Resumo de genética médica PDF

Genética Médica Estrutura do DNA DNA - Molécula que contém o material hereditário responsável pelo desenvolvimento, funcionamento e reprodução dos organismos. A sua principal função é armazenar informação genética necessária para a produção de proteínas (genes codificantes). Dupla hélice do ácido...

Genética Médica Estrutura do DNA DNA - Molécula que contém o material hereditário responsável pelo desenvolvimento, funcionamento e reprodução dos organismos. A sua principal função é armazenar informação genética necessária para a produção de proteínas (genes codificantes). Dupla hélice do ácido desoxirribonucleico - 2 cadeias polinucleotídicas dispostas em sentidos inversos (cadeias antiparalelas), enroladas em torno de 1 eixo imaginário. As cadeias estão unidas por pontes de H entre pares de bases azotadas. Major and minor grooves (voltas) - São importantes na ligação de proteínas envolvidas na replicação e transcrição do DNA. Então, o DNA é composto por: 1) Bases nitrogenadas (A, T, C e G) 2) Desoxirribose - açúcar c/ moléculas formadas por 5 átomos de C 3) Grupo fosfato - liga-se ao grupo hidroxilo do carbono 5’ de um açúcar, e ao grupo hidroxilo do carbono 3’ do nucleótido seguinte, formando uma ligação fosfodiéster 5’-3’. Nota: PURGA - bases púricas, ie, adenina e guanina (e as outras - bases pirimídicas) T - facilmente oxidável, está protegida do O2 no núcleo; U - é resistente à oxidação, fora do núcleo. DNA e cromossomas (cr) A dupla hélice do DNA está enrolada à volta de proteínas alcalinas (histonas) q organizam o DNA numa estrutura compacta (cromatina), q condensada forma o cr. Nas cél eucarióticas, os cr encontram-se no núcleo (genoma nuclear). As mitocôndrias tb têm DNA (genoma mitocondrial). Genoma - todo o material genético existente num organismo, que fornece toda a info necessária para a vida. Genes - unidades de info funcional, codificadas por determinada sequência de DNA. Genética de populações - foca-se no estudo das variações genéticas que ocorrem no genoma, permitindo a evolução. Genoma nuclear A cromatina existe em 2 formas - eucromatina (menos condensada e pode ser transcrita) e heterocromatina (altamente compactada e normalmente n é transcrita). 1 Nucleossoma - unidade básica da cromatina Cada cr tem 1 centrómero q o divide em 2 braços (braço curto - ‘p’ e braço longo - ‘q’). No final de cada braço temos o telómero - região de sequências repetitivas de DNA q protegem o final do cr; cada vez que 1 célula se divide, os telómeros tornam-se + curtos, e acabam por chegar a um ponto em q a célula já não se consegue dividir e morre. Cariótipo - conjunto dos cr de uma espécie/indivíduo. Autossomas - têm genes para características q não estão relacionadas c/ o sexo biológico (22 pares); estão numerados de acordo c/ o tamanho, 1 maior e 22 menores. Cromossomas sexuais - X e Y determinam o sexo biológico; Y contém o gene SRY q determina o sexo masculino. Metacêntrico: centrómero na região central do cr. Submetacêntrico: centrómero um pouco afastado do centro. Acrocêntrico: centrómero próximo de 1 dos pólos. Telocêntrico: centrómero localizado num dos pólos (ausente em humanos). Mapeamento citogenético Método de coloração para identificar regiões específicas no cromossoma; cada cr tem um padrão de bandas distinto (G - corante Giemsa), coradas de acordo com a sua condensação, e cada banda é numerada de modo a identificar essa região. Ex: O gene da hemoglobina (HBB) encontra-se no cromossoma 11p15.4 - significa que HBB está no braço curto p, na banda 15.4 A Hibridação in situ por fluorescência (FISH) - utiliza sondas fluorescentes de DNA, complementares a determinadas regiões cromossómicas. Genoma mitocondrial As mitocôndrias (tiveram origem na endocitose de cél procarióticas) são organelos que produzem adenosina trifosfato (ATP), que é a maior fonte de energia das células.  O DNA mitocondrial (mtDNA) é semelhante ao nuclear, constituído por dupla cadeia e codificante, é circular, e tem +- 17 000 bp;  Contém 37 genes q codificam para 13 proteínas, 22 tRNAs e 2 rRNAs; Os 13 genes codificantes para proteínas produzem subunidades do sistema de fosforilação oxidativa - produção de ATP;  Não contém histonas, os genes codificantes não têm intrões, e as regiões intergénicas são limitadas; 2  Não consegue produzir todas as proteínas para funcionar independentemente, necessita de proteínas importadas do núcleo.  Tem herança materna, contudo, estudos recentes sugerem herança biparental em algumas circunstâncias;  É constituído por 2 cadeias - pesada (H), rica em guanina, e leve (L), rica em citosina;  Control region - região não codificante (NCR) - contém elementos necessários à replicação e transcrição do mtDNA. Replicação do DNA Ocorre na interfase e é composta por 3 fases (iniciação, elongamento e terminação). A interfase é parte do ciclo celular e é composta pelas fases G1 (crescimento celular), S (duplicação do DNA) e G2 (continuação do crescimento celular - verificação de erros). Iniciação A replicação tem início na origem de replicação (OR), situada em localizações específicas nos cr. Nos humanos, não parece existir uma sequência consensus para as OR, sendo que as proteínas iniciadoras da replicação identificam e ligam-se a modificações específicas nos nucleossomas. Complexo de pré-replicação (pré-rc)  Antes da fase S, o pré-RC reconhece e organiza-se nas OR durante o final da mitose e início de G1.  Existem cerca de 2.5 x 104 OR em células de metazoas, permitindo que múltiplos locais iniciem a replicação de genomas complexos.  As OR são reconhecidas pelo complexo de proteínas de reconhecimento de origem (ORC). Segue-se a ativação de outras proteínas de iniciação como RPA (fator de replicação A), RFC (complexo de fator de replicação C), PCNA (proliferating cell nuclear antigen), …, na fase S. 1) As enzimas DNA topoiosomerase catalizam alterações no estado topológico do DNA, controlando o superenrolamento da molécula de DNA. 2) A enzima helicase quebra as ligações de H entre a dupla cadeia de DNA. 3) Pequenas moléculas designadas por single-stranded binding proteins (SSB) ligam -se às cadeias simples de DNA para impedir que se voltem a formar as pontes de hidrogénio. 3 Elongamento A configuração da molécula de DNA é altamente estável, permitindo q sirva de “molde” para a replicação de novas moléculas de DNA - replicação semiconservativa. 4) A enzima primase sintetiza oligonucleótidos de vida curta (primer de RNA) que se ligam a cada cadeia. 5) Depois do primer estar no lugar, a DNA polimerase envolve cada cadeia, e liga novos nucleótidos complementares às bases livres - nenhuma DNA polimerase conhecida é capaz de iniciar por si só a síntese de polinucleótidos. 6) A DNA polimerase apenas consegue adicionar nucleótidos à posição 3’ da cadeia original → uma das cadeias é lida na direção 3 ’ – 5’, e a nova cadeia é formada no sentido 5 ’ – 3 ’ (leading strand). 7) A outra cadeia (lagging strand ) está na direção 5 ’ – 3’, no entanto a DNA polimerase não consegue adicionar nucleótidos à posição 5 ’ ; assim, os primers de RNA são continuamente adicionados e a síntese de DNA ocorre em fragmentos (fragmentos de Okazaki – 100 - 200 nt), na direção 5 ’ – 3’, tal como a leading strand. 8) A enzima DNA ligase liga os fragmentos de Okazaki para formar uma cadeia única. Na replication fork de eucariotas, existem 3 complexos distintos de polimerases que contribuem para a replicação de DNA: Polimerase α - associada à RNA primase e este complexo sintetiza um primer. Ocorre na iniciação da replicação para iniciar a síntese da leading strand, e tb no final 5’ de cada fragmento de Okazaki na lagging strand. A Pol α não é capaz de continuar a replicação de DNA sendo substituída pela Polimerase ε (delta) para a replicação da leading strand e Polimerase δ (epsilon) para gerar fragmentos de Okazaki durante a síntese da lagging strand.  2 replication forks são formadas na OR, extendendo-se em ambas as direções, formando a bolha de replicação.  Existem múltiplas OR nos cr eucariotas, q permitem q a replicação ocorra simultaneamente em vários locais de cada cromossoma. 4 Terminação As replication forks progridem numa maneira bidirecional até o complexo de replicação encontrar um sinal de terminação, q ocorre qd 2 replication fork convergem. Deteção de erros durante a replicação Falhas nos processos de replicação e segregação podem causar mutações e rearranjos cromossomais, causando doenças ou mm a morte. Mecanismos de deteção e reparação de erros asseguram a (quase) perfeita fidelidade da replicação do DNA. O 1º mecanismo de defesa contra uma elevada taxa de mutação é a atividade proofreading das polimerases, q podem identificar nucleótidos mal incorporados através do seu domínio exonuclease 3’-5’ (a polimerase é sensível à geometria do par de bases). A sua função é remover os primers de RNA. O mecamismo de proofreading nem sempre é eficiente, sendo necessário uma 2ª linha de defesa - a mismatch repair (MMR). A sua função é corrigir o emparelhamento inadequado de bases e pequenas inserções/deleções que são criados durante a replicação devido a polymerase slippage. Replication slippage - ocorre qd a DNA polimerase se dissocia da cadeia e se liga a uma sequência próxima, resultando numa deleção ou numa inserção de sequências. Deteção de erros de replicação 1. MutS α ou MutS β iniciam a reparação de DNA ao reconhecerem e ligarem-se a emparelhamentos errados (mismatch). 2. Outras moléculas são recrutadas para o complexo, MutL α, PCNA e fator de replicação C (RFC). 3. Este complexo inicia a atividade da endonuclease q faz cortes na cadeia simples perto do mismatch, e abre locais de entrada para a exonuclease 1 (EXO 1) levando à dissociação final da lesão do DNA. 4. A enzima DNA ligase une os fragmentos. 5  Consequências de erros de replicação Instabilidade genómica, acumulação de mutações ou anomalias cromossómicas. Embora o cancro seja a classe de doenças mais associada com a instabilidade genómica, existem diversas doenças congénitas associadas com replicação de DNA disfuncional. Exemplos: Síndrome Meier-Gorlin causa naninsmo, subdesenvolvimento do ouvido externo e subdesenvolvimento/ausência de rótula,.. Causada por mutações em genes codificantes para proteínas de reconhecimento de origem de replicação (ORC). Pol ε é composto por 4 subunidades: POLE1, POLE2, POLE3 e POLE4. Variações patogénicas de POLE1 podem causar pré-disposição para cancro, entre outras consequências. Replicação de DNA mitocondrial Ocorre predominantemente durante a interfase. POLγ (gamma) é a polimerase responsável pela síntese das cadeias H e L. Requer a ação da helicase TWINKLE para separar as cadeias. A replicação da cadeia H inicia-se e procede unidirecionalmente; a cadeia parental H é deslocada e ligada a single-stranded DNA-binding proteins (mtSSB) que previnem a formação de estruturas secundárias. Qd o complexo de replicação atinge OriL, a cadeia H original forma uma estrutura em loop. A polimerase POLRMT sintetiza um pequeno primer na região loop, necessário para iniciar a síntese da cadeia L. Ambas as cadeias H e L continuam a sua síntese até formarem o círculo completo e se separarem. Defeitos na replicação de mtDNA podem causar doenças genéticas, como: Síndrome de Alpers - doença autossómica recessiva degenerativa do sistema nervoso central; Ataxia espinocerebelosa de início infantil (IOSCA) - desordem autossómica degenerativa do cerebelo, tronco cerebral, medula espinhal, causada por mutações num gene q codifica a helicase Twinkle. Divisão Celular Cromossomas homólogos Cromatídeos Irmãos Correspondem aos 2 cr de um par (cada um Correspondem às 2 cópias idênticas herdado de um progenitor). de 1 cr, formadas durante a Têm os mm genes na mm ordem, mas pode replicação. existir variação entre eles, resultando em Unidos pelo centrómero mas diferentes alelos. separam-se na divisão celular. Depois da duplicação, a célula continua diplóide (2n = 46) mas duplica o seu conteúdo. 6 em DNA Mitose Divisão somática das células responsáveis pelo crescimento, proliferação e diferenciação dos tecidos. (2 cél filhas) O nº de cr não é reduzido em cada divisão mitótica, pq antes da divisão, cada um dos cr é replicado. Os cr não são visíveis ao microscópio ótico em células q n estão em divisão (interfase). Meiose Divisão celular que reduz o nº de cr durante a formação dos gâmetas - cada célula diplóide sofre 2 rondas de divisão (meiose I - etapa reducional e meiose II - etapa equacional) para dar origem a 4 células filhas haplóides. 7  Profase I: a diferença entre mitose e meiose é visível pq os cr além de se condensarem, tb se alinham com os seus homólogos. Crossing-over: aumento da variabilidade genética nas populações através de recombinação entre cromossomas homólogos. Metafase I: os pares homólogos alinham-se na zona equatorial para separação, e a sua orientação é aleatória, o q permite a formação de gâmetas c diferentes conjuntos de homólogos. Anafase I: os cr homólogos são separados (segregados) e movem-se para pólos opostos da célula (cromatídeos irmãos permanecem ligados). Telofase I/citocinese: os cr homólogos estão nos pólos opostos e a célula divide-se em 2 por estrangulamento da zona equatorial. Ou seja, os cr homólogos estão agora em células diferentes. As células avançam para meiose II sem duplicarem o seu DNA (não há interfase) Profase II: os centrossomas afastam-se e o fuso meiótico começa a capturar os cr. Metafase II: os cr individuais alinham-se na linha equatorial. Anafase II: os cromatídeos irmãos separam-se e são puxados para pólos opostos da célula. Telofase II: as membranas nucleares começam a rodear cada grupo de cromossomas. Citocinese: divide os grupos de cromossomas em diferentes células - 4 células haplóides formam o produto final da meiose … gâmetas. Erros na replicação de DNA e divisão celular Euploidia e aneuploidia - alterações do nº ou da estrutura dos cromossomas de um organismo. Euploidia: altera o conjunto completo de cr; o nº de genomas é alterado, haplóide (n), diplóide (2n) ou poliplóide (3n,4n,etc). A euploidia não é compatível com a vida. Aneuploidia: não altera todo o conjunto de cromossomas, mas altera o nº de 1 ou + cromossomas.  1 cromossoma a menos - monossomia (2n-1)  1 cromossoma a mais - trissomia (2n+1) - a mais comum  2 cromossomas a menos - nulissomia (2n-2)  2 cromossomas a mais - tetrassomia (2n+2) Um ou + cr podem ser indevidamente segregados (anafase), e as cél filhas podem ter +- cromossomas que o normal - aneuploidia. 8 Erros na segregação (anafase) durante a formação dos gâmetas podem levar à aneuploidia no organismo inteiro, o que por vezes pode ser incompatível com o desenvolvimento embrionário. A poliploidia ocorre devido a falhas na citocinese, ou devido a fusão celular. Existem diferentes tipos de aneuploidia: perda ou ganho de cromossomas completos, mas também pode existir aneuploidia segmental, caracterizada por perdas ou ganhos de apenas uma parte do cromossoma, e outros rearranjos cromossomais complexos. Aneuplodia pode tb ocorrer em células somáticas, e aumenta com a idade. Mosaicismo Ocorre qd existe uma variação no nº de cr em diferentes linhas celulares do corpo, que resultam de eventos mutacionais (aneuploidia parcial). Embriões com mosaicismo derivam de erros durante a anafase. O mosaicismo pode ser somático - não transmitido entre gerações - ou de linhagem germinativa (pode ser transmitido às gerações seguintes). Genes e genoma Gene -> RNA -Transcrição Existem 2 classes principais de genes no genoma:  Genes codificantes de proteínas  Genes codificantes de RNA - o produto funcional é algum tipo de RNA não codificante de proteína (tRNA, rRNA, microRNA, siRNAs, RNAs longos,…). Pseudogenes - sequências de DNA semelhantes a genes codificantes mas que não produzem proteínas funcionais, por acumulação de mutações a longo prazo. (codões iniciais em falta, codões stop prematuros, intrões em falta,…) Estrutura típica de um gene codificador de uma proteína:  Exões - região codificante para proteína  Intrões - região não-codificante de proteína (splicing alternativo), reguladores  Regiões reguladoras - promotor, enhancer/silencer  Sequência terminadora - sequência de nucleótidos q marca o final de 1 gene durante a transcrição (codão stop). 9  Transcrição Processo de produção de uma cópia de RNA (mRNA) a partir de uma sequência de DNA, que transporta a informação necessária para produção de uma proteína. Envolve 3 passos: iniciação, elongação e terminação. É efetuada no núcleo, e o mRNA maduro é exportado para o citoplasma através dos poros nucleares. Existem 3 tipos de RNA polimerases: I, II e III -> têm 8 ou + subunidades q facilitam a ligação e o processamento do DNA durante a transcrição. A transcrição para mRNA é realizada pela enzima RNA polimerase II que forma a molécula precursora de mRNA (pré-mRNA). Inicia-se qd a RNA polimerase se liga a determinadas proteínas - fatores de transcrição (TFs) - que se ligam a sequências específicas do promotor. Os binding sites dos TFs são sequências curtas, especificamente ligadas por 1 ou + TFs, os quais podem promover ou bloquear o recrutamento da RNA polimerase, tornando os genes + - ativos. 1. Para a transcrição ter início, TFIID (um fator de transcrição) liga -se à TATA box, o q induz uma dobra na dupla hélice de DNA e o recrutamento de TFIIB para estabilizar o complexo. 2. TFIIB recruta a Pol II e TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF e TFIIH para formar o complexo de pré-iniciação (PIC). 3. O domínio CTD (carboxil-terminal) da Pol II é fosforilado por TFIIH, e as cadeias de DNA são separadas. 4. A Pol II é libertado do PIC e pode mover-se para a frente. Todos as TFII exceto TFIIH ficam para trás. 5. Durante a terminação, a RNA polimerase dissocia-se e a fosforilação pode ser reciclada. Os TFs podem-se ligar tb em regiões reguladoras distantes dos genes; no caso de promoverem a transcrição, as sequências são chamadas de enhancers, no caso de reprimirem a transcrição são silencers. 1 característica dos enhancers é q atuam independentemente da distância e orientação dos genes alvo: podem estar a centenas ou milhares de bases de distância. A atividade dos enhancers envolve a ligação a TFs específicos de células/tecidos, em resultado de DNA looping para interação direta com o promotor. 10 RNA Splicing - mecanismo que remove os intrões do pré-mRNA através do spliceosome. Os splice sites vão remover os intrões dos transcritos primários em sequências conservadas. Alterações destes nucleótidos conservados resulta na inibição do splicing. Estes localizam-se nos términos 5’ e 3’ dos intrões: quase sempre, a sequência de RNA que irá ser removida começa com GU no seu término 5’, e termina com AG em 3’. O spliceosome é uma estrutura composta por vários small nuclear RNAs (snRNA’s). Este complexo depende da complementaridade entre snRNA’s e os intrões e exões, e interações entre proteínas. Existem 5 snRNA’s designados por U1 , U2 , U4 , U5 e U6. O spliceosome é ativado ao se ligar ao pré-mRNA, e remove os intrões e une os exões. Splicing Alternativo - O mm pré-mRNA pode ser processado (cortado) de diferentes maneiras, dando origem a diferentes transcritos do mm gene, dependendo dos exões que são mantidos. Terminação da transcrição - Passo final da síntese de RNA onde o novo transcrito é libertado da RNA polimerase e ambos são libertados da cadeia de DNA. Uma terminação eficiente e a tempo assegura que não sejam produzidos transcritos incorretos ou que o complexo continue a transcrição para genes adjacentes. A maioria dos mRNAs contêm um sinal poly(A) - 5′-AAUAAA-3′ - q é seguido por uma sequência rica em G-U. Quando a Pol II transcreve poly(A), ocorre uma redução deste processo, levando a uma clivagem no transcrito seguido por uma poliadenilação (adição de As) no produto clivado. 5’ cap (five prime cap) - adição de uma guanina modificada q é crucial p/ a estabilização do transcrito, splicing, poliadenilação, exportação p/ o citoplasma e eficiência da tradução p/ proteína. Cauda 3’ polyA - adição de ~100-200 nucleótidos de adenina, q torna o transcrito + estável e auxilia na exportação para o citosol. 11 UTR - untranslated region - segmentos de RNA localizados no 5’ UTR ou entre o codão stop e a cauda poly(A) (3’ UTR). Transcritos para pré-mRNA mas n p/ a proteína; 5’UTR é necessária para ligação ao ribossoma e reconhecimento do início da tradução; 3’UTR elemento regulatório q determina a taxa a q a tradução prossegue. Gene -> RNA -> proteína - tradução Código Genético - instruções contidas num gene para “construir” uma proteína específica. Codão - conjunto de 3 bases que especificam um determinado aa (3 nucleótidos de mRNA). Codogene - 3 nucleótidos de DNA. Anticodão - 3 nucleótidos de tRNA. Codão de iniciação - AUG (ATG em DNA), q especifica o aa Metionina (Met). Existem 64 codões possíveis, 3 dos quais não codificam para aa mas indicam o final de uma proteína - codões Stop UAA, UAG e UGA. Os restantes 61 codões especificam 20 aa q compõem as proteínas. A Metionina e o Triptofano (Trp) são os únicos aa que são codificados por apenas 1 codão. Código genético degenerado - um aa pode ser codificado por vários codões. Tradução - o mRNA é lido de acordo com o código genético, q relaciona determinada sequência de DNA com a sequência de aa na proteína. Ocorre em organelos especializados - ribossomas - localizados no citoplasma e no retículo endoplasmático, e são constituídos por uma large subunit e por uma small subunit. Open Reading Frame (ORF) - corresponde à sequência de DNA/RNA q começa com um codão AUG e termina com um codão stop. Como os codões são formados por 3 bases, e as cadeias complementares de DNA são 2, podem existir 6 frames de leitura pelo ribossoma. Para um gene codificante de proteína, a frame correta será a mais longa e que não tem codões stop intercalados. A análise bioinformática de sequências permite identificar a frame correta e identificar genes. 12 Modificações pós-tradução As modificações pós-tradução de proteínas (PTMs) são processos covalentes que alteram as propriedades das proteínas, e que aumentam muito a diversidade funcional do proteoma (conjunto de proteínas e variações q ocorrem numa célula devido a um estímulo específico). Incluem clivagem proteolítica e adição de grupos químicos a 1 ou + aa - acetilação, fosforilação, glicolisação, metilação, etc. A alteração da estrutura e dinâmica das proteínas pelas PTMs, é importante, podendo ser reversíveis ou irreversíveis. Impacto de erros durante a transcrição e tradução Erros durante a transcrição ou tradução do mRNA para proteína podem levar a: - alterações no mRNA - redução do nível de funcionalidade da proteína - funções aberrantes Erros durante a tradução incluem: - incorporação do aa incorreto - troca de frame - a tradução não terminar no codão stop ou terminação prematura (produzindo proteínas divergentes da sequência codificada). Genótipo e Fenótipo Genótipo - corresponde à sequência única de DNA de 1 indivíduo; Fenótipo - parte observável do genótipo, resulta de uma interação entre o genótipo e o ambiente. A ligação entre genótipo e fenótipo nem sempre é linear: podem existir disparidades entre 1 teste genómico de 1 pessoa para 1 determinada condição e a sua manifestação clínica. De forma semelhante, o fenótipo de pessoas com uma mm condição pode variar muito, mm dentro da mm família. As razões para a disparidade entre genótipo e fenótipo incluem:  Penetrância - proporção de pessoas portadoras de 1 determinada variante genética q expressam uma condição associada - completa (100%) ou reduzida ( RNA -> RNAs não codificantes de proteína RNAs não codificantes (ncRNAs) de proteína constituem uma importante classe de elementos reguladores da expressão de genes codificantes de proteína, e tb estão envolvidos no processamento de outros RNAs como tRNAs e rRNAs. Incluem: - MicroRNAs (miRNAs) - Pequenos RNAs de interferência (siRNAs) - RNAs circulares - Long noncoding RNAs (lncRNAs), etc. De que maneira é que a descoberta de ncRNAs desafiou o dogma central da biologia? Gene -> RNA -> miRNAs miRNAs - funções reguladoras que afetam a diferenciação, desenvolvimento e crescimento celulares (participam da manutenção da homeostasia). São transcritos a partir de genes codificantes de miRNAs - miR genes. 1. Os genes miR são transcritos no núcleo pela RNA polimerase II em pri-miRNAs; 2. Pri-mRNA são clivados no núcleo pela enzima DROSHA, formando os pré-miRNA; 3. O pré-miRNA é exportado para o citoplasma e processado pela enzima DICER1, onde o loop é removido; 4. O miRNA duplex é incorporado pelo complexo de proteínas RISC, onde a proteína endonuclease Argonauta2 (AGO2) é um componente essencial; 5. Uma cadeia é descartada, deixando apenas a cadeia miRNA maduro, q irá fazer a regulação do mRNA alvo. Os miRNAs podem controlar a expressão de mRNAs, principalmente por terem complementaridade com a região 3’ UTR do mRNA alvo. O mRNA alvo é degradado por perfeita complementaridade com o miRNA (seed region), ativando a atividade endonuclease da AGO2. Complementaridade parcial com o mRNA alvo promove uma repressão da tradução, mas sem alterar muito os níveis de mRNA: promovem a dissociação prematura dos ribossomas, inibição da elongação, etc. 14 Transcritoma humano Consiste nas regiões do genoma q estão a ser transcritas em dado momento. Ele varia entre estados de desenvolvimento, entre tipos de células, entre indivíduos, e é influenciado por muitos fatores ambientais - não existe um único transcritoma humano mas muitos, todos dependentes do contexto. Ao analisar a coleção inteira de sequências de RNA em determinados tecidos/células, é possível determinar onde e quais genes estão ativados ou não. Dependendo da técnica utilizada (bases de dados dos transcritomas), é possível contar o nº de transcritos para determinar a atividade de um gene - expressão. Quase todas as células têm os mm genes, mas diferentes células têm diferentes padrões de expressão de genes. Estas diferenças são responsáveis pelas diferentes propriedades e comportamentos dos diferentes tecidos. Transposable elements (TE, transposões) são segmentos de DNA que têm a capacidade de mover ou fazer cópias deles próprios em diversas regiões do genoma. Cerca de metade do genoma humano consiste nestes elementos, sendo que muitos deles já perderam a capacidade de se propagar no genoma, mas continuam como uma fonte de recombinações e mutações. TEs contribuem para a plasticidade e evolução do genoma!! São um mecanismo potente de expansão do genoma, que ao longo do tempo é contrabalançado com a remoção de DNA via deleções. Existem 2 classes principais de TEs, com base no seu mecanismo de transposição: Classe I - retroelementos ou retrotransposões, propagam-se por transcrição reversa de um RNA intermediário (“cópia e cola”): DNA-RNA-DNA. A maioria dos TEs humanos são non-LTR (long terminal repeats) retrotransposões LINE e SINE (Alu). (+ abundante no genoma) Classe II - transposões de DNA, movem-se principalmente por um mecanismo de “corta e cola”: DNA-DNA. Existe tb um grande nº de sequências repetitivas não autónomas q são dependentes de um elemento auxiliar q assegura a sua mobilidade e amplificação no genoma. Podem ter consequências no genoma e na expressão de genes: 1) Rearranjos genómicos: recombinação ectópica, i.e., recombinação entre loci não-homólogos - deleções de genes, duplicações, translocações ou inversões cromossomais. 2) Modificação da estrutura de genes e regiões reguladoras por inserção: aparecimento de novos intrões ou exões, causando frameshifting ou codões stop prematuros. 3) Alteração de controlo epigenético. 15 DNA repetitivo Consiste em segmentos de nucleótidos que são repetidos, quer parcial quer completamente, noutras regiões do genoma humano - DNA repetitivo. Cerca de 8% do genoma humano consiste em tandem repeats, onde cópias repetidas são adjacentes. Os maiores tandem repeats são designados por DNA satélite e os menores são designados microssatélites. Apesar da maioria do genoma ser constituída por sequências repetitivas, alterações no nº de cópias das unidades de repetição são consideradas como não tendo qq associação com o fenótipo humano. No entanto, existem diversos exemplos de variações das unidades de DNA repetitivo que causam doenças ou alterações fenotípicas, sendo que alguns ncRNAs derivam de sequências repetitivas. Os polimorfismos podem ser classificados pelo seu tamanho: 1. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) 2. Microsatélites (Short Tandem Repeats STRs) 3. Inserções/inversões/deleções/duplicações de pequena escala 4. Minisatélites 5. Elementos repetitivos de pequena escala (SSREs) 6. Submicroscopic copy number variants (CNVs) 7. Heteromorfismos cromossómicos (CHs) 8. Euchromatic variants (EVs)(eucromatina - menos condensada) Os microssatélites tendem a mostrar variação no nº de cópias tandem - Copy number variation (CNV). Existe + CNV no genoma humano do q variação de um único nucleótido (single nucleotide variation). Os altos níveis de CNV dos microssatélites são úteis em estudos de genética de populações, onde cada variação do nº de cópias é tratada com um alelo. CNV de microssatélites de 3 nucleótidos têm sido associados c várias doenças genéticas e tb são utilizados em análises genéticas e forenses: Como cada indivíduo tem um padrão de microssatélites quase único, a amplificação destas regiões por PCR pode ser informativa para estudar dissomia uniparental (1 pessoa recebe 2 cópias de um cr ou parte de um cr de um dos progenitores e nenhuma cópia do outro), testes de paternidade ou para identificação de um violador. Os telómeros são regiões protetoras dos cr, q previnem a fusão dos cr e evitam perda de DNA durante a replicação, e são excecionalmente ricos em DNA repetitivo. 16 O microssatélite telomérico de 6 bp 5′-TTAGGG-3′ é um dos mais conhecidos, e estes elementos repetitivos sofrem uma degradação nas células somáticas com a idade. Os minissatélites são unidades de repetição de 10-100 nucleótidos - tb designados por variable number tandem repeats (VNTRs). Tendem a ser + estáveis do q os microssatélites, mas tb apresentam CNV. Os elementos repetitivos de pequena escala (SSREs) podem ser moderada a altamente repetitivos. A maior parte deles será de origem retroviral: durante a evolução ter-se-ão tornado componentes normais do genoma - retrotransposões LINE e SINE. Mutações Variação Genética - estados genéticos alternativos em regiões homólogas do genoma. Estes estados alternativos existem devido à existência de erros durante a replicação de DNA e durante a meiose - se estes mecanismos fossem 100% corretos, não haveria evolução! A maioria das mutações envolve a substituição de 1 nucleótido por outro, tal como as mutações que produzem os SNPs. Outras mutações envolvem rearranjos, inserções ou deleções de nucleótidos (indels). Rearranjos Ocorrem qd há quebras nos cromossomas, q podem resultar de: 1) Translocações, onde o segmento quebrado se liga a um cr diferente, não-homólogo. 2) Inversões, onde o segmento quebrado se volta a ligar ao cr original mas numa orientação invertida (46 cr). Outros rearranjos incluem duplicação em larga-escala e deleções. Muitos tipos de rearranjos cromossomais são deletérios devido a problemas na meiose, mas 2 classes de rearranjos são + comuns, e contribuem para a variação do pool genético - translocações Robertsianas e inversões. Os cr rearranjados designam-se por derivativos. 1) Translocações As translocações Robertsianas envolvem 2 cr acrocêntricos não- homólogos, onde os braços longos “q” se fundem para formar 1 único cromossoma metacêntrico. Pode ocorrer nos 5 pares de cr humanos q são acrocêntricos: 13, 14, 15, 21 e 22 (+ comuns entre 13/14 e 14/21). 17 O final dos braços curtos (p) de todos os cr acrocêntricos contém sequências repetitivas de DNA semelhantes que os predispõem para a fusão, mas que depois se perdem - o total de cr de um indivíduo com translocação Robertsiana é 45 (mas o conteúdo cromossomal é equilibrado, já q a perda dos braços curtos não é problemático). Contudo, costumam produzir gâmetas desequilibrados q podem resultar em zigotos monossómicos ou trissómicos. A fertilização de um gâmeta desequilibrado com um gâmeta normal pode resultar numa diversidade de zigotos: Monossomia 14, trissomias 13, 14, 15, 22 e monossomia 21 - letais para o embrião. As restantes possibilidades são cr normais, translocação Robertsiana equilibrada e trissomia 21. Translocação recíproca - troca de fragmentos entre 2 cr não homólogos - o nº total de cr permanece 46.  Pode ser equilibrada, com desenvolvimento normal, mas pode resultar em alterações da estrutura dos genes devido à nova localização e/ou expressão anormal dos genes, levando a um fenótipo diferente.  Podem ocorrer na linha germinativa por erros durante a meiose, e em células somáticas, por erros durante a mitose. Durante a meiose, os cr homólogos emparelham. Qd uma translocação recíproca está presente, os 4 cr (ie, os 2 derivativos e os 2 normais), formam uma estrutura designada por quadrivalente. A. Segregação alternada origina 2 gâmetas normais e 2 gâmetas equilibrados; B. Segregação adjacente-1 produz 4 gâmetas desequilibrados; C. Segregação adjacente-2 produz 4 gâmetas desequilibrados. 18 Um portador de uma translocação recíproca equilibrada pode produzir gâmetas desequilibrados, resultando em zigotos com trissomia parcial e monossomia parcial para as regiões afetadas do cr. A probabilidade de ter um filho com cada uma das 4 possibilidades depende da frequência dos gâmetas. 2) Inversões Não alteram o conteúdo do cr -> pode haver ou não consequências fenotípicas. Podem originar união de genes, disrupção da estrutura dos genes, e erros de orientação (consequências para a transcrição). As inversões cromossómicas podem ser:  Paracêntricas - o fragmento invertido não inclui o centrómero.  Pericêntricas - o fragmento invertido inclui o centrómero. Qd um cr com uma inversão emparelha com o homólogo normal durante a meiose, ocorre a formação de um loop. Se um nº ímpar de crossing-overs ocorrer dentro do loop, serão formados gâmetas desequilibrados. Inversão paracêntrica  Durante a meiose, o loop não contém o centrómero.  Qd os cr emparelham, o segmento invertido (cr com ACBD) forma um loop de modo a formar o loci para o alinhamento; o cr ABCD permanece linear.  Um crossover em qq local da região invertida produz uma ponte dicêntrica (2 centrómeros), e um fragmento acêntrico (sem centrómero).  Para identificar a ponte dicêntrica, 1º trace o cromatídeo de cima, da direita para a esquerda, até ao centrómero (DCBA);  Depois trace o 2º cromatídeo da esquerda para a direita, através da inversão, onde se cruza com o 3º cromatídeo (ABCA); repare que leva ao centrómero, e ao 4º cromatídeo;  O 3º cromatídeo da ponte dicêntrica, da esquerda para a direita, é ACBD;  Para identificar o cromatídeo acêntrico, trace o cromatídeo de baixo, da direita para a esquerda, através da inversão, até ao final do lado direito do 2º cromatídeo - sem centrómero (DBCD);  Durante a telofase I, os 2 centrómeros do dicêntrico segregam-se para pólos opostos, e a ponte quebra-se.  O fragmento acêntrico não se move para nenhum pólo e desaparece.  Isto produz 2 produtos de deleção, onde 1cr tem 1 cromatídeo com o grupo completo de loci e o outro cromatídeo tem em falta 1 ou + loci. 19 Inversão pericêntrica (+ comum)  Durante a meiose, o loop contém o centrómero.  O cromatídeo de cima tem o arranjo normal (ABCD).  O 2º cromatídeo é ABCA, ie, tem o locus A duplicado e locus D em falta.  O cromatídeo de baixo é DBCD (locus A em falta e D duplicado).  O 3º cromatídeo tem o arranjo invertido DBCA.  Isto produz produtos de duplicação e de deleção, ie, cromatídeos que contêm loci extra e loci em falta. Em ambas as inversões, um nº par de crossing-overs no loop resulta em gâmetas normais, com metade a herdar a inversão normal e metade a herdar a inversão equilibrada. Um nº ímpar de crossovers produz 2 produtos de deleção (paracêntrica) e 2 produtos de deleção e duplicação (pericêntrica). 2 crossovers no loop - todos os produtos são viáveis, não há redução na fertilidade. ambos crossovers fora do loop - todos os produtos são viáveis, não há redução de fertilidade. 1 crossover no loop e 1 fora do loop - 2 gâmetas com deleções, levando a decréscimo de fertilidade. Resumo do efeito de inversões…  Crossing-over ímpar é suprimido se ocorrer dentro do intervalo definido pela inversão: produção de cr gaméticos q são duplicados/deficientes para material genético, resultando em letalidade do zigoto;  Apenas os cromatídeos parentais (normal e invertido equilibrado) são retidos para a geração seguinte;  As inversões permitem o aparecimento de complexos de genes co-adaptados: a região dos cr dentro dos pontos de quebra pode conter alelos de genes q conferem um aumento do fitness qd ocorrem juntos. Classificação das inversões de acordo com a sobreposição com regiões de genes:  Intergénicas - a sequência dos genes não é interrompida, embora todo o gene possa ser invertido;  Intrónica - a inversão ocorre totalmente dentro um intrão de um gene;  Quebra de genes - inversões q quebram os genes, quer no seu término quer por inversão de exões.  20 Inserções e deleções (indels) Indels - inserções ou deleções de 1 ou + nucleótidos numa sequência de DNA. Qd maiores designam-se por variações estruturais. Indels nas regiões codificantes originam 2 tipos de variantes:  Frameshift (FS) - alteram a reading frame a partir do local do indel, o q pode produzir diferentes proteínas (não sinónimas - missense) ou levar à sua terminação prematura (nonsense).  O mRNA q contém codões stop prematuros pode ser sujeito a um mecanismo designado por non-sense- mediated mRNA decay (NMD), q elimina esse mRNA.  Não frameshift (NFS) (em frame) - consistem em indels de múltiplos de 3 bp, introduzindo a inserção ou deleção de 1 ou + aa, enquanto o resto da sequência da proteína se mantém intacta. O mecanismo + comum proposto para a formação de indels chama-se slipped strand mispairing ou polymerase slippage, onde a DNA polimerase e a nova cadeia recém formada se dissociam temporariamente da cadeia de DNA original. Afeta regiões com DNA repetitivo. Outros mecanismos de formação de indels:  Defective Mismatch Repair - acumulação de indels não corrigidos pelo mecanismo de MMR causa frequentemente frameshifts nos exões.  Recombinação meiótica desigual - recombinação envolvendo cr homólogos mal alinhados pode resultar na formação de indels na linha germinativa. Em casos de grandes deleções, crossover homólogo desigual ocorre entre elementos repetitivos como sequências Alu (elemento + abundante no genoma humano), orientadas na mm direção ou em direções opostas. 21 Consequências Funcionais  Decréscimo da transcrição do gene mutado Ex: Síndrome do X frágil, a 2ª causa + comum de deficiência intelectual, é causada pela expansão de um trinucleótido CGG na região 5’-UTR do gene FMR1, causando um decréscimo de expressão; indivíduos com +200 cópias são doentes, -50 são normais, e entre 50-200 cópias são pré-mutações.  Agregação anormal de proteínas A expansão de trinucleótidos dentro das regiões codificantes causa doenças devido à produção de proteínas alongadas. Muitas condições advêm da expansão de CAG. Ex: indivíduos com doença de Huntington têm 36 ou + repetições de CAG no gene HTT, sendo que 60 ou + repetições levam ao aparecimento precoce da doença.  Doenças por função “tóxica” do mRNA Ex: Distrofia miotónica tipo 1, causada por uma expansão de CTG na 3’UTR do gene DMPK, o que causa diminuição da expressão e alterações em diversas outras proteínas.  Instabilidade de microssatélites/expansão rápida de repetições As doenças causadas por repetição de trinucleótidos, incluindo Síndrome do X frágil e doença de Huntington exibem antecipação; qd o nº de repetições atinge um certo nº, as sequências tornam-se instáveis e expandem-se rapidamente na gametogénese, com a transmissão de repetições + longas para as gerações seguintes, q apresentam sintomas + graves do q os progenitores e aparecimento precoce da doença.  Alteração de splicing A inserção ou deleção de nucleótidos na sequência de genes pode criar novos splicing sites, com alterações na sequência de mRNA e da proteína, q podem ter ou não consequências funcionais.  Frameshift Além de alterarem a sequência de aa, tb causam o aparecimento prematuro de codões stop. O mRNA resultante é sujeito a degradação por non-sense-mediated mRNA decay.  Decréscimo ou aumento da atividade de proteínas por indels não frameshift Por alteração por exemplo de domínios da proteína, com consequente alteração da atividade. 22 Single Nucleotide polymorphisms (SNPs)  São variações no DNA ao nível de 1 nucleótido.  Não são necessariamente mutações, se forem detetados em + de 1% da população - polimorfismos.  São o tipo + comum de variação genética no genoma humano, existindo milhões de locais de SNPs - contribuem para a variação fenotípica.  Existem quer em regiões codificantes quer não-codificantes do genoma.  São causados por processos mutacionais aleatórios tais como a incorporação incorreta de nucleótidos durante a replicação de DNA ou danos no DNA. Estas forças mutacionais são muitas vezes contrabalançadas pelos mecanismos de reparação de DNA e por seleção Darwiniana.  Os SNPs localizados nas regiões codificantes podem causar alterações sinónimas ou não sinónimas. Embora as mutações sinónimas não afetem a sequência de aa da proteína, elas podem alterar a expressão da proteína ao afetar:  Modificações pós-transcricionais (5’ cap, polyA, splicing).  Taxa de tradução. Em contraste, as mutações não sinónimas causam alterações na sequência de aa, resultando em mudanças:  Estrutura da proteína.  Propriedades físicas e químicas (estabilidade, solubilidade, etc).  Função da proteína. Efeito funcional dos SNPs de acordo com a sua localização: a) SNPs nos promotores podem alterar a expressão ao modificar os binding sites dos TFs. b) SNPs nas 5’-UTR podem modificar o início da tradução e estabilização do mRNA. c) SNPs nos intrões podem alterar o splicing, e modular a exportação para o citoplasma. d) SNPs nos exões pode causar a substituição de um aa por outro. e) SNPs nas 3’-UTR podem modificar a estabilização dos transcritos e a localização do mRNA no citoplasma. SNPs podem ser usados como marcadores biológicos para encontrar genes ligados a doenças. 23 O que pode acontecer se houver uma alteração de um nucleótido (SNP) numa região promotora? -> Altera-se a expressão devido a uma modificação dos binding-sites dos fatores de transcrição. -> SNP na região reguladora (promotora) do gene pode alterar a afinidade dos TFs e contribuir para o aparecimento da doença. SNPs podem ser de 2 tipos:  Transições - mudança entre 2 purinas (2 anéis, A - G) ou 2 pirimidinas (1 anel, T - C)  Transversões - mudança entre 1 purina e 1 pirimidina (A - C, G - T, A - T, G - C) Nas regiões codificantes do genoma ocorrem + transições do que transversões - pensa-se que transversões são - comuns nos exões pq é + provável q resultem em substituições de aa. Nas regiões não codificantes, as transversões são + prováveis de alterar a estrutura local do DNA, o binding dos TFs, e logo alterar a atividade dos elementos reguladores. Recombinação e conversão de genes Recombinação genética - rearranjo de sequências de DNA, através de mecanismos de quebra e (re)ligação de cromossomas ou segmentos de cromossomas. Recombinação meiótica - exemplo de recombinação genética onde as sequências de DNA emparelham e são homólogas em grande parte da sua extensão - recombinação homóloga. É recíproca, pq cada cr recebe info comparável à info que transmite → crossing-over. A recombinação homóloga é essencial para a disjunção apropriada e manutenção da estabilidade genómica durante a meiose. Durante a meiose, o processo de recombinação é iniciado pela introdução de DNA double- stranded breaks (DSBs) em localizações específicas do genoma → existe variação substancial na taxa e na distribuição de crossovers entre indivíduos, géneros e populações. Na meiose, o processo de recombinação (RH) inicia-se com: 1) A introdução de DSBs em locais múltiplos do cr, catalizados pela proteína Spo11. 2) Depois da Spo11 ser removida, o processo de RH envolve atividade exonuclease para gerar 3’ single-straded DNA (ssDNA). 3) Rad51 e DMC1 recombinases ligam-se às caudas 3’ ssDNAs e fazem uma procura por dsDNA homólogo intacto. 4) Depois da sequência homóloga ser encontrada, as recombinases promovem a invasão (D- loop) das ssDNAs no DNA duplex homólogo. 5) Depois da troca de cadeias, existem 2 modos de reparação: double-strand break repair (DSBR) e synthesisdependent strand annealing (SDSA). 24 Double-strand break repair (DSBR) DNA polimerase e outros fatores sintetizam e ligam o DNA em falta, formando Holliday junctions, cuja resolução é efetuada por clivagem, e a sua orientação resulta em crossover ou non-crossover. Synthesis dependent strand annealing (SDSA) Método preferido de reparação em células somáticas. Mecanismo semelhante a DSBR até à formação do D-loop. Ao invés da formação de Holliday junctions, depois da síntese de DNA, a cadeia nascente dissocia-se via helicase e faz o annealing de volta com a outra cadeia. Não forma crossover. A recombinação homóloga durante a mitose promove a estabilidade do genoma através de reparação precisa do DSB do DNA e outras lesões formadas durante o metabolismo celular normal e em resposta a fatores externos adversos. A distribuição dos crossovers ao longo do genoma tb é variável, e existem regiões de DNA com taxas de recombinação muito baixas (coldspots), e outras com taxas de recombinação muito altas (hotspots). Hotspots são regiões onde o crossing-over ocorre com + frequência do q nas regiões circundantes. A distribuição destas regiões difere entre indivíduos, causando padrões hereditários de taxas de recombinação variável. A distribuição dos hotspots é positivamente correlacionada com o conteúdo em GC e com a distribuição dos elementos repetitivos, e negativamente relacionada com a densidade de genes. Conversão de genes  Forma de recombinação homóloga não-recíproca → envolve a transferência unidirecional de material genético de uma sequência “dadora” para uma sequência “recetora” homóloga.  Ocorre + entre regiões alélicas, mas tb pode ocorrer entre regiões não-alélicas.  SDSA pode produzir conversão de genes.  Na maioria das circunstâncias onde a conversão de genes é causa de doenças genéticas, o gene funcional é todo ou quase todo convertido para a sequência de um pseudogene altamente homólogo que atua como dador → tem como consequência o gene recetor ficar não-funcional. 25 Introdução à genética de populações 1) Genética de populações - ciência da variação genética entre populações de indivíduos no espaço e tempo. Assenta em 3 premissas: 1. DNA pode-se replicar 2. DNA pode mutar e recombinar 3. DNA e o ambiente interagem para produzir diferentes fenótipos Pode ser dividida em 2, de acordo com o tipo de variação estudada:  Mendeliana - limitada a características que mostram uma distribuição descontínua na população, como o grupo sanguíneo.  Quantitativa - onde não é possível classificar os indivíduos em classes discretas, como por ex altura, pressão sanguínea, colesterol total,... O genótipo de um indivíduo refere-se aos alelos específicos que transporta em 1 ou + loci. A maioria dos loci no genoma humano têm múltiplos alelos - estados alternativos do mm gene.  Alelos múltiplos são designados por polimorfismos.  Por ex, um SNP pode ser um polimorfismo (estado alternativo entre nucleótidos na mm posição).  Alelos múltiplos podem ser combinados na reprodução sexuada e dar origem a diferentes genótipos.  Genótipos são descritos como homozigóticos se existirem 2 alelos idênticos num locus e heterozigóticos se os 2 alelos diferirem.  Alelos podem ser dominantes ou recessivos - qd um organismo é heterozigótico para um locus específico e tem um alelo dominante e um recessivo, vai expressar o fenótipo dominante.  Genética utiliza pedigree para investigar variação genética ou covariação entre características fenotípicas. Como dito anteriormente, a genética Mendeliana aplica-se apenas a caract q apresentam uma distribuição descontínua na população e podem ser agrupadas em classes - fenótipos. Cada característica é controlada por alelos idênticos ou não, q definem o genótipo. Esta teoria diz q para cada característica Mendeliana, existem 2 alelos por locus e por indivíduo e que apenas 1 está presente em cada gâmeta, de forma aleatória. Indivíduos relacionados tendem a ser + semelhantes fenotipicamente pq partilham + alelos idênticos. 26  Doenças humanas podem ir desde características Mendelianas “simples” como a Fibrose Cística, q resulta de mutações no gene CFTR até características extremamente complexas como a altura, q é influenciada por centenas de variantes e fatores ambientais.  Características Mendelianas simples podem exibir heterogeneidade alélica e nos loci. Dominância refere-se à relação entre 2 versões do gene. O alelo dominante expressa-se de uma forma + forte do que o recessivo. Ex: o alelo recessivo produzir uma proteína não- funcional. A cor da íris é um ex de genética Mendeliana, com o castanho sendo dominante sobre o azul. SNP’s podem ser diferentes alelos. Pedigree q mostra a 1ª geração homozigótica azul e homozigótica castanha, a 2ª geração com heterozigóticos castanhos, e 3ª geração com azul ou castanho, dependendo do outro progenitor. Contudo, isto apenas descreve 1 parte da cor, há variações intermédias como verde, cinzento e albino (não possui nenhuma pigmentação, pelo q o modelo Mendeliano não se aplica). A genética de populações considerava 2 alelos em cada locus de gene baseada na suposição que os genes existem em pares! Características quantitativas são poligénicas, ie, controladas por vários genes - o valor da característica quantitativa varia continuamente. Polimorfismo - refere-se à coexistência de 2 ou + fenótipos alternativos numa população, q são causados por formas alternativas do mm alelo. (alelos múltiplos) 2) Frequência alélica - taxa de ocorrência de determinado alelo numa população. Forças que podem afetar a frequência alélica: 1. Seleção natural 2. Mutação 3. Gene flow - introdução de novos alelos na população 4. Genetic drift - alteração aleatória da frequência alélica 5. Genetic bottleneck - diminuição da diversidade genética por qq evento 6. Seleção sexual Podem ser identificados 3 níveis de estrutura de populações: Organismos individuais Sub-populações População total 27 Cálculo da frequência alélica É determinada pelo nº de vezes q 1 alelo aparece na população / pelo nº tt de cópias do gene. Se existirem +2 alelos de um gene numa população, adicionam-se todos no denominador. A pool genética consiste em todas as cópias desse gene na população. Ex: 9 plantas com 2 alelos, W e w → cada planta pode ser WW, Ww ou ww. Estão presentes 13 cópias do alelo W e 5 cópias do alelo w. O nº tt de cópias na população é 13 + 5 = 18. Por convenção, qd existem apenas 2 alelos para um mm gene na população, as frequências são dadas pelos símbolos p e q: p = frequência de W e q = frequência de w A soma das 2 freq tem de ser 100% (p+q=1) 3) Hereditariedade Mendeliana 1ª Lei de Mendel (Lei da segregação dos caracteres): Durante a formação dos gâmetas, os 2 alelos de um mm locus separam-se (segregam) um do outro; deste modo, cada gâmeta tem uma probabilidade igual de conter cada um dos alelos. 2ª Lei de Mendel (Lei da segregação independente): Os alelos de 2 (ou +) genes diferentes organizam-se em gâmetas independentemente um do outro; o alelo que um gâmeta recebe de um gene não influencia o alelo recebido por outro gâmeta. No entanto, há uma exceção: qd os loci estão próximos no mm cromossoma dizem-se ligados, e por causa disso, não segregam independentemente. Qd os genes estão muito próximos no cromossoma, o crossing-over tb ocorre, mas o resultado (em termos de gâmetas) é diferente: em vez de se separarem independentemente, os genes tendem a ficar juntos durante a meiose - passam juntos para um gâmeta. Quadro de Punnet: permite determinar os genótipos e fenótipos possíveis da descendência, bem como a probabilidade de ocorrência de cada um. 28 Doenças autossómicas recessivas de gene único Ocorrem apenas em indivíduos com 2 alelos mutantes do gene associado à doença, herdando cada alelo de cada progenitor. Ambos os progenitores são portadores da característica (heterozigóticos), mas podem não manifestar a doença. Pode não se verificar em todas as gerações. Ex: Progenitores - Aa (portadores s/ manifestar doença); Seguintes gerações - Aa, AA, aa; aa - portadores manifestantes da doença Doenças autossómicas dominantes de gene único Ocorrem em indivíduos que apresentam mutação de 1 dos alelos associados à doença. A presença de um alelo mutado é suficiente para induzir a doença.  A condição geralmente não “passa” gerações.  Se ambos os progenitores apresentam a doença, mas a descendência não, então ambos são heterozigóticos.  Em doenças autossómicas dominantes, a maioria das mutações leva à produção reduzida de determinada proteína ou a uma proteína inativada.  O efeito clínico depende da proteína afetada: se for uma enzima, indivíduos heterozigóticos poderão ser clinicamente normais pq o alelo não mutado pode compensar até 50% da atividade enzimática. Se forem proteínas estruturais, como colagénio, indivíduos heterozigóticos apresentam efeitos sérios da condição. Equilíbrio de Hardy-Weinberg Este teorema lida com a genética Mendeliana no contexto de indivíduos diplóides, com reprodução sexuada. A frequência dos alelos numa população mantém-se constante de geração para geração. Pressupostos do equilíbrio Hardy-Weinberg: Se estes pressupostos não forem cumpridos 1. Não existe mutação. para um gene, as frequências alélicas podem 2. Não existe fluxo genético. mudar e a população pode evoluir para esse 3. O acasalamento é aleatório. gene. 4. Não existe seleção natural. Caso estejam no equilíbrio, as frequências 5. O tamanho da população é infinito. dos alelos e os genótipos nessa população permanecerão os mm ao longo de gerações. 29 Ex: Frequência alélica: Frequência genotípica: Alelo A = 12/40 = 0.3 (p) AA = 2/20 = 0.1 Alelo a = 28/40 = 0.7 (q) Aa = 8/20 = 0.4 aa = 10/20 = 0.5 p2+2pq+q2=1 p2 = (0.3)2 = 0.09 = 9% AA q2 = (0.7)2 = 0.49 = 49% aa -> 9%AA + 42% Aa + 49%aa = 1 (Equilíbrio …) 2pq = 2*(0.3)*(0.7) = 0.42 = 42% Aa Vamos supor que os besouros acasalam aleatoriamente - reprodução seria o resultado de 2 eventos aleatórios: seleção de 1 espermatozoide e de 1 óvulo do mm pool genético (todas as cópias de um gene na população). A probabilidade de formação de qq genótipo (AA, Aa ou aa) na geração seguinte é a mm probabilidade de formar o conjunto de óvulo e espermatozóide que produz esse genótipo.  O equilíbrio de Hardy-Weinberg é um equilíbrio neutro, ie, uma população perturbada no seu equilíbrio de frequências genotípicas vai atingir o equilíbrio depois de uma geração de acasalamento aleatório (se os outros pressupostos do teorema forem observados). Contudo, se as frequências alélicas mudarem durante esse período, haverá um novo equilíbrio.  Esta propriedade distingue um equilíbrio neutro de um equilíbrio estável; o equilíbrio de Hardy-Weinberg não é estável, já q uma alteração nas frequências genotípicas é geralmente associada com uma alteração nas frequências de alelos (p e q), o que vai levar a novos valores de p2, 2pq e q2. Assim, uma população que verifique os pressupostos de Hardy-Weinberg irá permanecer no novo equilíbrio até ser novamente perturbada. As populações naturais geralmente não estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg. As populações tendem a evoluir - as frequências alélicas de pelos menos alguns genes mudam de uma geração para a outra. 30 Ex: Numa população numa aldeia em África, 200 indivíduos foram analisados ao sangue para estudar a anemia falciforme, que é causada por uma mutação recessiva num gene. Na análise, 116 indivíduos eram portadores (heterozigotos) para alelo de anemia falciforme, e 75 eram homozigotos para alelo normal. Existe evidência para a evolução do gene da anemia falciforme nesta população? Observado: Usando ‘S’ como alelo normal e ‘s’ como alelo da anemia falciforme  75 SS - dominante homozigótico  116 Ss - heterozigótico  116 + 75 = 191 -> 200 - 191 = 9 ss - recessivo homozigótico Frequência genotípica ss: 9/200 = 0.045 Frequência alélica s: q = (116+9*2)/400 = 0.335 Frequência genotípica SS: 75/200 = 0.375 Frequência alélica S: p = (116+75*2)/400 = 0.665 Frequência genotípica Ss: 116/200 = 0.58 p2+2pq+q2=1 -> p2=0.442 ; 2pq=0.445 ; q2=0.112 Está em equilíbrio de Hardy-Weinberg, pelo que verificamos a Equação do Esperado: -> Multiplicamos as frequências genotípicas dos indivíduos pela população tt para obter o nº de indivíduos esperados de determinado genótipo. p2 = 0.442 -> 0.442*200 = 88.4 2pq = 0.445 -> 0.445*200 = 89 q2 = 0.112 -> 0.112*200 = 22.4 Conclusão: Χ2 18,24 > Χ2 3,841 → H0 rejeitada → a população não está em equilíbrio HW! O observado não correspondeu ao esperado, pois não está em equilíbrio HW. Logo, sim, existe evidência para a evolução do gene da anemia falciforme nesta população! Linkage disequilibrium (LD) é um parâmetro que descreve o grau no qual um alelo de uma variante genética é herdado ou correlacionado com um alelo de uma variante genética vizinha (não aleatório), numa dada população. O termo Linkage disequilibrium descreve a variação genética que ocorre numa população ao longo do tempo. Está relacionado com o genetic linkage, onde 2 loci num cr permanecem fisicamente juntos através de gerações. Os loci dizem-se em linkage disequilibrium qd a frequência da associação dos diferentes alelos é > ou < do que o expectável. 2 loci dizem-se em linkage equilibrium se o alelo A e o alelo B são independentes, e a frequência dos alelos numa população e a frequência na geração seguinte é a mesma. Alelos A e B dizem-se em linkage disequilibrium qd não são herdados independentemente, causando um desvio na frequência esperada. 31 4) Hereditariedade não-Mendeliana Alelos múltiplos: Mendel estudou apenas genes com 2 alelos nas ervilhas, mas existem muitas características que têm + de 2 alelos de um gene nas populações. Ex: Tipo sanguíneo Existem 3 alelos na população humana, embora cada um de nós herde apenas 2: IA - Tipo A (dominante); IB - Tipo B (dominante); I - Tipo O (recessivo) Uma criança tem sangue tipo A e a mãe é B. O pai é: O ou AB? Antigéno leucocitário humano (HLA):  Conjunto de genes q codificam para o complexo de histocompatibilidade, q desempenha um importante papel regulador da resposta imune - ajudam o sistema imunitário a distinguir entre organismos estranhos e as células e tecidos do próprio corpo.  São um dos complexos mais polimórficos em humanos, com vários milhares de alelos que codificam para péptidos funcionais. Dominância incompleta - qd 2 alelos produzem um fenótipo intermédio (heterozigótico) entre 2 fenótipos homozigóticos - nenhum alelo se sobrepõe ao outro. Ex: Tipo de cabelo, altura e doença de tay-sachs Doença de Tay-Sachs  O alelo normal produz uma enzima responsável pela quebra de lípidos.  O alelo com mutação produz uma enzima não funcional.  Heterózigóticos produzem metade da enzima funcional, o que pode ser suficiente para um desenvolvimento normal.  Homozigóticos só produzem enzimas não funcionais, o que leva à acumulação de lípidos no cérebro. Co-dominância - qd 2 alelos produzem diferentes fenótipos num único indivíduo. Ex: Tipo sanguíneo AB e anemia falciforme Anemia Falciforme - mutação no gene ꞵ-globina (HBB)  Indivíduos homozigóticos para o alelo normal HBB produzem eritrócitos flexíveis, semelhantes a discos, que viajam facilmente através dos vasos.  Homozigóticos falciformes produzem glóbulos vermelhos rígidos em forma de foice que entopem os vasos sanguíneos.  Indivíduos heterozigóticos produzem os 2 tipos de células e raramente sofrem complicações da doença. 32 Pleiotropia - qd o mm gene afeta + do q 1 característica (expressão de carateres múltiplos → fenótipos múltiplos). Contribui para o desenvolvimento de doenças raras. Pode ter origem em 3 mecanismos distintos mas que se podem sobrepor:  Pleiotropia génica - ocorre qd um produto de um gene interage com outras proteínas ou catalisa múltiplas reações;  Pleiotropia do desenvolvimento - ocorre qd mutações têm efeitos múltiplos no fenótipo resultante;  Pleiotropia por seleção - ocorre qd o fenótipo resultante tem muitos efeitos no fitness (nível de sucesso) do organismo. Carateres poligénicos - múltiplos genes convergem para resultar num único fenótipo.  Características físicas como altura, cor da pele e cor dos olhos são ex de fenótipos controlados por vários genes. Contudo, certos fenótipos como peso e altura, são parcialmente influenciados por fatores ambientais. Hereditariedade ligada ao sexo - refere-se a características q são influenciadas por genes localizados nos cromossomas sexuais.  Nos humanos, refere-se a características ou condições influenciadas por genes no cr X, já q contém muito + genes que o cr Y + pequeno.  Indivíduos do sexo masculino (1 cópia X) são + propensos a serem afetados por este tipo de hereditariedade do que indivíduos do sexo feminino (XX), já que estas podem ter uma 2ª cópia (alelo), não mutada, q causa sintomas menores ou mm o desaparecimento de sintomas de determinada condição. Ex: Hemofilia - desordem causada por um gene anómalo no cr X - deficiência de fatores de coagulação do sangue.  Nos homens, a presença desse gene resulta no fenótipo da doença, mas não transmitem esse gene aos filhos homens, pq esses apenas herdam o gene Y do pai, não o X. Contudo, todas as filhas do homem com fenótipo da doença são portadoras, pq receberam o cr X do pai para serem XX, e podem transmiti-lo aos filhos. Frequência de variantes que resultam em doenças:  Genes responsáveis por doenças hereditárias parecem ser caracterizados por um > comprimento da sequência codificante para aa, um > nº de intrões, são expressos num > tipo de tecidos, e apresentam uma > distribuição filogenética. Tb estão distribuídos não uniformemente no genoma. 33 Mecanismos epigenéticos de regulação de genes Epigenética - estudo de como a atividade de genes é controlada sem alteração da sequência de DNA. Refere-se a alterações que possam ocorrer no fenótipo, sem alterar o genótipo. Alterações epigenéticas - modificações no DNA que regulam se os genes são ativados ou reprimidos - estas alterações são “ligadas” à cadeia de DNA e não alteram a sua sequência.  Esta regulação influencia a produção de proteínas específicas nas células, e ajuda a assegurar q cada célula produz apenas as proteínas necessárias para a sua função - por exemplo proteínas que promovam o crescimento ósseo não são produzidas no músculo. Os mecanismos epigenéticos incluem metilação de DNA, RNAs não codificantes e modificações de histonas. Fatores ambientais influenciam o aparecimento e manutenção de modificações epigenéticas, com influência no fenótipo. Metilação de DNA No genoma de mamíferos, a metilação de DNA envolve a transferência de um grupo metil para a posição C5 de citosinas para formar 5-metilcitosina. A metilação de DNA é catalizada por uma família de genes - DNA metiltransferases (Dnmts), q transferem o grupo metil a partir da molécula S-Adenosil metionina (SAM). Em células somáticas, a metilação é encontrada quase inteiramente em nucleótidos CpG. CpG islands - regiões nos promotores dos genes com um grande nº de CpGs, que não são necessariamente metiladas. Uma grande parte das CpG islands compreendem transcription start sites (TSS) e + de metade dos genes contêm CpG islands. O nível de metilação nas regiões transcritas dos genes tem sido positivamente correlacionado com a transcrição, mas a metilação nos promotores e enhancers é negativamente correlacionada com a expressão de genes. O DNA está enrolado nas histonas, formando os nucleossomas; qt + forte for essa associação, - permissivo é o DNA para a expressão de genes → uma das características comuns das CpG islands é conterem menos nucleossomas do q outras regiões do DNA. 34  Muitos binding sites dos TFs são ricos em CG, e as CpG islands é provável que promovam a ligação dos TFs aos binding sites.  A metilação de DNA torna a cromatina + compactada e inacessível para os TFs, levando ao silenciamento da expressão.  O DNA metilado atua como binding site das proteínas methyl-CpG binding domain (MBDs).  As MBDs, associadas a outros fatores como as histonas deacetilases podem induzir estados repressivos da cromatina. A) Metilação em CpGs de binding sites nos promotores dos genes pode induzir a não ligação dos Tfs. B) CpGs metilados recrutam proteínas MBD, q podem bloquear fisicamente os TF binding sites, ou recrutar outros repressores da atividade dos TFs, levando ao silenciamento da expressão dos genes. Dnmt3a e Dnmt3b estabelecem novos padrões de metilação - de novo Dnmt. Dnmt1 atua durante a replicação de DNA para copiar o padrão de metilação da cadeia parental para a nova cadeia sintetizada - Dnmt de manutenção. A perda de metilação de DNA - demetilação - é observada em diferentes contextos e pode ser:  Ativa - processo enzimático que remove ou modifica o grupo metil das citosinas; ocorre através de oxidação por uma família de proteínas designadas por ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenases (TET1 - TET3).  Passiva - perda de metilação de Cs durante rondas sucessivas de replicação, na ausência de mecanismos de manutenção de metilação. As proteínas TET oxidam a 5mC → 5fC → 5caC. Os derivados altamente oxidados de citosina são excisados pela timina DNA glicosilase (TDG), para regenerar o C não modificado. O genoma humano sofre 2 extensas remodelações de metilação CpG: no pós-fertilização e nas células germinativas primordiais (PGCs) do embrião q irão dar origem aos gâmetas, onde a metilação é praticamente removida do genoma. 35  As PGCs têm inicialmente altos níveis de metilação; demetilação global ocorre durante a expansão e migração de PGCs.  Antes do nascimento nos rapazes e depois do nascimento nas raparigas, metilação de novo estabelece padrões de metilação específicos do sexo nas células germinativas, incluindo a metilação em genes imprinted.  Pouco depois da fertilização, as marcas de metilação herdadas dos gâmetas são apagadas (exceto as dos genes imprinted).  Após a implantação do zigoto, uma nova vaga de metilação de novo estabelece os padrões de metilação no embrião. Metilação de DNA - genes imprinted Para a maioria dos genes herda-se 1 cópia de cada progenitor, mas para genes imprinted herda-se apenas 1 cópia funcional de um progenitor, sendo a outra cópia silenciada epigeneticamente. O alelo reprimido é metilado, e o alelo ativo é não metilado. Existem cerca de 100 genes imprinted, incluindo fatores de crescimento, fatores de transcrição, recetores, relacionados com o desenvolvimento placentário e fetal. A expressão de genes imprinted é indispensável para um normal desenvolvimento, crescimento e comportamento. Uma desregulação destes genes causa perturbações na diferenciação e desenvolvimento. Alguns genes foram identificados como causadores de rearranjos cromossomais e dissomias uniparentais - Síndrome de Prader-Willi e Síndrome Angelman. Síndrome de Prader-Willi  Associado a problemas cognitivos e comportamental, retardo mental, deficiência no desenvolvimento sexual e crescimento e obesidade. Causado por deleção de um grupo de genes herdados do pai. Síndrome de Angelman  Caracterizada por deficiências de desenvolvimento e mentais, convulsões, distúrbios do sono, hiperatividade e uma disposição alegre. Causado por deleção no cromossoma herdado da mãe. Os sintomas diferem, mas ambas são causadas por deleções indistinguíveis no cr 15, q contém genes q são expressos paternal ou maternalmente. Os casos Prader-Willi ocorrem por deleções de genes ou pq o indivíduo tem 2 cópias do cr 15 materno e nenhuma cópia do paterno - dissomia uniparental materna. 36 Metilação de DNA - inativação do cromossoma X A inativação do cr X é o silenciamento transcricional de um cr X em células femininas (XX), de modo a equalizar a dosagem de produto de genes do cr X entre indivíduos XX e XY. A inativação do cr X ocorre precocemente no desenvolvimento do embrião. Os 2 cr X têm igual probabilidade de serem silenciados; uma vez silenciado, o mm cr X permanece inativo em todas as gerações de células subsequentes a partir da mm célula - diferentes linhas celulares podem ter diferentes cr X inativados. O cr X inativado condensa-se numa estrutura compacta designada por corpúsculo de Barr, mantido num estado silenciado estável. Como resultado, cada indivíduo XX é um mosaico de células onde, ou o cr X herdado do pai, ou o cr X herdado da mãe, é silenciado. A inativação do cr X é iniciada por um RNA não codificante, XIST, e metilação de DNA é fortemente estabelecida nos promotores. Nos genes que escapam à inativação do cr X (escapistas), as CpG islands estão muitas vezes não-metiladas. Metilação de DNA - fatores ambientais Epialelos metaestáveis - alelos que são expressos variavelmente em indivíduos geneticamente idênticos, devido a alterações epigenéticas estabelecidas precocemente no desenvolvimento, e que são vulneráveis a fatores ambientais. Um ex de um epialelo metaestável é o gene Agouti, que codifica para uma molécula que promove uma coloração amarela na pelagem em ratos. O estado epigenético do alelo Avy é altamente variável, e determina um espetro de efeitos fenotípicos que podem ser alterados pela nutrição da mãe durante a gestação. Estas observações demonstraram q fatores externos (nutrição, stresse, compostos químicos, etc) podem alterar padrões de metilação com efeitos fenotípicos nas seguintes gerações. A nutrição materna pré-natal tem sido associada a diversas alterações de padrões de metilação transmitidas à geração seguinte, através de modificações na linha germinativa mas tb nas células somáticas. 37 A exposição ambiental a contaminantes durante o período pré-natal ou precocemente no desenvolvimento tb tem sido demonstrada como causa persistente de alterações nos padrões de metilação, com consequências na estrutura da cromatina e expressão de genes. Ex. Poluentes orgânicos persistentes, exposição a diferentes compostos tem sido associada com hipometilação ou hipermetilação global em diversas populações. Existem 2 hipóteses para explicar os efeitos ambientais na metilação de DNA: 1. Ação direta de fatores químicos nas funções das enzimas DNMT e TET. 2. Fatores químicos podem alterar a disponibilidade de SAM. A especificidade da metilação em genes particulares pode ser devida à ativação/inativação dos TFs por contaminantes ambientais: a) O binding dos TFs pode inibir as DNMTs de metilar um gene em particular, resultando em hipometilação. b) Repressão de TFs por contaminante ambiental, pode promover o acesso de DNMTs a um gene em particular, resultando em hipermetilação. A predisposição e iniciação de doenças cancerígenas envolvem fatores replicativos, hereditários e ambientais. Um controlo apropriado da metilação de DNA é crucial para a regulação da transcrição de genes, e tb para a manutenção da integridade do genoma e modulação da resposta imunitária. A transformação de células normais para células malignas deve-se a alterações genéticas e epigenéticas - sabe-se que células cancerígenas mostram uma perda global de metilação em regiões com baixa densidade de CpGs, elementos repetitivos, retrotransposões, ocorrendo simultaneamente uma hipermetilação específica em CpGs islands. Metilação de DNA - hereditariedade 1. Hereditariedade transgeracional de padrões de metilação Tem sido demonstrado q certas experiências/exposições a qq fator, na vida de um indivíduo, influenciam o desenvolvimento da sua descendência, e q padrões de expressão de genes podem ser alterados, influenciando:  Como o organismo responde a um determinado ambiente - efeito direto.  Como a informação é transmitida à descendência, e como isso irá influenciar a sua resposta a determinado ambiente - efeito indireto. 38 A hereditariedade epigenética intergeracional refere-se à transmissão de marcas epigenéticas de uma geração para a próxima; a passagem de informação epigenética de avós para netos é pelo lado transgeracional.  Fatores ambientais que afetem as grávidas (F0) podem afetar diretamente a geração seguinte (F1), e tb as suas células germinativas que representam a 2ª geração (F2).  Deste modo, se ocorrerem alterações na geração F3, são apenas devidas a hereditariedade epigenética “pura”.  Alterações epigenéticas na linha germinativa masculina podem mostrar hereditariedade epigenética pura logo na geração F2. Os padrões de metilação de DNA podem ser herdados (o modo de transmissão ainda é alvo de debate). Pré-requisitos para que os padrões de metilação possa ser herdados:  A metilação de DNA deve ser capaz de ser transmitida na divisão de células somáticas;  Os padrões de metilação devem ser transmitidos para a linha germinativa;  A metilação de DNA deve resistir à reprogramação que acontece nas células germinativas, e após a fertilização. 2 modelos de hereditariedade de metilação foram propostos:  Modelo escapista 1. Depois da fertilização, o genoma paterno sofre rápida demetilação ativa, enquanto o genoma materno sofre demetilação + lenta. Metilação de novo ocorre no blastocisto, enquanto os tecidos se começam a diferenciar; 2. Subsequentemente, uma demetilação + completa ocorre durante a migração das células germinativas primordiais (PGC) nas gónadas indiferenciadas; 3. No entanto, nem toda a metilação é eliminada, e algumas regiões escapam a este processo. Regiões promotoras, enhancers, regiões transcritas, e CpG islands, assim como elementos repetitivos e retrotransposões podem escapar à reprogramação da metilação, e ser transmitidos à geração seguinte. 39  Modelo de reconstrução Propõe que padrões de metilação induzidos ambientalmente possam ser parcialmente removidos qd transmitidos para a geração seguinte; Mm q o fenótipo observado possa desaparecer na geração F1, esse fenótipo pode reaparecer várias gerações + tarde depois de um pequeno estímulo ambiental, através de pequenos RNAs não codificantes e fatores de transcrição. 2. Hereditariedade não-genética  Refere-se a padrões de hereditariedade q não seguem as leis de segregação, q diz q um gene herdado dos progenitores é segregado com igual probabilidade durante a formação dos gâmetas.  Mecanismos epigenéticos de regulação de genes são normalmente entendidos como separados da transmissão das sequências de DNA; No entanto, estes mecanismos nunca poderão ser vistos como completamente independentes da sequência de DNA; por ex, a ação de uma marca de metilação é dependente das propriedades funcionais da sequência de DNA em determinados loci - se for no promotor, pode reprimir a expressão, mas se for na região codificante já não;  Por outro lado, mecanismos de regulação epigenética têm diversos níveis de independência da sequência - Ex: análise dos padrões de metilação em ambos os alelos de um gene revelaram que cerca de 10% de SNPs estão em regiões com diferenças na propensão para metilação de DNA entre os 2 alelos, o que sugere uma interdependência entre mecanismos genéticos e epigenéticos.  Compreende todos os mecanismos de hereditariedade, exceto a transmissão de alelos (variantes de DNA);  Embora a hereditariedade não genética seja tipicamente associada com experiências ou fatores ambientais vivenciados pelos progenitores, é importante perceber que mutações e variabilidade genética parentais, ao alterarem o “ambiente” molecular, podem tb resultar em fenótipos transmitidos não-geneticamente. Estudos têm demonstrado uma correlação direta entre doenças psiquiátricas e a presença de patologias na descendência; embora a herança genética seja difícil de descartar, a componente não genética é responsável por parte do fenótipo. -> Uma experiência traumática nos progenitores pode ter efeitos significativos na descendência. Ex: descendentes de sobreviventes do Holocausto apresentaram um decréscimo de metilação no gene FKBP5 no sangue; este gene é um importante regulador da sensibilidade do recetor de glicocorticóides e crítico na resposta ao stresse. O grau de metilação neste gene está associado com os níveis da hormona de stresse cortisol. 40 3. Hereditariedade não-mendeliana - doenças associadas a genes imprinted Hereditariedade não-Mendeliana inclui hereditariedade mitocondrial e imprinting - apenas 1 alelo parental é expresso, e a expressão é determinada por esse progenitor. (rever 1ª lei de Mendel) Imprinting é uma forma complexa de hereditariedade epigenética. Fatores que contribuem para a complexidade do imprinting é que pode ser dependente do tecido, pode ter um padrão temporal, e diferentes transcritos do mm gene podem ser imprinted ou não. 4. Hereditariedade não-mendeliana - doenças associadas a genes não imprinted Metilação de DNA e doenças autoimunes  Doenças autoimunes são causadas por uma baixa ou excessiva atividade do sistema imunitário. As células imunitárias são os alvos primários da doença, e são um bom modelo para estudar a relação entre metilação de DNA e fenótipos.  As baixas taxas de concordância em gémeos monozigóticos para muitas destas doenças, como artrite reumatoide (RA), lupus, e esclerose múltipla (MS) indicam que o ambiente ou a epigenética desempenham papéis importantes na doença.  Alterações na metilação podem mediar o risco genético de desenvolver certas doenças. Metilação de DNA e doenças metabólicas  Diabetes tipo 2 (T2BM) é uma doença complexa causada por fatores genéticos, epigenéticos e ambientais.  A comparação dos níveis de metilação nas ilhotas pancreáticas em pacientes com e sem T2BM revela uma série de locais com diferente padrão de metilação que levam a uma expressão génica diferencial. Metilação de DNA e doenças neurológicas  Alterações nos padrões de metilação estão associadas a várias doenças neurológicas, como a doença de Alzheimer, esquizofrenia e autismo.  Doença de Alzheimer: A hipermetilação (promoção) de genes relacionados à inflamação e ao metabolismo neuronal tem sido observada, enquanto a hipometilação (inibição) de genes associados à plasticidade sináptica pode contribuir para a progressão da doença.  Esquizofrenia: Vários genes revelam padrões de metilação alterados, o que pode influenciar a função dopaminérgica e a conectividade neural.  Autismo: Metilações anómalas identificadas em genes relacionados com o desenvolvimento cerebral como o MECP2, que é fundamental na regulação da expressão génica em neurónios. 41 Metilação de DNA e mosaicismo  Síndrome X Frágil - é a forma + comum de atraso intelectual e a causa monogénica + comum do espetro do autismo. Causada por uma expansão do trinucleótido CGG na 5’UTR do gene FMR1, levando a metilação de DNA, heterocromatinização aberrante e silenciamento do gene FMR1. Como consequência, a proteína FMRP não é produzida e a sua ausência leva ao aparecimento da síndrome.  O nº de repetições CGG pode ser normal (6-44 repetições), intermédio (45-54 repetições), pré-mutação (55-200 repetições) e mutação completa (+ de 200 repetições).  A expansão de CGG predispõe as repetições para instabilidade, resultando em “size mosaicism”, definido como a presença de ambas pré-mutação e mutação completa entre tipos celulares.  Alguns indivíduos exibem tb mosaicismo de metilação q ocorre qd algumas células transportam alelos metilados e algumas células alelos não-metilados (com um nº de repetições CGG entre pré-mutação e mutação completa).  O grau de metilação varia em ou entre tecidos do mm indivíduo, dando origem a intra ou inter-mosaicismo.  Os alelos não-metilados são transcricionalmente ativos, e em muitos casos sobre-expressos, produzindo FMRP. Os níveis de FMRP são negativamente correlacionados com o nº de repetições, e pré-mutação mostra expressão reduzida devido a diminuição da eficiência de tradução. Metilação de DNA - variabilidade populacional A diversidade epigenética natural tem sido um mecanismo chave em processos microevolutivos, devido à sua capacidade de criar variabilidade fenotípica em indivíduos e em populações. A diversidade epigenética constitui uma importante reserva de variação útil para uma rápida adaptação em resposta a estímulos ambientais. Análise comparativa de variações de metilação em diferentes populações revelaram especificidades de metilação em processos ligados ao tipo de dieta, exposição UVA e agentes patogénicos.  Os padrões de metilação de DNA em diferentes populações humanas mostram grande especificidade;  A metilação em +1000 CpGs é hereditária, e a heritabilidade tb difere entre populações;  Isto sugere q a metilação de DNA é divergente entre populações, o q pode ser devido a uma combinação de diferenças na frequência de alelos, interações gene x ambiente ou epistasias complexas (vários genes atuam sobre uma mm característica). 42  2ª Frequência Genética Hereditariedade  É “o que herdamos” dos nossos pais, que está contido nos nossos genes, transportados pelos cromossomas;  O DNA contém os genes que determinam a hereditariedade;  Genes contêm os códigos para a produção de proteínas;  A capacidade que os seres vivos têm de gerar seres semelhantes é chamada hereditariedade.  Os genes são pedaços do DNA responsáveis pelas características hereditárias.  Seres humanos são organismos diplóides, ie, os genes estão aos pares (alelos); todas as células têm 46 cromossomas, exceto os gâmetas que têm apenas 23.  Cada ser vivo contém pares de genes, originados no zigoto, qd o gâmeta feminino (óvulo) é fecundado pelo masculino (espermatozóide); Durante a fertilização, a mãe e o pai doam de forma aleatória, cada um, metade do seu capital genético para criar o do seu filho.  Cada gene oriundo de um dos progenitores (mãe ou pai) é denominado alelo. Os genes alelos não se misturam nos descendentes, mas formam os pares e separam -se durante a formação dos gâmetas (gametogénese).  Assim, temos 2 cópias de cada gene: uma é dada pelo pai e outra pela mãe. Essas 2 cópias podem conter informações diferentes. Existem biliões de combinações e cada indivíduo é único. É por isso que somos todos diferentes;  Uma doença genética pode ser causada por uma anomalia genética no nível do gene (mutação) ou no nível do cromossoma (esta pode ser herdada).  O genótipo é a constituição genética do indivíduo. Todas as células apresentam o mm material genético.  O fenótipo é a expressão visível do genótipo.  As leis de Mendel são fundamentais para a compreensão da hereditariedade: Permitem prever risco de recorrência Testes predizentes Possibilitam antecipar terapia génica Frequência caraterística Princípios Básicos  As 2 posições homólogas de um par de cromossomas constituem um locus;  Cada locus é ocupado por 2 alelos, ie, 2 formas alternativas de um gene (uma herdada do pai, outra da mãe). Homozigotia - Qd uma pessoa tem um par de alelos idênticos em um locus do DNA nuclear. Heterozigotia - Qd os alelos são diferentes e um deles é do tipo selvagem. Hemizigotia - Qd um homem apresenta um alelo anormal para um gene localizado no cromossoma X e não há outra cópia do gene.  Diferentemente das 2 cópias de cada gene em uma célula diploide, as moléculas do DNA mitocondrial e os genes codificados pelo genoma mitocondrial apresentam dezenas de milhares de cópias em cada célula. Por isso, os termos homozigoto, heterozigoto e hemizigoto não são utilizados para descrever genótipos nos loci mitocondriais. Página 1 de 41  2ª Frequência Genética Genótipo  Para os loci autossómicos (e ligados ao X nas mulheres), o genótipo de uma pessoa em um determinado locus é constituído por ambos os alelos que ocupam aquele locus nos 2 cromossomas homólogos.  São todos os pares de alelos que compõem de forma coletiva a constituição genética de um indivíduo ao longo de todo o genoma.  Informação codificada no genoma. Haplótipo  Conjunto de alelos em 2 ou + loci próximos em um cromossoma do par de homólogos. Fenótipo  A expressão do genótipo como um traço morfológico, podendo ser observado clinicamente ou apenas através de exames sanguíneos ou histológicos.  Pode ser uma variável discreta, como a presença ou ausência de uma doença, ou pode ser uma medida mensurável, como o índice de massa corporal ou a glicemia.  Pode ser tt normal qt anormal em um determinado indivíduo. Penetrância  Presença ou ausência de um fenótipo.  Completa - Frequência da expressão do fenótipo é 100%, ao nascimento ou durante a vida.  Incompleta - Frequência da expressão do fenótipo é menor do que 100%. Expressividade  Gravidade da expressão do fenótipo entre os indivíduos que têm o mm genótipo deletério.  Invariável ou Uniforme - a mm gravidade para o mm genótipo.  Variável - diferente gravidade (grau) para o mm genótipo. O mm genótipo não dá o mm fenótipo - Combinação de alelos de um determinado locus, composição genética de um organismo.  Genótipo = genoma + epigenoma (reguladores da expressão dos genes codificados no genoma e atuam combinados). Genoma igual nos 200 tipos diferentes de células, mas as suas diferentes funções acontecem por diferentes genes serem selecionados em cada um deles.  Fenótipo = transcriptoma + proteoma + metaboloma. É o conjunto de carateres morfológicos, fisiológicos e comportamentais de um indivíduo. É a expressão de um determinado genótipo em interação com o ambiente. Página 2 de 41  2ª Frequência Genética Mosaicismo  Qd o erro ocorre em uma divisão celular posterior à formação do zigoto (não disjunção mitótica nas 1as divisões).  Assim, algumas células do corpo do indivíduo terão um nº normal de cromossomas e outras terão 1 cromossoma a +. Corresponde a 1,5% dos portadores da trissomia 21. Distribuição etiológica das doenças  Causas ambientais o Infeções; o Deficiências alimentares.  Causas genéticas o Cromossómicas 0.6% o Monogénicas 1.4% - Cancros, hemofilia e drepanocitose.  Causas multifatoriais (a maioria) - Fenótipo raramente depende da expressão de 1 só gene, mas sobretudo da interação entre produtos do gene (30-40.000) e o meio. o Malformações congénitas 0.6% o Doenças crónicas do adulto 5% o Inteligência o Comportamento o Estatura o Diabetes o Vários cancros Doença genética diferente de hereditário  Maioria das doenças genéticas é adquirida;  Pode ocorrer após o nascimento (maioria dos cancros);  Familiar (maior frequência numa família) diferente de genético ou hereditário Cancro do escroto em limpa-chaminés (falta de higiene) Partilha de ambiente (social, alimentar e cultural) pode simular erro genético numa família.  Congénito diferente de hereditário Exemplo de erro na meiose Alterações genéticas  Cromossómicas numéricas;  Cromossómicas estruturais;  Génicas Monogénicas Mendelianas Não mendelianas Página 3 de 41  2ª Frequência Genética Alterações cromossómicas numéricas 1. Euploidias (não compatível com a vida)  Alterações numéricas em que todo o genoma é alterado, ie, alteram o conjunto de cromossomas.  Conjuntos cromossómicos extras: triplóide (3N), tetraplóide (4N). 2. Aneuploidias  Alterações que envolvem diminuição ou aumento em um determinado par de cromossomas.  Decorrentes de processos de não disjunção (erros na divisão celular) que ocorrem durante a formação dos gâmetas na meiose I ou II. Isto faz com que uma célula fique com excesso ou falta de cromossomas.  Na meiose I, um cromossoma homólogo pode não se separar, formando assim uma célula com 1 cr a + e outra com 1 cr a menos. A não disjunção pode ocorrer tb na meiose II e, nesse caso, não ocorre a separação dos cromatídeos. Tipos de aneuploidias:  Monossomia ou hipodiploidia (2n-1): Perda de 1 cromossoma do mm par (ex: síndrome de Turner - cariótipo 45, X- baixa estatura, pescoço alado, infertilidade e problemas no desenvolvimento dos órgãos sexuais, incluindo atraso no ciclo menstrual);  Nulissomia (2n-2): Perda de 2 cromossomas do mm par; Trissomia ou hiperdiploidia (2n+1): Ganho de 1 cromossoma no genoma. 3. Relacionadas com a divisão celular  Processo de reprodução celular em que uma célula se divide para formar outras.  É responsável pela reprodução, crescimento e regeneração das células.  Antes de se dividir, a célula precisa duplicar (replicar) o material genético e iniciar a interfase. ✓ Fase G1: ocorre o crescimento celular, o aumento de organelos, a síntese de RNA e proteínas; no final desta fase, existe um ponto de verificação para avaliar se está tudo conforme o esperado antes de seguir adiante. ✓ Fase S: fase + longa e + importante da interfase; ocorre a duplicação do DNA e dos centríolos. ✓ Fase G2: o