont la mobilisation fait intervenir un intermédiaire ARN -Type II, ou transposons à ADN, qui utilisent un intermédiaire ADN pour leur transposition. a) Transposons à ADN La transposase est une enzyme essentielle qui facilite le déplacement des éléments transposables, ou transposons, au sein du génome. Voici quelques points clés sur la transposase : 1. Fonction : La transposase catalyse la coupure et la réintégration des transposons à différents endroits du génome. Elle se lie aux extrémités du transposon, coupe l’ADN à ces points, et insère le transposon à une nouvelle position. 2. Mécanisme : Ce processus de “copier-coller” permet aux transposons de se déplacer, ce qui peut entraîner des mutations, des réarrangements génomiques, et contribuer à la diversité génétique. La partie centrale du transposon code pour une transposase o Autres gènes: régulation de la transposition, fonctions utiles pour la transposition ou pour l’organisme. o Aux extrémités :  2 sites de recombinaison : 2 répétitions inversées TIR ayant un site de reconnaissance pour la transposase.  2 répétitions directes (DRs, “target site duplications”): produits durant la transposition  b) Les rétrotransposons viraux Les rétrotransposons avec LTR : LTR : Longues répétitions terminales Fonction : Les LTR jouent un rôle crucial dans le processus de transposition. Elles contiennent des séquences régulatrices nécessaires pour l’initiation de la transcription de l’ADN en ARN1.  Les rétrotransposons avec LTR (Long Terminal Repeats) ont une structure complexe et spécifique. Voici les principaux éléments de leur composition : 1. LTR (Long Terminal Repeats) : Ce sont des séquences répétées situées aux deux extrémités du rétrotransposon. Elles jouent un rôle crucial dans la régulation de la transcription et l’intégration du rétrotransposon dans le génome1. 2. Régions U3, R et U5 : Les LTR sont subdivisées en trois régions : o U3 o R o U5 3. Gènes codants : Les rétrotransposons LTR contiennent généralement des gènes codant pour des protéines essentielles à leur cycle de vie, notamment : o GAG : Code pour des protéines structurales. o POL : Code pour des enzymes comme la transcriptase inverse, l’intégrase et la protéase Mécanisme de Transposition : Les rétrotransposons LTR utilisent un mécanisme similaire à celui des rétrovirus. Ils transcrivent leur ADN en ARN, puis cet ARN est rétro-transcrit en ADN complémentaire (ADNc) par une transcriptase inverse, avant d’être intégré à un nouveau site dans le génome. 2 LTR –“long terminal repeat” (sites de recombinaison) avec des segments fonctionnellement distincts. U3 (unique 3’, contient un promoteur), R permettant les “sauts” d’amorces (R -repeat) et U5. c) Les rétrotransposons poly-A (non viraux) Génome humain : transposons “LINE” (Longs éléments nucléaires intercalés) Mécanisme de Transposition : Comme les rétrotransposons LTR, les rétrotransposons sans LTR transcrivent leur ADN en ARN, puis rétro- transcrivent cet ARN en ADN complémentaire (ADNc) grâce à une transcriptase inverse. Cependant, ils n’ont pas les séquences LTR pour faciliter ce processus. Les LINEs contiennent tout le matériel génétique nécessaire à la production de leurs enzymes de rétrotransposition Les SINEs ne codent aucune enzyme. Ces derniers parasitent en fait la machinerie des LINEs = besoins de enzymes des LINES pour faire la transposition. d) Impacts sur le génome La transposition est la source majeure de mutations, et près de la moitié du génome humain est composée de séquences dérivées d’éléments transposables Les génomes des organismes complexes contiennent beaucoup de transposons ou éléments similaires (quantité variable selon organisme).  Leur persistance (et augmentation) au sein du génome, indique une sélection favorable pour l’évolution. Durant l’intégration des transposons dans l’ADN génomique: o Ils peuvent interrompre les gènes (ex. maïs) ou les régions régulatrices des gènes. o Ils peuvent devenir des introns o Ils peuvent entrainer le déplacement d’autres éléments génomiques (a et b). Les transposons sont une source importante de mutations. L’insertion de l’élément transposable Alu représente ≈ 0.1% de toutes les maladies génétiques humaines. La recombinaison homologue non-allélique ou enjambement inégal : Les transposons peuvent également participer lors la recombinaison homologue de la méiose ou de la réparation de type HR. Le mécanisme de la recombinaison homologue est guidé par les gènes ayant les mêmes séquences. Mais, la présence de séquences similaires ou identiques à plusieurs endroits sur le génome augmente les risques de recombinaison entre des chromosomes non homologues (non-allélique) ou un enjambement inégal sur le même chromosome avec des sections mal appariées d’un gène., ce qui résulte en des duplications ou des délétions importantes. La recombinaison homologue non-allélique : La recombinaison se fait entre 2 régions d’ADN n’ayant pas les mêmes gènes (peut-être même 2 chromosomes de type différents), mais qui ont les mêmes transposons. 4.6. Les enzymes de restriction Les enzymes de restriction= Ciseaux moléculaires Pour étudier un gène particulier ou un segment défini d’un ADN chromosomique, la longue molécule d’ADN doit d’abord être coupée en fragments d’une taille exploitable.  endonucléases de restriction. Ces enzymes (endonucléases de restriction) sont capables de reconnaître une séquence spécifique d’ADN, site de restriction, et de la cliver (coupure db) Les enzymes de restriction proviennent des bactéries qui les utilisent pour éliminer (restreindre) tout ADN étranger.  Leur ADN est protégé par la méthylation (ajout du CH3 par une méthylase) sur les sites de restriction.  Un site de restriction est spécifique à une enzyme donnée. Les sites de restriction: Composés de 4 à 8 nucléotides et la plupart sont des palindromes (lecture de gauche a droite ou de droite a gauche) La coupure produite par les enzymes de restriction est double brin et peut être de 2 types: franche ou cohésive. Les enzymes de restriction découpent le génome, mais elles sont également utiles pour souder 2 séquences d’ADN ensemble… Les coupures cohésives produisent des extrémités libres compatibles entre elles et cela facilite leur soudure (stabilisation des fragments par les liens H augmente l’efficacité de la ligation 100X). Deux possibilités pour souder deux molécules d’ADN (A et B) ensemble : 1) Utiliser la même enzyme de restriction sur chaque molécule. Lors de la soudure, le site de restriction est reproduit. 2) Utiliser 2 enzymes différentes, qui produisent des extrémités compatibles. Lors de la soudure, le site de restriction n’est pas reproduit. Les extrémités cohésives assurent aussi un clonage directionnel: l’incorporation du fragment doit suivre les règles d’appariements des nucléotides et est possible dans une direction seulement. La ligation de coupures : Les ligases sont utilisées pour catalyser l’insertion de fragments (coupés par les enzymes de restriction) à l’intérieur d’un vecteur (ex. plasmide). Elles forment les liaisons phosphodiesters entre les nucléotides. Visualisation des fragments de restriction: o Séparation des fragments par électrophorèse. o Migration de l’ADN dans un gel d’agarose, qui agit comme un tamis moléculaire o Séparation des fragments selon la longueur : Plus les molécules d’ADN sont longues, plus elles migrent lentement.  Une bande = fragments de même longueur. La distance parcourue par la molécule d’ADN est inversement proportionnelle à sa longueur. Pour visualiser l’ADN sur le gel, on utilise des composés tel le bromure d’éthidium, capable de s’intercaler entre les bases de la double hélice. Lorsqu’il est exposé à des UV, il devient fluorescent. Cartographie de restriction: Un ADN coupé par une enzyme de restriction donne toujours les mêmes fragments de restriction ( sauf si mutation au niveau du site de restriction). Cartographie des plasmides : Il est important de faire le lien entre le nombre de sites de restriction et le nombre de fragments produits. Édition du génome via les mécanismes de réparation de l'ADN (CRSPR-Cas9) CRISPR-Cas9 : Ce système utilise une protéine appelée Cas9 et un ARN guide (ARNg) pour cibler et couper une séquence spécifique de l’ADN. L’ARN guide est conçu pour correspondre à la séquence d’ADN cible, et la Cas9 agit comme des ciseaux moléculaires pour effectuer la coupure. 1. Identification de la séquence cible : Tout d’abord, une séquence spécifique d’ADN à modifier est identifiée. Cette séquence est ciblée par un ARN guide (ARNg) conçu pour être complémentaire à la séquence d’ADN cible. 2. Complexe CRISPR-Cas9 : L’ARN guide se lie à une protéine appelée Cas9. Ce complexe ARN-Cas9 se dirige vers la séquence d’ADN cible grâce à la complémentarité entre l’ARN guide et l’ADN. 3. Coupure de l’ADN : Une fois à la séquence cible, la protéine Cas9 coupe les deux brins de l’ADN, créant une cassure double brin1. 4. Réparation de l’ADN : La cellule détecte cette cassure et active ses mécanismes de réparation de l’ADN.