Pediatría-Tema 4: Introducción a la Genética Clínica (Curso 2020-2021) PDF

Pediatría Elena Aldana, Lourdes Galán, Celia García, Curso 2020-2021 Antonio Gil y Laura López TEMA 4: INTRODUCCIÓN A LA GENÉTICA CLÍNICA. ESTUDIO...

Pediatría Elena Aldana, Lourdes Galán, Celia García, Curso 2020-2021 Antonio Gil y Laura López TEMA 4: INTRODUCCIÓN A LA GENÉTICA CLÍNICA. ESTUDIO GENÉTICO DR. ENRIQUE GALÁN GÓMEZ Un estudio genético incluye una serie de apartados que se desarrollarán a lo largo del tema. No siempre significa hacer test de laboratorio. Se resumen en: Historia clínica dirigida. Exploración clínica general. Exploración clínica específica, destinada a la valoración de rasgos dismórficos. Estos rasgos físicos se salen de la normalidad, como podría ser el labio leporino, la sindactilia o el hipertelorismo. Exámenes complementarios destinados al diagnóstico y estudio de las enfermedades genéticas, en función de la sintomatología y la historia clínica para ayudarnos a diagnosticar la enfermedad genética. 1. HISTORIA CLÍNICA Y CONSTRUCCIÓN DEL PEDIGREE Consiste en una serie de símbolos que están aceptados internacionalmente que nos ayudan a ver si hay enfermedades o ponernos en el punto de partida para ayudarnos a hacer el diagnóstico. Se comienza por una recopilación de informes que tiene el paciente u otros miembros de la familia afectados. El paciente afectado se denomina probando. Se lleva a cabo la historia clínica del probando y de todo aquel familiar que esté afecto. Una vez que tenemos la historia clínica, se realiza el pedigree o arból genealógico, un diagrama esquemático de la familia que nos proporciona de forma gráfica la relación entre los diferentes miembros de dicha familia y un resumen breve de algunas enfermedades que podrían tener un significado genético. Presenta las siguientes características: o Es de fácil interpretación. o Presenta un formato compacto. o Se representa con símbolos. Los oscuros (sombreados) se refieren a los individuos afectados. Para entenderlo un poco mejor, aquí una definición: Un pedigree es un documento que analiza las relaciones genealógicas de un ser vivo en el contexto de determinar cómo una cierta característica o fenotipo se hereda y manifiesta. Es un gráfico escrito en forma similar a un árbol genealógico, en el cual se detalla por medio de una simbología consensuada, la aparición de un determinado fenotipo a lo largo de la historia natural de una familia. Con frecuencia los diagramas de pedigrí comprenden cuatro generaciones, pero un buen diagrama de pedigrí debería contener todas las que resultara posible rastrear. Página 1 de 18 Pediatría Elena Aldana, Lourdes Galán, Celia García, Curso 2020-2021 Antonio Gil y Laura López A la espera de un diagnóstico clínico, el árbol genealógico se debe usar para saber si existe algún patrón hereditario compatible con dicho pedigree, pero tiene la limitación de que puedan existir mutaciones de novo, lo cual solo permite al médico basarse en el diagnóstico clínico. 1.1. HERENCIA AUTOSÓMICA DOMINANTE (HAD) Se caracteriza por: Afectos en todas las generaciones. Afectos en ambos sexos. Se transmite al 50%. Normalmente el razonamiento ante una enfermedad autosómica dominante es creer que se van a tener 50% de hijos sanos y 50% de hijos enfermos; pero lo cierto es que lo que significa realmente es que para cada hijo hay un 50% de probabilidad de nacer enfermo. Claramente, la aleatoriedad implica que eso no se cumpla en la realidad. 1.2. PUNTOS A VALORAR EN LA HISTORIA FAMILIAR Historia parental: o Edad de los padres en el momento de la concepción (la edad de la madre se asocia a anomalías cromosómicas por la no disyunción). o Ocupación y hábitos de los padres (sobre todo por la posible exposición materna a determinados agentes). o Salud general de los padres. o Historia y evolución de los embarazos anteriores. Historia gestacional: o Factores maternos. o Factores fetales. Parto (sobre todo en relación a la discapacidad). Es muy importante, sobre todo si hubo sufrimiento perinatal. o Duración del parto, trabajo de parto y posibles distocias. o Presencia de sufrimiento fetal, necesidad o no de reanimación, puntuación del test de Apgar. Periodo neonatal: dura 28 días y durante este, el bebé está expuesto a mayores complicaciones. o Estado neonatal. o Alimentación. Página 2 de 18 Pediatría Elena Aldana, Lourdes Galán, Celia García, Curso 2020-2021 Antonio Gil y Laura López o Ganancia ponderal. o Signos neurológicos de alerta: hipotonía, microcefalia… o Olores especiales en la orina (los cuales han perdido valor por los estudios actuales de screening neonatal.). o Infecciones. Tenemos que tener presente la posibilidad de infecciones, y tener en cuenta que cuanto más pequeño es, menos capacidad tiene el niño a luchar contra las infecciones. El sistema nervioso del niño no está formado por completo a nivel funcional, madura durante dos años. Historia evolutiva del paciente: nos orientará mucho en el diagnóstico. o Salud general. o Crecimiento y desarrollo físico y motor. o Comportamiento y conductas. 1.3. ÁRBOL GENEALÓGICO El árbol genealógico es una herramienta importante porque podemos encontrar antecedentes de herencia poligénica o monogénica; pero también puede haber antecedentes negativos relacionados con los siguientes puntos: La edad materna elevada (cromosomopatías) y paterna elevada (mutaciones de novo en casos de herencia AD o dominante ligada al X). La consanguinidad, donde el parentesco hace que se comparta más genes entre la madre y el padre haciendo que el riesgo de enfermedad recesiva sea mucho mayor al presentar el niño el gen repetido, sobre todo de enfermedades metabólicas y neurológicas. Los abortos de repetición que sirven para determinar anomalía cromosómica balanceada o herencia ligada al X. En la herencia ligada a X, el hombre es hemicigoto con respecto a la mujer, de forma que cuando hay una enfermedad ligada al X presente en un hombre, aunque solo haya un alelo, la transmitirá siempre. Por eso en las enfermedades de este tipo (20 o 30, no más) se presentan como abortos espontáneos de los varones. Página 3 de 18 Pediatría Elena Aldana, Lourdes Galán, Celia García, Curso 2020-2021 Antonio Gil y Laura López Exposición a teratógenos (SAF, S, Hidantoínico, S Warfarínico, etc): son agentes de origen ambiental que afectan a la gestación y generan problemas en el neonato. Pueden ser fármacos, infecciones, alcohol… 2. EXPLORACIÓN FÍSICA GENERAL Y ESPECÍFICA (este punto no se ha dado) A través del estudio de la genealogía, se observará si hay antecedentes familiares o no, lo cual permite orientar el diagnóstico. El estudio genético también debe incluir: Generalmente lo haremos de forma ordenada, como por ejemplo, de forma cráneo-caudal. La antropometría no solo valora peso y talla, sino también otra serie de parámetros como: Perímetro cefálico: es la medida del contorno de la cabeza en su parte más ancha, por encima de las orejas y las cejas. Su crecimiento se evalúa hasta los 24 meses para comprobar el buen desarrollo del bebé. Los extremos patológicos se consideran p98 (macrocefalia). Longitud de manos y palmas. Distancias intercantales interna y externa, longitud de pabellón auricular. Distancia intermamilar, etc. Esto lo pondremos en percentiles según edad y sexo para así poder ver las proporciones. 3. DIAGNÓSTICO a) Considerar un síndrome. b) Considerar información, signos y síntomas patognomónicos que nos permitan orientarnos. c) Considerar signos y síntomas guía. Por ejemplo, el fenómeno miotónico del Síndrome de Steinert sería un signo guía, en el que el RN presenta hipotonía severa y la madre tiene la cara alargada, los ojos caídos y no suelta la mano cuando se la damos (es una de las principales causas de hipotonía en el RN). d) Valoración de los familiares. Es muy importante, ya que vienen a la consulta a acompañar a familiares y nos puede ayudar a ver qué ocurre. e) Consultar catálogos y bases de datos, así como con otros especialistas. Página 4 de 18 Pediatría Elena Aldana, Lourdes Galán, Celia García, Curso 2020-2021 Antonio Gil y Laura López 3.1. EDAD DE LOS PROGENITORES (dado muy por encima) Se trata de un factor muy relevante: Edad paterna avanzada se asocia a mutaciones de novo en enfermedades AD (acondroplasia, Marfan, Apert…) Edad materna avanzada se asocia a anomalías cromosómicas (no disyunción). Existe mayor riesgo de mala división de los cromosomas y por tanto que haya fallos en el número de los cromosomas. Recuerda… Se denomina "disyunción" a la separación o segregación de ambos miembros de un par de cromosomas homólogos durante la meiosis. Por error, dos cromosomas homólogos pueden migrar al mismo polo en la anafase generando gametos con un cromosoma de más (n+1) y el otro gameto con uno de menos (n-1). A esto se le denomina "no disyunción". Estos gametos anormales pueden ser fecundados por uno normal y generar embriones con 2n+1 cromosomas (trisómicos como en el síndrome de Down) o monósomicos (con un cromosoma de menos) 2n-1, los cuales generalmente son inviables. 3.2. RASGOS DISMÓRFICOS Nos referimos a rasgos dismórficos estructurales en relación con variaciones de la normalidad, como por ejemplo la distancia entre los ángulos internos del ojo aumentada, las orejas pequeñas, el labio leporino… los cuales nos pueden orientar a enfermedades genéticas importantes. Tienen gran valor en el diagnóstico y nos ayudará a pedir exámenes complementarios y a saber cuál es el mecanismo patológico de esa entidad y saber el riesgo de recurrencia. Son uno de los principales motivos de consulta, sobre todo en neonatología, pero también en pediatría. La utilidad de la valoración dismorfológica en el RN radica en: Valor primordial en el diagnóstico. Utilidad diagnóstica para orientar la petición de exámenes complementarios. Caracterización del mecanismo patogénico: orientación del pronóstico y riesgo de recurrencia. En los padres suele haber gran preocupación por saber si esto podría ocurrir en otro hijo, por ejemplo. 3.3. SIGNOS CLÍNICOS QUE ORIENTAN UN DIAGNÓSTICO (no dado este año) Existen multitud de signos clínicos que representan un valor fundamental para el diagnóstico, pruebas complementarias y dar un asesoramiento genético. En la tabla de la izquieda aparecen algunos ejemplos (que NO hay que sabérselos). Página 5 de 18 Pediatría Elena Aldana, Lourdes Galán, Celia García, Curso 2020-2021 Antonio Gil y Laura López Por ejemplo si nos encontramos un niño con un mechón de pelo blanco y manchas en el abdomen, importante pensar en Piebaldismo y otras alteraciones genéticas menos frecuentes. O tb puede ser un Fernandismo. 4. SISTEMA DE ANÁLISIS PARA IDENTIFICAR ANOMALÍAS GENÉTICAS (CROMOSÓMICAS CRÍPTICAS, GÉNICAS) La genética se ha desproporcionado en gran medida debido al avance magnífico de la biología molecular en los últimos años. En la actualidad, en la clínica, hay una posibilidad diagnóstica enorme gracias a los nuevos tests diagnósticos, pero son tan novedosos que en ocasiones ni siquiera sabemos interpretarlos correctamente, lo cual está suponiendo un gran problema. Nos han permitido diagnosticar en los últimos 20 años enfermedades que no podíamos diagnosticar hasta entonces. La primera fue el cariotipo, que fue la primera herramienta diagnóstica, aunque desde hace 10 años ésta ha quedado relegada a determinados procesos, sustituyéndose por otras herramientas diagnósticas. A lo que quiere llegar con esto es a que no debemos pedir pruebas a lo loco. En muchas ocasiones, se realizan pruebas genéticas de secuenciación masiva con la que se obtienen datos que no tienen nada de relación con la clínica del paciente y que, además, no se saben interpretar. Los exámenes complementarios para detectar anomalías cromosómicas o genéticas crípticas son: a) Cariotipo de alta resolución. b) Hibridación fluorescente in situ. c) CGH (ésta junto a las 2 anteriores son pruebas de utilidad escasa en la actualidad). d) MLPA. e) Array CGH. f) Secuenciación de nueva generación. 4.1. CARIOTIPO DE ALTA RESOLUCIÓN (de la tabla de este punto no se ha dado ni dicho nada!!) El cariotipo es el estudio de la distribución ordenada de los cromosomas en metafase. En la actualidad, la utilidad del cariotipo prácticamente ha desaparecido y ha ido siendo sustituido por las otras técnicas, de forma que ahora mismo la primera herramienta útil en el estudio de niños con defectos congénitos y sobre todo deficiencias y retraso mental es el arrayCGH, pero seguramente esto cambie con el tiempo. Las indicaciones del cariotipo se recogen en la siguiente tabla (no hace falta aprendérselo): PERIODO CONDICIONES PERIODO CONDICIONES Preescolar- escolar - Edad > 35 años. - Ansiedad materna. Prenatal - Triple screening alterado. - Trastornos del crecimiento. - Oligoamnios/polihidamnios. - Retraso psicomotor. - Rasgos dismórficos. - Crecimiento intrauterino retardado (CIR). Página 6 de 18 Pediatría Elena Aldana, Lourdes Galán, Celia García, Curso 2020-2021 Antonio Gil y Laura López - Arteria umbilical única. - Ginecomastia. - Sospecha ecográfica de Adolescencia - Falta de desarrollo puberal. cromosomopatía - Amenorrea primaria o - Antecedente de cromosomopatía secundaria. balanceada en un progenitor - Retraso mental. - Rasgos dismórficos. - Malformaciones mayores aisladas. - Padres de niños con - Presencia de ≥ 3 defectos congénitos anomalías cromosómicas menores. estructurales. - RN con rasgos dismórficos. - Abortos de repetición. Neonatal Adulto - RN con genitales ambiguos. - Infertilidad inexplicable. - Parto con producto muerto de causa - Diagnóstico prenatal con inexplicable. líquido amniótico y biopsia - Muerte neonatal de causa de corion. inexplicada. - Rasgos dismórficos. - Niños con dificultades para el Todas las edades - Procesos malignos aprendizaje. (cariotipo constitucional y Lactancia - Niños con rasgos dismórficos. tumoral). - Niños con retraso psicomotor. - Control de los trasplantes de médula ósea. Distinguimos dos tipos de cariotipo: Cariotipo de resolución de 800 bandas: para pequeñas deleciones o duplicaciones. En este campo también interviene la citogenética molecular. Actualmente el cariotipo solo está indicado para síndromes cromosómicos clásicos, casos de aborto de repetición o cuando tenemos claro que en una familia hay individuos que tiene una anomalía cromosómica balanceada. 4.2. HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU (FISH) Es una técnica que permite la determinación del número y localización de determinadas secuencias de ADN en las células humanas en interfase y en los cromosomas en metafase. Se comenzó a usar cuando había mala calidad de los cariotipos en estudios de médula ósea, en tumores, en fragmentos demasiado pequeños de ADN… Se basa en la complementariedad entre dos cadenas de ADN de doble hélice, una cadena procederá del ADN problema y otra se obtendrá de forma artificial a partir de preparaciones de citogenética estándar o preparaciones de células en división procedentes de la médula ósea, piel, tumores y tejidos prenatales, la cual Página 7 de 18 Pediatría Elena Aldana, Lourdes Galán, Celia García, Curso 2020-2021 Antonio Gil y Laura López marcaremos. Una vez que ambas cadenas se hibridan, se determina el número de cromosomas o regiones cromosómicas por el contaje de señales que aparezcan por fluorescencia. ➔ Con la FISH se puede detectar hasta 1-10 kb. El procedimiento se basa en lo siguiente: Al ADN fijado en un porta se le añade una sonda complementaria que habremos marcado previamente. Se desnaturalizan ambos (ADN y sonda) mediante calor o formamida y, a 37ºC se vuelven a hibridar las cadenas, haciendo que una cadena de la sonda se una a una cadena del ADN original. De este modo, al microscopio se hacen visibles aquellos puntos en los que las bases nitrogenadas de ambas cadenas se complementan. En la actualidad, la FISH se usa menos y muchas veces es para comprobar algo demostrado previamente mediante CGH. Solo permite ver un punto determinado y actualmente a veces se utiliza para comprobar los arrays. Las utilidades de la FISH son: Identificación de un marcador. Identificación de translocaciones no balanceadas de novo. Identificación de regiones balanceadas anormalmente. Diagnóstico prenatal de aneuploidías. Deleciones y duplicaciones. Estudios directos sin cultivos, población original y clones. Células en interfase. Es una técnica rápida. 4.3. HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARATICA (CGH) Fue el primer test de screening ya que es una técnica que permite la identificación de ganancia o pérdida cromosómica mediante un rastreo del genoma completo que se hace en una sola etapa. Fue la técnica que constituyó el punto de partida para el análisis del genoma completo. Se basa en la hibridación in situ del ADN marcado de la muestra con metafases humanas de un individuo normal (colores fluorescentes diferentes) y puede calcularse la ganancia o pérdida de material cromosómico según la relación de los fluorocromos. Otro paciente se sometía a hibridación con este ADN normal y podíamos ver a través de unas cámaras si había deleciones o duplicaciones de material genético. Página 8 de 18 Pediatría Elena Aldana, Lourdes Galán, Celia García, Curso 2020-2021 Antonio Gil y Laura López Para saber un poco más… Esta técnica implica el aislamiento de ADN de las dos fuentes a comparar, comúnmente la referencia y una muestra, el etiquetado independiente de cada muestra de ADN con diferentes fluoróforos (moléculas fluorescentes) de distintos colores (generalmente rojo y verde), la desnaturalización del ADN para volverlo monocatenario y la hibridación de las dos muestras resultantes en una proporción de 1:1 para una propagación normal de cromosomas en metafase, a los cuales las muestras de ADN marcadas se unirán en su locus de origen. A continuación, las señales fluorescentes de colores se comparan con el uso de un microscopio de fluorescencia y un software, esto a la longitud de onda de cada cromosoma para identificar las diferencias cromosómicas entre las dos muestras. Una mayor intensidad de color proveniente de la muestra de prueba en una región específica de un cromosoma indica la ganancia de material en esa región, mientras que una mayor intensidad de color de la muestra de referencia indica la pérdida de material en la muestra de ensayo en una región específica. Un color neutro (amarillo cuando las etiquetas de fluoróforos son de color rojo y verde) indica que no hay diferencia entre las dos muestras en esa región. ➔ CGH se complementa con el FISH y su sensibilidad es de 2-10 Mb. La CGH se aplica en casos de: Identificación de pérdida o ganancia del material cromosómico, y las sitúa en sus puntos de ruptura. Material cromosómico extra no identificado. Cultivos incorrectos, incompletos o de mala calidad. Esta técnica fue la base para el desarrollo de los arrays-CGH. A partir de 2010, el arrays-CGH la ha desplazado. 4.4. aCGH (ARRAY-CGH) (hablaremos mucho de esto en la asignatura, prestar atención) Es una técnica que parte de la CGH y permite la realización completa del genoma dirigido a detectar alteraciones desequilibras en el material genético sin que conozcamos previamente su localización concreta. No solo puede ver la pérdida o ganancia de material complementario, también, cambios balanceados. NO se van a mandar siempre. Los arrays se han constituido de una variedad de sustratos de ADN, que incluyen oligonucleóticdos, ADNs complementarios y cromosomas artificiales bacterianos. Pueden cubrir todo el genoma o ser dirigidos a determinados locis, telómeros o regiones periocentroméricas. Detecta cambios en el ADN de múltiples loci en 1 solo test. También detecta deleciones y/o duplicaciones de material cromosómico con una gran sensibilidad y de una forma más eficaz que el FISH. El FISH se usa para confirmar un diagnóstico clínico, pero el aCGH NO requiere un clínico experto que sospeche el diagnóstico. Es importante saber que la FISH va dirigida a un gen, pero el array observa el material genético completo (aunque tiene la posibilidad de dirigirse). Página 9 de 18 Pediatría Elena Aldana, Lourdes Galán, Celia García, Curso 2020-2021 Antonio Gil y Laura López 4.4.1. NUEVOS SÍNDROMES CROMOSÓMICOS Gracias a las técnicas actuales, se han descubierto nuevos síndromes cromosómicos que antes no se conocían: Microdeleción 9q: en la tabla inferior se recogen los principales hallazgos clínicos. Nos podía recordar en algunos casos a mucopolisacaridosis o incluso a síndrome de Down. Deleción 1p36: aproximadamente aparece en 1/5000 RN vivos y es la deleción terminal más frecuente observada en humanos, aproximadamente como el Síndrome de Turner. Se trata de un síndrome bien definido que cursa con retraso del desarrollo, hipoacusia, cardiopatía congénita, crisis convulsivas, retraso del crecimiento, hipotonía… En un artículo publicado en mayo del 2010, se concluyó que la herramienta diagnóstica con mayor rendimiento para chicos con desórdenes de espectro autista, múltiples anomalías congénitas, y retraso inexplicado del desarrollo o discapacidad intelectual, es el aCGH. Como ya dijimos anteriormente, actualmente el cariotipo por bandas G debe hacerse en pacientes con síndromes cromosómicos claros (como por ejemplo en síndrome de Down), con historia de abortos de repetición o historia familiar con reordenamiento cromosómicos. Página 10 de 18 Pediatría Elena Aldana, Lourdes Galán, Celia García, Curso 2020-2021 Antonio Gil y Laura López Las recomendaciones para el uso clínico de los arrays-CGH desde el año 2012 son: 1) Los arrays-CGH deben tener una cobertura uniforme de todo el genoma para detectar áreas de desequilibrios en cualquier localización de, por lo menos, 3-5 Mb, pero se recomienda que se puedan analizar regiones de, al menos, 400 Kb. 2) Los arrays-CGH deberán estar disponibles como primera opción de rutina de laboratorio para la evaluación diagnóstica de los pacientes con retraso mental/discapacidad intelectual, trastornos del espectro autista y anomalías congénitas múltiples. 3) Los arrays-CGH orientados a regiones conocidas de patologías bien descritas podrán aplicarse al diagnóstico prenatal. 4) Los arrays-CGH deberían ser solicitados e interpretados por profesionales de la salud capaces de transmitir la información al paciente y/o a su familia, y de llevar a cabo un asesoramiento genético. 5) Los arrays-CGH deberían ser informados por citogenetistas, genetistas moleculares o genetistas clínicos con entrenamiento suficiente en genética humana y con experiencia demostrada en citogenética o genética molecular humana. 4.4.2. SIGNIFICADO DE LOS TIPOS DE VARIACIONES Cuando hacemos un array y obtenemos variaciones en el material genético, estas pueden ser: Benignas (reportadas anteriormente y categorizadas como normales). Ya tenemos disponibles cientos de bases de datos de todas las etnias por lo que lo comparamos y puede ser que esta variante sea benigna, lo tiene la población general sana. Patológicas (reportadas anteriormente y categorizadas como anormales). Al compararlo con base de datos, vemos que indica enfermedad. VUS (Variants of Unkwon Significant). Regiones que no sabemos si pueden ser patológicas o no para ese paciente, lo cual implica: o Ver si es grande para ver si afecta a genes sospechosos y ver si afecta a los padres. o Ver cómo se ha conservado a lo largo de la evolución de las especies. o Ver cómo altera la proteína que codifica esos genes. ▪ Observar cómo repercute esa alteración en ese gen o genes: si va a dar lugar a una proteína anormal o va a cambiar una determinada proteína, claramente el efecto será patológico. Página 11 de 18 Pediatría Elena Aldana, Lourdes Galán, Celia García, Curso 2020-2021 Antonio Gil y Laura López ▪ Si es una zona conservada a lo largo de la evolución probablemente también será patológico. ▪ Si afecta a una serie de genes grande tanto en exceso como en defecto o incluso afecta a una región importante del gen, probablemente será patológico. ▪ Además, existen algoritmos matemáticos que ayudan a decidir si ese descubrimiento en el array es patológico o no. Ante un array de significado incierto debemos hacer porque si uno de los padres tiene la misma variación y está sano, probablemente ese Array no es el responsable de la patología del hijo Hay que tener en cuenta que esto es cambiante y lo que hoy es incierto podrá ser patogénico en unos años. ➔ CNVS (COPY NUMBER VARIATION) Es la cantidad de copias de un determinado fragmento (14% genes) en el genotipo de un individuo: duplicaciones o deleciones de pequeños fragmentos de genes, que incluye fragmentos de ADN de >1 Kb. Sirven para estudiar genes o polimorfismos. La mayor parte de los casos hay duplicaciones en tándem que no significan nada, pero en un 12-14% de los casos se asocia a errores. ➔ SNPS (este año no se ha dado) Son pequeños cambios genéticos que ocurren en la secuencia del ADN de una persona. Se basa en el estudio de cambios de bases. Habitualmente estudian polimorfismos. Debe haber más de 10.000.000 de cambios en genes, tanto en regiones codificantes o no codificantes (sobre todo) de proteínas. 4.5. MLPA Es una nueva técnica utilizada para detectar el número de copias de genes y estudios de metilación de detección de SNPs mediante un kit que incluía un grupo de genes que tenían relación con una enfermedad. Estas técnicas tienen la ventaja de poder analizar numerosos loci en una reacción y cuantificarlos, es decir nos permite ver varios grupos de genes con relación entre ellos. Sirve para el estudio de: Deleciones subteloméricas. Microdeleciones. Síndromes de genes contiguos. 4.6. SECUENCIACIÓN SANGER La secuenciación Sanger se ha quedado obsoleta, ya que se realiza gen a gen, por lo que es lenta y cara. 4.6.1. LIMITACIONES DE LAS TECNOLOGÍAS ACTUALES- SANGER Genes grandes con altos costes. Heterogeneidad genética. o Enfermedades con muchos genes. o Dificultad para el diagnóstico diferencial. Página 12 de 18 Pediatría Elena Aldana, Lourdes Galán, Celia García, Curso 2020-2021 Antonio Gil y Laura López NO sirve para la identificación de genes de enfermedades complejas y multifactoriales. o Dificultad para el diagnóstico genético. 4.7. SECUENCIACIÓN DE NUEVA GENERACIÓN (NGS, NEXT GENERATION SEQUENCING) O SECUENCIACIÓN MASIVA El estudio en genética, hasta ahora, era siempre dirigido: se debía tener una sospecha sindrómica para buscar si el gen o genes que sospechamos están alterados. Actualmente, aunque seguimos pensando que el estudio genético debe ser en muchos casos dirigido (es cierto que ciertos signos y síntomas nos pueden orientar a un síndrome en concreto, para lo cual es mucho más sencillo y barato emplear técnicas dirigidas), hoy día se pueden realizar estudios de screening revisando el material genético completo. El principal problema de estas técnicas masivas de ADN es que siguen siendo de difícil interpretación: un array de un niño con sospecha de enfermedad cromosómica puede salir alterado, sin embargo, el padre o la madre podrían llegar a presentar esa misma variación y ser completamente sanos; ¿qué implicaría eso? Implicaría la participación de otros genes, la epigenética, factores ambientales… que han llevado a que esa alteración se manifieste en ese niño, pero no en sus padres. Los avances tecnológicos de los últimos 5 años han conducido al desarrollo de la secuenciación de nueva generación (next generation sequencing: NGS) la cual es más rápida, segura y barata. La Secuenciación masiva, al contrario que el array (donde la secuenciación debía hacerse gen a gen), tiene el potencial de detectar todos los tipos de variación genómica en un único experimento, incluyendo: Mutaciones puntuales. Variantes de nucleótido único. Pequeñas inserciones y deleciones. Anomalías estructurales (no todas): o Equilibradas: inversiones y traslocaciones. o No equilibradas: deleciones y duplicaciones. Esta secuenciación tiene diversas técnicas: Secuenciación dirigida: se emplea solo para los loci de interés. Es posible optimizarlo para estudiar un único trastorno causado por mutaciones en múltiples genes. Es decir, está indicada hacia un grupo concreto de genes que producen unos determinados tipos de síndromes. Secuenciación del exoma: se secuencian todos los genes que generan enfermedad en humanos. A pesar de que actualmente es más cara que secuenciar un grupo reducido y específico de genes, es también muchos más barata que secuenciar un genoma completo. Secuenciación del genoma completo: se secuencian todos los genes que tiene el genoma humano, no solo aquellos que producen enfermedad. Página 13 de 18 Pediatría Elena Aldana, Lourdes Galán, Celia García, Curso 2020-2021 Antonio Gil y Laura López Cuando hablamos del exoma nos referimos por tanto a la parte del genoma que produce enfermedades, es decir, estudia genes que dan lugar a enfermedad (la parte codificante de proteínas). Es la parte funcional más importante que contribuye en mayor medida al fenotipo final de un organismo. En cambio, cuando hablamos de exoma clínico, nos referimos al estudio de genes que codifican enfermedades que están recogidos en OMIM (catálogo de enfermedades genéticas). La secuenciación del exoma y genoma completo son muy útiles para sobre todo cuando los fenotipos no son específicos o cuando el fenotipo es difícil (ER) o muy variable de un paciente a otro. Podemos deducir que, si antes teníamos problemas interpretando el array, ahora nos encontramos ante un “problemón” a causa de que el exoma clínico está constituido por alrededor de 6000 genes que causan enfermedad y que están ubicados en la base de datos OMIM. El exoma completo se basa en unos 12-14.000 genes. De forma que cuanto más ampliemos el estudio, más variantes y cambios vamos a encontrar, así como hallazgos accidentales que no tienen que ver nada con el motivo original del estudio del paciente. La secuenciación de nueva generación (NGS) vamos a poder hacerla de distintas formas en función de lo que estemos hablando: Secuenciación de paneles de genes (Panel Sequencing). Secuenciación dirigida del exoma (Targeted Exome Sequencing). Secuenciación de exoma clínico y completo Sequencing of clinical and complete exome). Secuenciación completa del genoma (Complete Genome Sequencing). 4.7.1. SECUENCIACIÓN DE PANELES DE GENES No tiene sentido hacer el estudio gen a gen por secuenciación Sanger por ejemplo en el caso de la epilepsia, ya que la mayoría de los casos de epilepsia no tienen una sospecha de un origen monogénico definido, por lo que sería mejor con paneles, en el cual seleccionamos grupos de genes (paneles de 20 a 400) por secuenciación de nueva generación (NGS). En el caso de que terminásemos el estudio del panel y no encontráramos nada, no podríamos ampliar el estudio, mientras que en el secuenciación del exoma dirigido a unos determinados genes, sí podríamos ampliar el estudio además a otros genes. Además, en el caso de la epilepsia: La expresividad es variable. La penetrancia es incompleta. Hay interacciones multigénicas. Existen mutaciones de novo. Existencia de historia familiar no informativa. Página 14 de 18 Pediatría Elena Aldana, Lourdes Galán, Celia García, Curso 2020-2021 Antonio Gil y Laura López Cuanto más limitemos el estudio, es decir, cuando los paneles son dirigidos y más relación tengan con el fenotipo, más información vamos a obtener relacionado con ese fenotipo y más coste-beneficio ya que el estudio se limita a unos genes conocidos de epilepsia. 4.7.2. SECUENCIACIÓN DEL EXOMA DIRIGIDO Consiste en la secuenciación y análisis de las regiones codificantes de un grupo de genes específicos que se asocian a un fenotipo determinado. En el exoma dirigido: Existe menor número de datos que se refieren a un problema concreto, y por tanto, mayor facilidad para interpretar resultados y menos hallazgos incidentales. Puede que en algún caso no se alcance una cobertura del 20X (se refiere a la profundidad vertical; a las veces que se leen la secuencia de genes que estamos estudiando, en este caso 20 veces). Están dirigidas a enfermedades muy heterogéneas con un gran número de genes. Hay distintas herramientas de análisis e interpretación de resultados. Se analizan y valoran los datos obtenidos y se realiza un informe. Podemos ver la cobertura del gen. Tienen de media alrededor de un 97% de cobertura ya que sólo un 3% aproximadamente ha quedado sin analizar. Hay que tener en cuenta por ejemplo los intrones que no codifican proteínas, pero en ocasiones pueden alterar los exones, lo cuales sí que codifican proteínas. ➔ MOSAICISMOS: Hablamos de mosaico cuando en un mismo tejido o varios, la alteración genética se encuentra en algunos tejidos sí y otros no. Hablaríamos de mosaicismo por ejemplo en el caso de un niño con esclerosis tuberosa tipo I (dominante) en la cual se evaluó a los padres y la madre presentaba una elevación de tejido gris en la espalda (mancha de Shagreen) característica de la enfermedad y en resonancia se vio que presentaba calcificaciones periventriculares. Se buscó por Sanger la mutación del niño en la madre, pero no la presentaba ya que se trataba de un caso de mosaicismo en la que solo una parte de las células en sangre tenían la mutación, y por esta razón la madre no tenía sintomatología. - La secuenciación Sanger empieza a ver mosaicismos hasta en un 15-20% de los casos. - La NGS en más del 15% de los casos. - Por pirosecuenciación podemos ver del 7-15%. - Por ddPCR esto se conoce como mecanismo de imprinting y suele haber dos enfermedades típicas: ▪ Prader Willi: niños discapacitados, talla baja, obesidad grave, apetito insaciable y pies pequeños. ▪ Angelman: discapacidad intelectual, epilepsia rebelde, no andan, no hablan, se les conoce como “muñeco feliz”. Cuando queremos estudiar una enfermedad genética muy heterogénea (es decir, que son genes muy diferentes los que la causan) se debe realizar secuenciación masiva; sin embargo, ante por ejemplo un Xeroderma pigmentoso (que viene determinado por 8-10 genes), debemos estudiarle mediante exoma dirigido (hace años se hacía de forma más lenta y cara estudiando siempre el gen más frecuente y seguimos con los menos frecuentes en función del resultado). Ese estudio dirigido también se puede hacer con la secuenciación masiva, donde se estudia con paneles de genes o exoma dirigido orientando la prueba a esos genes más frecuentes. El estudio genético puede proporcionar: el diagnóstico con todo lo que significa, dar guías para seguimiento y actitudes terapeúticas y aporta para AG y RR. 4.8. TEST DIAGNÓSTICOS Para seleccionar el test diagnóstico hay que tener en cuenta una serie de aspectos: a) Valorar la severidad del proceso, sobre todo en casos de Retraso Global del Desarrollo o Discapacidad Intelectual. b) Tener en cuenta que los síndromes presentan una gran variabilidad y tienen un amplio espectro de expresividad. c) Selección de los tests más apropiados: los de mejor relación coste-efectividad. d) El proceso debe ser dirigido por un genetista clínico. Página 17 de 18 Pediatría Elena Aldana, Lourdes Galán, Celia García, Curso 2020-2021 Antonio Gil y Laura López 4.9. INDICACIONES DE ESTUDIO MOLECULAR (este año no se ha dado) a) Paciente con trastorno monogénico conocido o sospechado. b) Trastorno monogénico conocido (estudio familiar sí se necesita estudio de ligamiento). c) Tejidos tumorales. d) Muerte neonatal con sospecha de trastorno metabólico. e) Algunos trastornos multifactoriales. f) Enfermedad mitocondrial (conocida o sospechada). 4.10. LOS EXÁMENES COMPLEMENTARIOS EN GENÉTICA Las pruebas en genética han cambiado en los siguientes aspectos: a) Eran dirigidas hacia el diagnóstico de una enfermedad, mientras que ahora más de cribado. b) Nos han permitido diagnosticar y conocer nuevos síndromes. c) Van por delante de la clínica y a veces no conocemos el significado del resultado. d) Disminución del precio y mayor rapidez. Página 18 de 18