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VL1 Zelluläre Struktur von Cytoplasma + Membran Intrazytoplasmatisc...

VL1 Zelluläre Struktur von Cytoplasma + Membran Intrazytoplasmatische Membranen ³ sind aber keine Organellen Bakterien Nukleoid in loops arrangiert, durch Histonähnliche Strukturen kompaktiert ³ Kein Zellkern Polysomen für schnelle und zeitgleiche Transkription und Translation Fortbewegung Membran Sporen Struktur Transport Tags In Speichergranula werden Speicherstoffe wie z.B. Glykogen gespeichert Zellwand Auf der Membran sitzt die Zellwand ³ Peptidoglykan Notizen VL1 Folien.pdf VL1.pdf entweder grampositiv oder gramnegativ sind verschieden dick ³ gram+ ist dicker, gram- hat 2-5 Schichten Morphologie gram- hat nochmal andere Membran auf der Zellwand (Peptidoglykan), Aufbau gram+ nur manchmal in Sonderfällen recht einfach Zellanhänge (Flagellen, Fimbrien, Pili) zur Fortbewegung Transmissions Elektronen Mikroskopie zeigt Membran, Wand und DNA ³ Mehr Auch Ribosomen für Schnitte Scanning Elektronen Mikroskopie zeigt Struktur und Zusammenhänge Nucleoid Zelle E.coli = 1-3µm Genomische DNA E.coli = 1-2mm Bau Bakterienzelle muss daher stark kondensiert sein m nucleoid-associated proteins VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 1 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 2  DNA packaging über negatives supercoiling und histon-ähnliche Proteine in 5939 Richtung Plattform für Signalmoleküle ³ kooperative Konstruktion von komplexen Polypeptiden und deren Faltung mRNA kann schon beim transkribieren translatiert werden, und zwar an mehreren Stellen gleichzeitig Ribosomen Ribosomen der Prokaryoten und Eukaryoten bestehen beide aus rRNA und Proteinen Prokaryoten haben 70S-Ribosomen aus 50S UE: 5S rRNA, 23S rRNA, 34 Proteine 30S UE: 16S rRNA, 21 Proteine negatives supercoiling = linksgängige Verdrillung positives supercoiling = rechtsgängige Überspiralisierung Transkription und Translation sind in Prokaryoten zeitlich und räumlich gekoppelt Eukaryoten haben 80S-Ribosomen aus 60S UE: 5S rRNA, 28S rRNA, 5,8 rRNA, 49 Proteine 40S UE: 18S rRNA, 33 Proteine VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 3 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 4  S steht hierbei für die Sedimentationsgeschwindigkeit im Gradienten ³ wie schnell sinkt der Partikel in einem homogenen Gemisch ab? Ribosomen haben wichtige Rolle in Translation ³ ribosomale Bindungsstelle der mRNA = Shine Dalgarno Sequenz, liegt in 16S rRNA = Bildung des Initiationskomplexes Zellhüllen Gram-negative Bakterien Zytoplasmamembran, Periplasma, Peptidoglykan, Äußere Membran Zytoplasmamembran Gram-positive Bakterien gram-positiv vs gram-negativ Zytoplasmamebran, dickes Peptidoglykan Phospholipipd-Bilayer Zytoplasmamembran von Bakterien aus Phospholipiden ³ bilden durch Anordnung im Raum (Hydrophil nach außen, hydrophob nach innen) eine Bilayer-Membran Hydrophiler Teil ist das Glycerin-Phosphat VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 5 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 6  Am Glycerin-Phosphat können noch andere Gruppen binden ³ z.B. Es gibt Transmembranproteine, aber auch Lipidanker ³ sind nur in der Ethanolamin Membran verankert Bestimmen dann die Eigenschaften Beispiel E.coli: ³ Phosphatidylglycerin (20-25%) ³ Phosphatidylethanolamin (70%) Archaea Archaea haben keine Fettsäuren, sondern Isopreneinheiten als hydrophoben Teil Die Isopreneinheiten sind über Etherbindung an Glycerol gebunden statt ³ Cardiolipin (5%) verestert ³ Phosphatidylserin (5-10%) Zusammensetzung kann sich unter Stress ändern Fluid Mosaic Model C20-Kohlenwasserstoffketten (Isopren) = Phytanyl Membran ist Dynamisch und hat noch andere Bestandteile, die in ihr verankert C40-Kohlenwasserstoffketten = Biphytanil sind oder in ihr / auf ihr schwimmen VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 7 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 8  Über die Membran wird der elektrochemische Gradient aufgebaut ³ Proton motive force (PMF) PMF wird zu Energiegewinnung genutzt PMF Proton Motive Force Elektronentransportkette bringt e- von NADH auf O2 (Elektronenakzeptor am Ende der Atmungskette), dabei werden die H+ aus der Zelle raustransportiert Aus Phytanyl-Einheiten werden Lipid-Bilayer gebildet, aus Biphytanylen nur dadurch bildet sich ein Elektrochmisches Membranpotential: Außen mehr H+, einfache Membranen dadurch auch Ladungsunterschied in der Zelle und Außen H+ wollen wieder in die Zelle einströmen ³ Gradient treibt die ATP Synthase an und auch den aktiven Transport Hyperthermophile Archaeen (Pyrolobus) haben einschichtige Membranen ³ können sich nicht mehr auftrennen, stabiler bei hohen Temperaturen Funktionen Permeabilitätsbarriere Die Zytoplasmamembran ist selektiv permeabel (semipermeabel) verhindert das Auslaufen und fungiert als Einlass für den Transport von Nährstoffen in die Zelle und für den Transport von Nährstoffen aus der Zelle Verankerung von Proteinen PMF = pH-Gradient und elektrochemisches Membranpotential üben auf Proteine in der Membran sind am Transport (Nahrungsaufnahme, etc) und an die ausgestoßenen Protonen eine Kraft in Richtung zurück ins Zellinnere der Chemotaxis beteiligt aus Energiegewinnung VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 9 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 10  PMF treibt die ATP Synthase an statischer Kopf ragt ins Zellinnere ³ ist durch Stiel mit Basis in Membran verbunden Protoneneinstrom führt zur Drehung des Stiels = Konformationsänderung und Drehung im Kopf 1 ATP durch 3-4 einströmende H+. für 3 ATP = ca 10 H+ Permeabilität und Transport Wenn Affin = geht sehr schnell. Aber der Transporter ist auch irgendwann gesättigt Passiver Transport erleichterte Diffusion für H2O durch Aquaporine entlang des Konzentrationsgradienten Nur Wasser und Glycerin werden passiv über erleichterte Diffusion transportiert! Glycerintransport durch den GlpF-Kanal ³ Konformationsänderung entlang des Konzentrationsgefälles, ohne Energieaufwand Gase können diffundieren Aktiv und Carrier-vermittelt für größere Moleküle Primäraktiver Transport: ATP-abhängig, ABC Transporter. Haben geringe Kapazität, sind dafür sehr affin Sekundäraktiver Transport: PMF-abhängig, geringe Affinitiät, dafür hohe Kapazität. Antiporter, Symporter und Uniporter möglich Phosphotransferase-System (PTS) = Gruppentranslokalisation VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 11 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 12  Aktiver Transport Carrier-vermittelt ABC-Transporter haben ATP-Binding cassette (ABC) = ATPase subunit ³ bindet das zu transportierende Substrat und bringt zu Transporter ³ an Transporter = ATP hydrolysierendes Protein (ATP ³ 2 ADP + 2P), Substrat durch direkter ATP Verbrauch Prinzip: Substrat bindet, Energieverbrauch = Konformationsänderung, führt zu Translokation, dann Substratfreisetzung Übersicht: VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 13 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 14  Beispiel: Maltose Maltose bindet an MalE ATP an MalK = Konformationsänderung, Transportpore aus MalG und MalF öffnet sich nach außen, Maltose in die Pore ATP-Hydrolyse = Konformationsändernung in MalK = Pore öffnet sich nach innen, Maltose wird frei Viele Beispiele: ABC-Transporter als Nutrient Uptake, aber auch als Toxin / Drug exporter Aktiver Sekundärer PMF-Abhängiger Transport Energie durch PMF Proton wird mittransportiert oder auch Natrium ³ Auf jeden Fall Gradient LacY = Lactose-Permease (12 hydrophobe Transmembranhelices) ³ benötigt Symporter = Lactose und H+ rein Uniporter, Antiporter, Symporter VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 15 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 16  Auch für Efflux ³ Multidrug-efflux-pumps (Resistenz) Energie kommt aus Phosphoenolpyruvat PEP ³ wird zu Pyruvat gespalten Phosphatrest wird erst unspezifisch übertragen auf Enzym I, dann auf HPr, dann zuckerspezifische Phosphorylierung von Enzym IIa, IIb Enzym IIc ist Transmembrantransporter ³ Phosphorylierung von Zucker Zucker kommt phosphoryliert in Innenraum an PMF = Grundsystem der Energiegewinnung des Lebens ³ Transporter, ATP-Synthese, Fortbewegung PTS wiederholen Zusammenfassung Gruppentranslokationssystem / Phosphotransferase-System (PTS) VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 17 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 18  wenigerschichtiges Peptidoglykan, Membran oben drauf Bei Gramfärbung bleibt das Kristallviolett nur in Mureinsacculus, Gramnegatives LPS lässt sich durch Safranin gegenfärben Zellwand Zellwände Vergleich Grampositiv Bei der Gramfärbung kann das Iod-Kristallviolett bei Grampositiven nicht mehr durch Ethanol aus dem Mureinsacculus gewaschen werden, gramnegative können entfärbt werden und erscheinen somit Rosa durch Safranin Mureinsacculus Gramnegativ VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 19 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 20  4 Strukturen hängen an Muramin: L-Alanin, D-Glutaminsäure, Diamonopimelinsäure (DPA) und D-Alanin Quervernetzungen dann über DAP und D-Alanin bei gramnegativen Ethanol dehydratisiert die Peptidoglykanschicht ³ Farbstoff wird sogar noch stabilisiert Aus LPS durch Ethanol ausgewaschen Glykantetrapeptid Glykantetrapeptid besteht aus N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure ³ sind ³-1,4-glykosidisch verknüpft über die Seitenketten des Glykantetrapeptids entstehen die Quervernetzungen An Seitenketten vom Glykan Muramin hängen Peptide ³ Diese bilden die Quervernetzung VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 21 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 22  hoch vernetzt Mureinsacculus L-Lysin + Pentaglycin Übersteht Zellinnendruck von 20 bar Druck wird überstanden Wenn Zellwand abgebaut wird, dann bildet sich Protoplast ³ platzt bei hypotonem Medium oder Protoplast löst sich Peptidoglykan bildet Stränge bei grampositiven Brücke zwischen L-Lysin und anderer AS über Pentaglycinbrücke Teichonsäuren Polyribitol oder Polyglycerolphosphate Durchspannen die Membran entweder oder sind nur in der Zellwand verankert Tragen AS und Phosphat ³ geben der grampositiven Zellwand die negative Ladung Pentaglycinbrücke, da 5x Glycin Interpeptidbrücke glykosidische Bindungen des Glykans = Festigkeit in x-Richtung, Peptidbindungen = Festigkeit in Y-Richtung Grampositive Zellwand 50nm dick VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 23 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 24  Grampositive Zellwand verhindert, dass die Zelle in hypoosmotischem Lipid A ist ein Endotoxin, wird bei Lyse bei Infektion freigesetzt = Toxic shock Medium lysiert ³ Aufrechterhaltung des Turgors syndrom. Kann je nach Wirt modifiziert werden ³ Wirt erkennt Bakterienzelle nicht Gramnegative Zellwand Kernpolysaccharid und Lipid A sind konserviert hat äußere Membran und LPS (Lipopolysaccharid) O-spezifisches Polysaccharid verschieden bei verschiedenen Spezies, Bildet Serotypen aus CAMPs VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 25 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 26  Kationische antimikrobielle Peptide von Wirbeltieren kein echtes Murein, sondern Pseudomurein Defensine Von Neutrophilen und Epithelzellen produziert Binden an negative Ladung der Phosphate der Membran, Teichonsäuren und Lipid A und lysieren die pathogenen Bakterien S-Layer haben nur Archaea und einige Grampositive Zellwand-assoziierte Glykoproteine auf der Oberfläche in gleichmäßigen Bakterien Membran Komponenten können modifiziert werden, sodass sie Mustern resistent gegen CAMPs werden Kristalline Proteine positive AS drauf ³ nicht mehr negativ geladen (D-Ala, D-Lysin, Schutz vor Umwelteinflüssen, Phagen, ist Virulenzfaktor Aminoarabinose, Fettsäuren Porine in der äußeren Membran zum Transport von Ionen, Nährstoffen, Efflux Antibiotika Archaea haben Zellwand aus Pseudomureinbausteinen N-Acetylglucosamin und N-Acetylosaminuronsäure sind ³-1,3-glykosidisch verknüpft ³ nicht durch Lysozym hydrolysierbar Peptidquervernetzung über L-Lys und L-Glu VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 27 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 28  Funktionen: protections against bacteriophages resistance against low pH protection against lytic enzymes stabilization of the membrane adhesion sites for exoproteins Aus Penicillium (Pilz) Zusammenfassung Transpeptidasen / Glykosylasen katalyseiern Quervernetzungen zwischen Peptidseitenketten benachbarter Peptidoglykanstränge Transpeptidasen sind Penicillinbindeproteine (PBPs) ³ werden durch Penicillinbindung gehemmt Wirkung Antibiotika Fosfomycin hemmt Enzym MurA ³ katalysiert ersten Schritt der Mureinbiosynthese (inactivating structural analog of PEP ³ Cosubstrate of Antibiotika MurA-catalyzed reaction) Target D-Cycloserin inhibiert Alanin-Racemase und D-Alanyl-D-Alanin-Synthetase ³ Antibiotika greifen die Zellwand an, da diese Struktur nicht in eukaryotischen Enzyme für Zellwandsynthese Zellen vorkommt Nisin bildet Pore in Zellmembran Penicillin Bacitracin bildet Komplex, greift in Mureinsynthese ein Penicillin-Wirkung durch ³-Lactamring Ramoplanin inhibits transglycolisation step of peptidoglycan biosyntheseis (Lipid II bound on outer surface of membrane) VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 29 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 30  Vancomycin maskiert Substrat Penicillin and other ³-Lactams covalently modify active site of transpeptidases Speicherstoffe, Geißeln, Endosporen Speicherstoffe Poly-³-Hydroxybuttersäure Wird in Granula gespeichert VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 31 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 32  Flagellenrotation durch PMF angetrieben Geißel (Filament) durch mehrere Ringe (L, P, MS, C) in Membran & Zellwand & ggf. LPS verankert Durch Mot-Protein strömt H+ mit dem Konzentrationgradienten ins Zellinnere ³ Fli Proteine aktiviert, Ringe rotieren Fortbewegung Geißeln zur Fortbewegung Fimbrien zur Adhäsion an Oberflächen ³ z.B. für Biofilm-Bildung und Anheftung an Wirtszellen bei pathogenen Pili für Konjugation Geißeln Verschiedene Arten von Begeißelung Polytriche (mono oder bipolar) kann in beide Richtungen schwimmen nur peritrich (an Seiten) und monotrich kann nur in eine Richtung VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 33 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 34  Bewegungsarten Chemotaxis Peritrich gerichtete Bewegung zum Anziehenden Stoff hin, vom Schreckstoff weg Rotation in eine Richtung = Bewegung, Rotation in andere Richtung = Taumeln ohne anziehender / abschreckender Stoff = zufällige Bewegung Wenn Polar ³ Richtungwechsel durch Änderung Drehrichtung (ziehen / Bewegung entlang eines Gradienten schieben) Geißeln rotieren nur ein eine Richtung Neuorientierung zum Richtungswechsel VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 35 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 36  Messen in Kapillaren mit verschiedenen Stoffen oder auf Schwimmplatten ³ besonders pathogene Bakterien bilden oft Sporen Bewegung detektieren Bei Endosporenbildung wird ein Ca2+-Dipicolinsäure (DPA)-Komplex Gebildet macht 10% der Trockenmasse der Spore aus bindet Wasser und dehydratisiert so die Spore schützt die DNA vor Denaturierung Einlagerung von SASPs Small acid soluble proteins binden DNA und schützen vor UV und Hitze sind Energie und C-Quelle während Auskeimen Stadien Aus vegetativem Zyklus über in Sporulation bei schlechten Bedingungen PMF und Geißel wdh (Hunger) Vorspore und Septum bilden sich Endosporen Cortex um Spore innen, dann Hülle und Cytoplasmamembran Dauerformen (Ruhestadien) Dann Sporenhülle, Ca2+, DPA und SASPs Aufnahme Überleben bei Hitze und Nahrungsmangel Reifung und Zelllyse, kann dann zu vegetativer Zelle wieder auskeimen enstehen aus vegetativen Zellen, können dann auch wieder auskeimen VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 37 VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 38  VL2 Mikrobielles Wachstum Autoklav Nährstoffe Population Umwelt Wachstum Tags Zellteilung Notizen VL2 Folien.pdf VL2.pdf Fragen Klausur Zellmembran Fluid Mosaic Model ³ eingelagerte und aufgelagerte Proteine Bilayer aus Phospholipiden Phospholipide haben polaren Kopf aus Glycerin und Phosphat hydrophober Schwanz = FS, verestert mit Kopf selektive Permeabilitätsbarriere, Energiegewinnung und Transport Transport Freie Diffusion Nur Gase Erleichterte Diffusion Wasser und Glycerin Carrier-vermittelt Aktiver Transport gegen das Konzentrationsgefälle, unter Energieverbrauch ABC-Transporter verbrauchen ATP (Hydrolyse) Sekundärer Transport über Gradient (PMF) ³ Uniport, Symport, Antiport Phosphotransferase-System für Transport und Phosphorylierung Zucker ³ Energie aus PEP (energiereiche Bindung) VL1 Zelluläre Struktur von Bakterien 39 VL2 Mikrobielles Wachstum 1  unspezifisch Enzym I, HPr, spezifisch Enzym IIa, b, c Zellwand Peptidoglykan aus Glykantetrapeptid Quervernetzt durch Peptidbindungen Penicillin Target = Transpeptidasen, Zellwandsynthese Nährstoffe wichtige Stoffwechselprozesse Kohlenhydrate aufnehmen, in Pentosephosphatzyklus und Tricarbonsäurezyklus verwerten Katabolismus: Kohlenhydrate abbauen zu Monomeren (Energiestoffwechsel); Anabolismus: Aufbau von Polymeren unter Enerieaufwand, Baustoffwechsel zu Zuckern abbauen ³ Polysaccharide für die Zellwand und für Nucleinsäuren Intermediärstoffwechsel (Amphibolismus) ³ Intermediate im Stoffwechsel herstellen oder für Energiestoffwechsel ³ Gradient aufbauen, Übertragung auf NADH und FADH ³ Übertragen P+ auf ATP Verschiedene Wege im Katabolismus und Anabolismus Kohlenhydrate auch für Fettsäuren für Lipide für Membranen AS aus Salzen (NH4+, SO4-, PO4-) für Proteine ³ Membranen, Enzyme und Ribosomen Nucleotide auch aus Salzen, besonders Phosphat ³ daraus Nucleinsäuren Sauerstoff als Elektronenakzeptor in der Atmungskette (reduziert zu H2O) Katabolismus = Abbau Hexosen über Glykolyse, Pentosephosphatweg, 2- Keto-3-desoxy-6-phosphogluconat-weg VL2 Mikrobielles Wachstum 2 VL2 Mikrobielles Wachstum 3  Gehen ein in Citratzyklus E.coli ist chemooranoheterotroph oder in Substratphosphorylierung Energie aus Redoxreaktion (chemische Umsetzung von Stoffen), setzt organische Stoffe um Wasserstoffe daraus gehen ein in die Atmungskette oder in Monomersynthese zur Bildung ATP Als Kohlenstoffquelle organische C-Quellen Aus den Monomeren aus dem Katabolismus kann dann unter Nährstoffe Energieaufwand aus dem Katabolismus Polymersynthese erfolgen C-Quelle und Energiequelle = Glucose Energiestoffwechsel wird bevorzugt, kann aber auch umstellen auf andere Kohlenstoffquelle / Energie aus chemischer Umsetzung von Stoffen gewinnen durch Redox- Energiequelle (Diauxotrophie) Reaktion = Chemotrophie + Stickstoffquelle NH4 aus organischen Stoffen = Chemoorganotrophie (Glucose, Acetat) + Phosphatquelle P O432 aus anorganischen Stoffen = Chemolithotrophie (H2 , H2 S, F e2+ , NH4 Schwefelquelle SO42 2 Energie aus Lichtquelle = Phototrophie Spurenelemente für aktive Zentren von Enzymen (Mg2+, Zn2+, Fe2+, Mn2+, K+, Na+, Ca2+, Cu2+) Vitamine für Cofaktoren Sauerstoff als e- Akzeptor ³ durch Schüttelkultur Medien Reiche Medien ³ Komplexmedien Zusammensetzung, Konzentrationen können variieren Hefeextrakt, teilweise verdautes Fleisch Extrakt, Salz Luria Broth (LB), Tryptic Soy Broth (TSB) Man weiß nicht, welcher Faktor die Nährstofflimitation bedingt Definierte Medien ³ Minimalmedium E.coli Zusammensetzung und Konzentration exakt definiert Bei optimalen Bedingungen ist die Verdopplungszeit 30 min enthält Glucose, Na2 HP O4 , KH2 P O4 , NH4 Cl , MgSO4 und andere Nährstoffe sind begrenzt, wenn aber genug vorhanden = schnelle Vermehrung Salze in exakter Menge ³ bei Pathogenen zum Beispiel Eigentlich nur Glucose und Salz VL2 Mikrobielles Wachstum 4 VL2 Mikrobielles Wachstum 5  Genau bestimmen was limitierend ist ³ Konzentration von einer Sache verringern = geht dann früher in stationäre Phase über? Kulturen Reinkulturen durch Verdünnungsausstrich Kultivierung in verschiedenen Kolben in Fermenter kann kontinuierliche Kultur angelegt werden ³ immer wieder verdünnen und Medium dazu, altes raus VL2 Mikrobielles Wachstum 6 VL2 Mikrobielles Wachstum 7  Septum Kolonien sind Anhäufungen von Zellen, die sich nach der Teilung einer oder mehrerer Zellen bilden und eine Milliarde oder mehr einzelne Zellen enthalten FtsZ-Ring können MinCD hemmt den FtsZ-Ring Selektion auf Blutagar-Platten: Hämolyse-Nachweis MinE verdrängt MinC Staphylococcus aureus hat ³-Hämolysin ³ lysiert die Membran von Erythrozyten auf der Blutagarplatte = Hämolyse MinE steuert FtsZ und Divisom im Zentrum So S.aureus selektieren FtsZ hydrolysiert GTP (ist eine GTPase), Energie für FtsZ-Ring Polymerisierung un Depolymerisierung Zellwachstum und bakterielle Zellteilung Binäre Teilung Aus einer Bakterienzelle entstehen 2 genetisch identische Nachkommen Dazu wird das Nucleoid dupliziert, dann wächst die Zelle, ein Septum wird gezogen und die Tochterzellen trennen sich, jede bekommt ein Nucleoid VL2 Mikrobielles Wachstum 8 VL2 Mikrobielles Wachstum 9  FtsZ ist GTPase, Ring zur Zellteilung mit Peptidoglykansyntheseprotein (FtsI) und Chromosomentrennungsprotein (FtsK) und ATPase (FtsA) FtsZ Ring bildet sich schrittweise bei der Zellteilung FtsZ leitet den Teilungsvorgang ein Divisomkomplex ist für Zellteilung verantwortlich, zusammenziehen innerer und äußerer Membranen bei Zellteilung und Peptidoglykansynthese bei der Teilungsstelle (Zellwandsynthese!) ³ FtsZ-Ring gehört dazu MinCD ist erst noch drumrum, wird dann von MinE verdrängt und Divisomkomplex mit FtsZ kann sich bilden Zellwandbiosynthese Teilung Energie auch durch ATPase MreB sind Cytoskelett-Proteine ³ Homolog zu Actin Chromosomen kondensieren dann und Nucleoide werden verteilt ³ Septum Kontrolliert die Form von Bakterien und die Peptidoglykansynthese in wird gezogen und die Zellen trennen sich Wachstumszonen da wo an Zellwand grenzt: neue Zellwand bilden Cresentin bildet das Cytoskelett aus Bei Kokken geht die Zellwandsynthese nicht von Verknüpfungsstellen von MreB mit der Zellwand aus, da kein MreB haben ³ geht von FtsZ-Ring aus = Wachstumszone VL2 Mikrobielles Wachstum 10 VL2 Mikrobielles Wachstum 11  Wachstum möglich, da erstmal alte ´-1,4-glykosidische Bindungen im Peptidoglykan gekappt werden = Platz für neues Peptidoglykan in der Wachstumszone Bactoprenol bringt dann Glykantetrapeptide zu dem Wachstumszonen Transglykosylase verknüpft die Bausteine mit der alten schon bestehenden Zellwand = Zelle verlängert vor Septum Einzug Wachstumszone: FtsZ, MreB, Divisom, Cresentin Wachstum einer Population Berechnung Logarithmisches Wachstum Exponentielles Wachstum logarithmisch dargestellt VL2 Mikrobielles Wachstum 12 VL2 Mikrobielles Wachstum 13  aus logarithmischer Darstellung kann dann die Steigung der Kurve abgelesen werden Steigung = 0,301/g Mathematische Grundlagen graphisch g berechnen (Generationszeit ³ Zeit bis Population / Zelle sich aus einer Zelle werden 2 Zellen: 20 ³ 21 verdoppelt hat) aus 2 Zellen werden 4 Zellen: 2 1 ³ 22 2 Punkte an Graphen raussuchen wo sich verdoppelt hat (z.B. von 0,1 auf aus 4 Zellen werden 8 Zellen: 22 ³ 23 0,2) n berechnen: auf Zeitachse (x) ablesen, wie viel Zeit verstrichen ist da verdoppelt, ist n = 1 (Anzahl Generationen n = 3, 3 7 (logN 2 logN0 ) damit dann g berechnen N ist dabei Anzahl der Zellen jetzt, N0 ist Anfangs-Zellzahl g = t/n Wachstumskonstante: k = n/t Generationszeit: VL2 Mikrobielles Wachstum 14 VL2 Mikrobielles Wachstum 15  N = 868 * 22,8 = 6045 g = t/n = 1/k Beispiele: Nach 120h gibt es 10.000 Bakterien. Wie lang ist Verdopplungszeit? t = 120 N = 10.000, N0 = 1 g ist gesucht n berechnen, dann Formel n = 3,3 (log(10.000)-log(1)) = 13,2 g = 120/13,2 = 9h 20 Salmonella enterica essen. g = 2h, ab 106 Zellen fühlt man sich krank. Wann krank? g = 2h N0 = 20 N = 106 t suchen n = 3,3(log 106 - log 20) = 15,51 t = g * n = 2 * 15,51 = 31,03h nach 31,03h sind es 106 Bakterien und man fühlt sich krank g = 2,5 Tage, N0 = 868 Personen, t = 7 Tage N ist gesucht n = t/g ³ für N n = 7 / 2,5 = 2,8 N = N0 7 2n Rechnung wiederholen VL2 Mikrobielles Wachstum 16 VL2 Mikrobielles Wachstum 17  Wachstumskurve Wachstumsrate zeigt Wachstum über Zeit: Ratenkonstante für die Geschwindigkeit der Veränderung der Zellmasse (OD) ³ dafür OD und t Optische Dichte und Lebendkeimzahl korrelieren Differenz nehmen und dividieren lnOD 2 2lnOD 1 µ= t2 2t32 in h21 Teilungsdauer zeigt an, wie lange bis Teilung benötigt: Zeitintervall für die Verdopplung der Zellmasse ln2 td = µ in h Stimmen ungefähr überein, denn wenn mehr Zellen, dann wird auch das Licht mehr gestreut Wachstumsphasen Wachstumsphasen Ursachen und Merkmale Anpassung an neue Bedingungen, Induktion von Enzymen zur Anlaufphase (lag- Verwertung von C-Quellen oder anderen Nährstoffen, konstante Phase) Zellzahl, Stoffwechsel aktiviert, RNA-Gehalt steigt, Wachstumszunahme Exponentielle Zellen nutzen optimal Nährstoffe, konstante maximale Teilungsrate, Wachstumsphase Konstante Zellgröße, Zelldichte steigt, Substrate C, N, P verbraucht (log-Phase) kontinuierliche Kultur Verbrauch mindestens eines Nährstoffes (C,N, P), Anhäufung hemmender Stoffwechselprodukte, pH-Änderung (Alkalisierung, da in Chemostat (Fermenter) Stationäre Phase Salze abgebaut), Resistenz gegen Umweltstress und Antibiotika, Konstante Zellzahl Populationsdichte durch Konzentration des wachstumsbegrenzenden Nährstoffs geregelt (konstant) Fehlende Energiequelle, Toxisches Stoffwechselprodukt, Lytische Absterbephase Enzyme induziert Wachstumsrate durch Flussgeschwindigkeit konstant Wachstumsrate und Teilungsdauer VL2 Mikrobielles Wachstum 18 VL2 Mikrobielles Wachstum 19  Wenn immer Bakterien raus und neues Medium dazu = Verdünnung Messung mikrobiellen Wachstums mit zunehmender Verdünnungsrate nimmt die Verdopplungszeit ab ³ zur Gesamtzellzahlbestimmung Kompensation der Verdünnung, aber nur begrenzt möglich durch Zählkammer Wachstum kann bei hohen Verdünnunsraten nicht mehr ausgegleichen ³ Alle Zellen zählen ³ lebendige und tote Zellen auswaschen der Kultur Zählen der Zellen in den einzelnen Quadraten des Fadenkreuzes VL2 Mikrobielles Wachstum 20 VL2 Mikrobielles Wachstum 21  Bestimmung der Zellkonzentration Vq = 0,05mm x 0,05mm x 0,01mm = 2, 5 7 1025 mm3 1 mm3 = 1µl Vq = 2,5 * 1028 ml Trübungsmessung Zellzahl in 40 Quadraten = Vq * 40 = 1026 ml Optische Dichte (OD) mit Spektralphotometer messen Faktor zur Berechnung der Zellzahl / ml = 106 Lichtquelle durch Blende und Filter auf Probe mit Zellsuspension ³ Licht wird Lebendzellzahlbestimmung an der trüben Probe gestreut Starten mit hier 2* 108 Zellen / ml Messung der Lichtmenge, die ankommt nach Probe auf Detektor dann Verdünnen 1:10 ³ Zellzahl nimmt in Potenz um 1 ab: 2* 107 Zellen / ml Information an Spektralphotometer immer nur 100µl ausplattieren ³ wirkt wie weitere 1:10 Verdünnung = 2* 106 je höher OD-Wert, desto höhere Zellzahl Kolonien / Platte Extinktion = log(einfallende Strahlung / austretende Strahlung) So lange, bis auszählbare Kolonien pro Platte dann Kolonien mit Dreisatz auf 1ml hochrechnen ³ hier *10, da 100µl * 10 = 1ml cfu/ ml * Verdünnungsfaktor (z.B. bei 1023 = 103 ) = cfu/ml VL2 Mikrobielles Wachstum 22 VL2 Mikrobielles Wachstum 23  Umwelteinflüsse sehr hitzetolerant: Thermus aquaticus, Pyrolobus, Riftia Symbionten, Methanococcus jannaschii Temperatur Organismen haben Bereich, indem sie Temperatur ertragen können und Anpassung Thermophiler und Hyperthermophiler Archaea Optimum Thermostabile Enzyme: mehr hydrophobe AS, mehr Ionenbrücken, stabiler Minimum: Membran erstarrt, Transportprozesse so stark verlangsamt, dass und resistent gegen Entfaltung kein Wachstum mehr möglich ist Schutzstoffe gegen Denaturierung: Diinositolphosphat, Diglycerolphosphat, Auf dem Weg zum Optimum: Enzymatische Reaktionen steigen mit Mannosylglycerat wachsender Geschwindigkeit Membran hat mehr gesättigte FS und nur Lipid-Mono-Schicht aus Isoprenen Am Optimum: Enzymatische Reaktionen laufen mit maximaler mit Etherbindung am Glycerol = Schutz vor dem Schmelzen der Membran Geschwindigkeit ab Thermosom als Proteinkomplex und Chaperone zur Proteinfaltung Maximum: Denaturierung der Proteine, Zusammenbruch der Struktur der Kalium = Schutz DNA vor Hydrolyse Membran, thermisch bedingte Lyse Polyamine Putrescin und Spermidin schützen die Ribosomen Toleranzen unterscheiden sich: Reverse DNA Gyrase bewirkt positives Supercoiling als Stabilisierung Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus ist thermostabil (PCR!) Osmolarität auch hier verschiedene Optima und verschiedene Toleranzen VL2 Mikrobielles Wachstum 24 VL2 Mikrobielles Wachstum 25  Alkohol-ähnliche: Glycerol, Mannitol Hohe Osmolarität ³ Hohe Salzkonzentration außen Wasser aus der Zelle würde nach Osmose Prinzip ausströmen = Plasmolyse Compatible Solutes und K+ in Zelle = ähnliche Osmolarität wie außen ³ Wasser strömt nicht aus, Turgor bleibt erhalten Niedrige Osmolarität ³ Hypoosmotisch, innen hohe Salzkonzentration Compatible Solutes wieder über Effluxpumpen ausschleusen Wahrnehmung des steigenden Turgors durch Wassereinstrom ³ mechanosensitive Kanäle auf Turgor erhalten extrem halophile brauchen hohe Salzkonzentration ³ 2-4M (12-23%), max 5M (33%) Salzseen und Gesteine Osmotischer Stress durch hohe Salzkonzentration im Medium ³ lagern kompatible solutes ein hydrophile organische Stoffe, leicht zu produzieren Bei Archaea = Kalium Innen mehr Teilchen als Außen ³ Wasser wird nicht entzogen (strömt ggf. noch ein) = Proteine weiterhin aktiv Außerdem Proteine aus sauren AS und wenig hydrophobe AS, Auch Zellwand aus sauren AS ³ Stabilisierung zum positiven Medium mit Na+ Proteine Zellen lysieren in weniger positivem Medium, da sich die sauren Gruppen in Strukturstabilisierung von Enzymen bei hoher Osmolarität der Zellwand auseinander drängen Compatible Solutes als Schutzschicht um die Proteine herum ³ maintain enzyme structure and increase cell volume Beispiel extrem halophil: Halobacterium salinarum pH Compatible Solutes Alkalischer pH-Wert stört den Protonengradienten (für PMF benötigt), da H+ AS-ähnliche: Glycin-betaine, Ectoine, Dimethylsulfoniopropionate weggefangen werden von Basen Kohlenhydrat-ähnliche: Sucrose Alkaliphile nutzen einen Na+ Gradienten statt H+ Gradienten VL2 Mikrobielles Wachstum 26 VL2 Mikrobielles Wachstum 27  Na+/H+ Antiporter (H+ rein, Na+ raus) zur Aufrechterhaltung des Gradienten Wenn sauerer pH = H+ viel außen, gelangt in Zelle und schädigt Enzyme Acidophile nutzen H+-fangende Enzyme (glutamate decarboxylase) halten den pH-Wert innerhalb der Zelle über einen bestimmten Toleranzbereich durch Mechanismen konstant Na+ Gradient nach innen H+ raus durch Atmungskette H+ rein für ATP-Synthase, kontrolliert durch Na+/H+ Antiporter, damit der pH Wert innen niedriger ist als außen Flagellenbewegung durch NaMF angetrieben NaMF treibt auch Transport von Substraten an Sauerstoff Na+ genutzt statt H+ ³ NaMF bei Alkaliphilen Aerobe Obligate brauchen O2 aerobe Atmung z.B. Micrococcus luteus in Staub, Haut Fakultative brauchen kein O2, aber Wachstum besser mit aerobe Atmung, anaerobe Atmung und Fermentation möglich VL2 Mikrobielles Wachstum 28 VL2 Mikrobielles Wachstum 29  z.B. E.coli im Darm von Säugetieren Microaerophile brauchen O2, aber in geringeren Konzentrationen aerobe Atmung z.B. Spirillum voluntans im Seewasser Anaerobe Aerotolerante O2 egal, Wachstum nicht besser mit O2 Fermentation Reaktive Sauerstoff Spezies (ROS) z.B. Streptococcus pyogenes im Atmungstrakt entstehen durch stufenweise 1-e- Übertragungen auf molekularen O2 Obligate O2 ist schädlich oder tödlich für sie Fermentation oder anaerobe Atmung z.B. Methanobacterium formicicum im Klärschlamm und in anoxischen Seesedimenten OH-Radikal in Fenton-Reaktion gebildet Versuch Redox-Indikator zeigt Zone im Reagenzglas, in der O2 ist Bakterien verteilen sich je nach Toleranz und Optimum in Zone mit oder Ohne Sauerstoff ROS führen zu Schäden von Proteinen, DNA und Membranen Auch Schutz gegen mikrobielle Invasion Oxidativer Stress = Anlagerung von ROS Detoxifikation 2 Superoxiddismutase: 2O2 + 2H+ ³ H2 O2 + O2 Katalase: 2H2 O2 ³ 2H2 O + O2 , schäumt, da O2 frei Glutathion-Peroxidse: H2 O2 + 2GSH ³ GSSG + H2 O VL2 Mikrobielles Wachstum 30 VL2 Mikrobielles Wachstum 31  Peroxiredoxine: R 2 OOH + 2H+ ³ ROH + H2 O Kontrolle mikrobielles Wachstum Physikalische Kontrolle mikrobielles Wachstum Sterilisation durch Autoklavieren 20 min bei 134ºC feuchte Hitze ³ Wasserdampfdruck dezimale Reduktionszeit bei verschiedenen Bakterien bestimmt ³ je höher die Temp, desto kürzer dezimale Reduktionszeit 15 min bei 120º ist genug für Abtöten thermophile, thermoresistente und Sporen Auch Sporen abgetötet, Zellzahl sinkt ab nach Autoklavieren VL2 Mikrobielles Wachstum 32 VL2 Mikrobielles Wachstum 33  VL3 Einführung Stoffwechsel Lebendkeimzahlbestimmung: Verdünnungen herstellen. Auf 1ml hochrechnen, dann cfu * Verdünnungsfaktor = cfu/ml Bei einer Wachsenden Kultur ist die Lebendzellzahl = Gesamtzellzahl; bei Tags ATP Anabolismus Energiespeicher Katabolismus Overnight Kultur ist die Gesamtzellzahl höher als die Lebendzellzahl, da einige Zellen sterben Notizen VL 3 Folien.pdf VL3.pdf Mathe: log1012 2 log102 = 12-2 Fragen Anpassungen Medien An Temperatur Minimalmedium Monolayer festlegte Faktoren hitzeresistente Proteine Glucose, Phosphatsalze (Membran, Nucleinsäuren, Teichonsäuren, LPS), Chaperone Schwefelsalze (AS Met und Cys) und Ammonium (Proteine und Nucleotide) Osmolarität Reiches Medium Einlagerung, bzw. Efflux von compatible solutes Hefeextrakte, Fleischextrakte und Salze Sauerstoff & ROS Wachstum detoxifizieren durch Enzyme (Katalase, Superoxiddismutase) lag-Phase, exponentielle Phase, stationäre Phase, Absterbephase was passiert in den Phasen? Stoffwechselgrundlagen Für die exponentielle Phase kann g, n, t und k ausgerechnet werden Anabolismus vs Katabolismus Anabolismus = Aufbau von Polymeren, verbraucht Energie, +&G n = 3,3*(logN - logN0) g = n/t Katabolismus = Abbau Polymere zu Monomeren, Energie wird frei, -&G Amphibolismus = Intermediate aus Katabolismus für Anabolismus bereitgestellt Formeln! Redoxreaktionen im Stoffwechsel Redoxreaktionen ³ e- werden als Energieträger übertragen Wachstumsrate und Teilungsdauer können aus der Wachstumskurve errechnet Oxidation: e- Abgabe werden Reduktion: e- Aufnahme Messen des Wachstums über die Optische Dichte, Lebendzellzahlbestimmung Redoxpaare und Zählkammer VL3 Einführung Stoffwechsel 1 VL3 Einführung Stoffwechsel 2  der Elektronenakzeptor wird reduziert, der Donor wir oxidiert der Elektronendonor hat ein negativeres Redoxpotential als der Akzeptor, will also die e- abgeben Im Katabolismus werden Hexosen als Elektronendonatoren oxidiert (haben vom Elektronendonor zum Akzeptor wird Energie frei (-&G, exergone negatives Redoxpotential), die freie Energie wird als ATP und NADH Reaktion) gespeichert (e- Akzeptor) und geht in den Anabolismus ein ³ hier sind ATP, Vom Akzeptor zum Donor muss Energie aufgewendet werden, es ist eine NADH e-Donatoren endergone Reaktion (+&G) ATP, NADH und NADPH sind dabei die Energiespeicher, die den Katabolismus Energie geht entweder als ATP in die Substratphosphorylierung oder als und den Anabolismus verbinden NADH in die Elektronentransportkette (Atmungskette freie Energie (-&G) aus Katabolismus wird in Anabolismus (+&G) zum ATP Aufbau von Polymeren benötigt Adenosintriphosphat = Energiespeicher der Zelle wird übertragen durch ATP, NADH, NADPH VL3 Einführung Stoffwechsel 3 VL3 Einführung Stoffwechsel 4  im Katabolismus generiert, im Anabolismus verwendet Acetylphosphat Adenin verbunden mit Ribose, Ribose verestert mit 3 Phosphatresten NADH 2 energiereiche Säureanhydrid-Bindungen Elektronen- und Protonenüberträger jeweils bei Spaltung 32kJ/mol frei Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid ein H+ am Ring angehängt (da auch e-) und ein H+ dabei Auch andere Moleküle haben Säureanhydrid-Bindungen ³ sind energiereich NAD+/NADH hat Redoxpotential von -0,32V kann e- auch gut wieder abgeben NADH vs NADPH sind energetisch gleichwertig hohes Redoxpotential = geben gut ab Aber Enzyme sind spezifisch für entweder NADH oder NADPH können schnell wieder reoxidiert werden NADH für Oxidationen im Katabolismus, energieerzeugende Prozesse ³ wird selbst Phosphoenolpyruvat (PEP) ³ hat höchstes Gruppenübertragungspotential reduziert Glucose-6-Phosphat deswegen großes Verhältnis NAD+ zu NADH (viel NAD+) ³ nimmt e- von z.B. Hexose auf Acetyl-CoA VL3 Einführung Stoffwechsel 5 VL3 Einführung Stoffwechsel 6  NADPH Für Reduktionen im Anabolismus ³ wird selbst oxidiert, gibt e- ab auf Monomere, die zu Polymeren aufgebaut werden sollen, bzw. auf deren Synthese niedriges NADP+/NADPH Verhältnis, mehr NADPH, da ja e- abgeben Einteilung Stoffwechsel Sauerstoff = Aerobe Atmung (Atmungskette als Energiegewinnung), bester terminaler Elektronenakzeptor (Abstand Redoxpotential am höchsten) NO32 , SO422 , Fumarat = Anaerobe Atmung kein terminaler Elektronenakzeptor = Fermentation ³ machen meist nur obligate anaerobe Übersicht und Beispiele Energiequellen Aus Redoxreaktionen = Chemotrophie Redoxreaktionen mit organischen Substanzen als Elektronendonator (Glucose, Acetat, etc) = Chemoorganotrophie Redoxreaktionen mit anorganischen Substanzen als Elektronendonator ( H2 , H2 S, F e2+ , NH4+ , etc) = Chemolithotrohie Aus Licht = Phototrophie Kohlenstoffquelle Aus Organischen Substanzen = Heterotrophie Aus CO2 = Autotrophie Elektronenakzeptoren Terminaler Elektronenakzeptor bei der Energiegewinnung VL3 Einführung Stoffwechsel 7 VL3 Einführung Stoffwechsel 8  Organismus Energiequelle Elektronendonor C-Quelle organo- (keine chemo- (Redoxreaktion, hetero- (Kohlenstoff Mensch anorganischen nicht Licht) nicht aus CO2) Substanzen) chemo- (Redoxreaktion organo- (Glucose hetero- (Kohlenstoff E.coli von Glucose) liefert e-) nicht aus CO2) auto- chemo- (Redoxreaktion litho- (H2 gibt die R. eutropha (Kohlenstoffquelle ist von Wasserstoff) e-) Zusammenfassung CO2) Stoffwechsel umfasst Katabolismus, Anabolismus und Intermediärstoffwechsel ATP, PMF und NAD(P)H sind Energiespeicher, die im Katabolismus generiert Für Klausur die Definitionen können werden für Biosynthesen im Anabolismus Energiereiche Bindungen sind z.B. Säureanhydride (z.B. ATP, PEP), bei deren Hydrolyse freie Energie für den Anabolismus bereitgestellt wird Mikroorganismen haben unterschiedliche Stoffwechseltypen und C-Quellen für den Anabolismus Phototrophe: Nutzung von Lichtenergie als Energiequelle Chemotrophe: Nutzung von Redoxreaktion als Energiequelle Lithotrophe: Nutzung anorganischer Elektronendonoren Organotrophe: Nutzung organischer Elektronendonoren Autotrophie: Nutzung von CO2 für Neusynthese von Zellmaterial VL3 Einführung Stoffwechsel 9 VL3 Einführung Stoffwechsel 10  Heterotrophie: Nutzung organischer C-Quellen für Neusynthese von Zellmaterial &G0 = 2n 7 F 7 &E 0 Redox n = Anzahl der e- Chemotrophe F = Faraday-Konstante 96,5 kJ/V*mol Elektronen von Elektronendonor auf Elektronenakzeptor übertragen &E0 = Differenz der Redoxpotentiale des Redoxpaares Elektronendonor wird oxidiert, Elektronenakzeptor wird reduziert Chemolithotrophe Ralstonia eutropha H2 ist der Elektronendonor, O2 ist der Akzeptor Chemoorganotrophe Beispiel Redoxreaktion mit z.B. Glucose als Donor und Sauerstoff als Akzeptor Ralstonia eutropha Glucose + O2 ³ CO2 + H2 O Redoxreaktion: H2 + 12 O2 ³ H2 O es gehen 2 e- über und die Faraday-Konstante ist 96,5 kJ/V * mol Redoxpotentiale (E 0 ) Redoxpotential 2H+ / H2 = -0,42V um die freiwerdende Energie &G zu berechnen, müssen die Redoxpotentiale E0 12 O2/H2O = +0,82V voneinander abgezogen werden und * Anzahl der Elektronen * Faraday- Konstante &G0 = 2n 7 F 7 &E 0 &E0 berechnen: +0,82 V -(-0,42V) = 1,24 V VL3 Einführung Stoffwechsel 11 VL3 Einführung Stoffwechsel 12  So rechnen, dass ein positiver Wert rauskommt, da ja Energie gewonnen werden soll und &E0 später mit -n multipliziert wird ³ nur so wird &G0 negativ = exergon &G0 = 22 7 96, 5 V 7mol kJ kJ 7 1, 24V = 2239 mol Energie Oder ATP-Synthese durch Elektronentransport-Phosphorylierung Energiespeicherung auch