Tema 2: Aplicación de Técnicas de Tinción y Observación de Microorganismos - ILERNA

Tema 2 Aplicación de técnicas de tinción y observación de microorganismos Profesora: Ariadna Soler Tapia [email protected] CFGS: Laboratorio Clínico y Biomédic...

Tema 2 Aplicación de técnicas de tinción y observación de microorganismos Profesora: Ariadna Soler Tapia [email protected] CFGS: Laboratorio Clínico y Biomédico  Tabla de contenidos 01. Características diferenciales de bacterias, hongos, virus y parásitos 02. Las bacterias: morfología y agrupación. Estructura bacteriana 03. Técnicas de observación microscópica de microorganismos  01. Características diferenciales de bacterias, hongos, virus y parásitos  CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES DE BACTERIAS, HONGOS, VIRUS y PARÁSITOS La Microbiología es la ciencia que estudia los microorganismos. Este grupo lleva más de 3.500 millones de años sobre la Tierra, incluye seres unicelulares, agrupaciones de células y formas acelulares. Está representado en tres de los cinco reinos de la biosfera: el reino moneras, los protoctistas y el reino de los hongos. La única característica que tienen en común todos los microorganismos es su tamaño microscópico. Fue Anton van Leeuwenhoek quien visualiza por primera vez microorganismos con un microscopio (1676) que le permite estudiar pequeños organismos en el agua y en el suelo. Los virus no fueron observados hasta el desarrollo de la microscopía electrónica, en 1952.  CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES DE BACTERIAS, HONGOS, VIRUS y PARÁSITOS La Microbiología surge como ciencia a mediados del siglo XIX. Louis Pasteur, considerado como el padre de esta disciplina, es el primero en relacionar los microorganismos con la aparición de enfermedades en las personas. Pasteur analizó la bacteria causante del ántrax (Bacillus anthracis), desarrolló la primera vacuna contra la rabia y demostró la falsedad de la teoría de la generación espontánea. La taxonomía es la clasificación ordenada y jerárquica. El término se emplea principalmente para designar la taxonomía biológica, es decir, el modo de ordenar los organismos en un sistema de clasificación compuesto por una jerarquía de taxones.  CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES DE BACTERIAS, HONGOS, VIRUS y PARÁSITOS Categorías Sistema binomial taxonómicas de Linneo CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES DE BACTERIAS, HONGOS, VIRUS y PARÁSITOS  CLASIFICACIÓN SEGÚN DOMINIOS Dominio Archaea Dominio Bacteria Dominio Eukarya Son procariotas unicelulares y la mayoría Son evolutivamente más modernos. En este dominio se encuentran los anaerobias. organismos eucariotas. Incluye Tienen gran capacidad adaptativa los siguientes reinos: Son las más antiguas desde el punto de (alcanzan grados de especialización) vista filogenético. Protoctista: en este reino se incluyen los Aerobias, anaerobias y anaerobias protozoos y las algas. Tienen una membrana plasmática sin facultativas (es donde encontramos la ácidos grasos y una pared sin mayor parte de las bacterias). Hongos: en este reino se incluyen los peptidoglicano. hongos que producen setas, los mohos y los Nutrición autótrofa y heterótrofa hongos unicelulares o levaduras. Pueden ser autótrofas o heterótrofas y viven en ambientes extremos. Reproducción por bipartición Animales: se incluyen en este reino a todos los animales. Las hay halófitas y termófilas. Plantas: este reino incluye a todas las plantas.  CLASIFICACIÓN SEGÚN REINOS La clasificación más conocida es la que incluye 5 reinos (1969): planta,animal, hongo, protista, monera. Sin embargo, más adelante han ido apareciendo nuevas clasificaciones para los reinos de los organismos vivos, hasta llegar a la clasificación de 6 e incluso 7 reinos. Actualmente se sigue la clasificación taxonómica del “Catálogo de la vida”: https://www.catalogueoflife.org/ “Classification of living beings” https://www.youtube.com/watch?v=DVouQRAKxYo&ab_chan nel=AmoebaSisters CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES DE BACTERIAS, HONGOS, VIRUS y PARÁSITOS CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES DE BACTERIAS, HONGOS, VIRUS y PARÁSITOS Cuadro comparativo entre bacterias, parásitos, hongos y virus Bacterias Virus Parásitos Hongos Tipo y número Procariotas Eucariotas Eucariotas de células Unicelulares - Uni y pluricelulares Uni y pluricelulares Icosaédrico desnudo Bacilos Icosaédrico envuelto Protozoos Mohos Cocos Morfología Helicoide desnudo Helmintos Levaduras Helicoidales Helicoide envuelto Artrópodos Dimórficos Cocobacilos Complejo CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES DE BACTERIAS, HONGOS, VIRUS y PARÁSITOS Cuadro comparativo entre bacterias, parásitos, hongos y virus Bacterias Virus Parásitos Hongos Capsula Pared celular Pared celular Genoma de ADN Membrana nuclear Plasmolema Pili y/o ARN Nucléolo Mitocondrias Ribosomas Cápside Membrana plasmática Ribosomas Flagelo Estructura Nucleocápside Orgánulos: Núcleo Citoplasma Capsómeros mitocondrias, Nucléolo Mesosoma Pueden o no tener vacuolas, ap. de Membrana nuclear Vacuola envoltura Golgi, citoesqueleto... Dictiosoma Membrana plasmática Retículo endoplasmático Periplasma CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES DE BACTERIAS, HONGOS, VIRUS y PARÁSITOS Cuadro comparativo entre bacterias, parásitos, hongos y virus Bacterias Virus Parásitos Hongos Están presentes en Crecen en entornos terrestres, Están presentes en las células del hábitats acuáticos, materia distintos ambientes Interior o huésped al que muerta, con plantas, animales e Hábitat por ejemplo: agua, la exterior del infectan, las que incluso existen hongos que corteza terrestre, huésped pueden ser vegetales, pueden encontrarse en la piel de desechos radioactivos animales o bacterias las personas Poseen tamaños diversos (por lo El tamaño varía Varían entre 30 Mayormente visibles al Tamaño general entre 0,5 y 5 entre 18-250 nm μm a 2 cm ojo humano μm) Aerobias Aerobia, Anaerobias aunque la Respiración No respiran Mayormente aerobia Facultativas mayoría son Microaerófilas anaerobios CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES DE BACTERIAS, HONGOS, VIRUS y PARÁSITOS Cuadro comparativo entre bacterias, parásitos, hongos y virus Bacterias Virus Parásitos Hongos Sexual Se reproducen en la Sexual Sexual Reproducción Asexual célula infectada Asexual Asexual Son muy Son altamente susceptibles al calor, resistentes a Creen entre 37 y 38 ºC, Temperatura de La Tª óptima aunque algunos Tas extremas pero pero algunos se crecimiento es de 37°C virus tienen buena depende el tipo desarrollan a Tª ambiente termoestabilidad de parásito  TIPOS DE MICROORGANISMOS También podemos clasificar los microorganismos según su relación con el ser humano: Microorganismos patógenos Microorganismos beneficiosos y simbiontes Causan enfermedad Se trata de los organismo de la flora intestinal Bacterias, hongos, protozoos, virus y (microbiota intestinal) o los organismos priones transformadores o fermentadores En ocasiones son oportunistas Participan en procesos del organismo: Ejemplo: - Vibrio cholerae - Cólera Metabolismo de algunos azúcares. - Neisseria meningitidis - meningitis Especialización del sistema inmune. - Candida albicans - Candidiasis Control del crecimiento de las células del - Plasmodium falciparum - Malaria endotelio - Trichomonas vaginalis - Trichomoniasis - Priones - encefalopatía espongiforme Microorganismos saprófitos Obtienen energía de la materia orgánica muerta o de los desechos de otros seres vivos de los cuales extraen compuestos orgánicos que utilizan como nutrientes. Responsables de la descomposición de la materia orgánica permitiendo que las sustancias inorgánicas producidas sean accesibles para los organismos autótrofos. La mayoría de los hongos y numerosas bacterias son saprófitos.  Patogenicidad, virulencia, infectividad, adherencia y toxicidad. Mecanismos de defensa. Infección: cualquier proceso en el que un microorganismo se instala y empieza a crecer en un huésped. La enfermedad infecciosa implica, obligatoriamente, que se dañe al huésped. Contacto con el agente Depende de: FASES DE LA INFECCIÓN (vía de entrada) - La patogenicidad Adherencia a las células - La infectividad (invasión) - La virulencia Producción de toxinas* - La puerta de entrada (bloqueo de las defensas - La resistencia del huésped y disfunción del Sistema - La microbiota normal Inmunitario Defensas del organismo: barreras innatas y respuesta inmunitaria Lee sobre el desarrollo de la infección: https://www.msdmanuals.com/es/hogar/infecciones/biolog%C3%ADa-de-las-enfermedades-infecciosas/desa rrollo-de-la-infecci%C3%B3n?ruleredirectid=756  TOXINAS*: ENDOTOXINAS Y EXOTOXINAS Toxinas: sustancias químicas liberadas por los microorganismos y que pueden dañar a los seres vivos. Exotoxinas: proteínas solubles liberadas al medio por bacterias grampositivas. Estas toxinas son sensibles al calor, muy tóxicas y no producen fiebre. Inducen la formación de anticuerpos específicos en el huésped. Ejemplos: Botulismo (C. Botulinum), Síndrome del Shock Tóxico (Streptococcus pyogenes y staphylococcus aureus), Tétanos (C. Tetani), Carbunco (B. Anthracis),Cólera (V. Cholerae) Endotoxinas: lípidopolisacáridos de membrana producidas por las bacterias gramnegativas. Producen fiebre y sus efectos son generales en el organismo. No son sensibles al calor, no inducen la formación de anticuerpos y presentan una toxicidad baja en comparación con las exotoxinas. Ejemplos: Salmonella, E. Coli, Shigella, Pseudomonas  02. Las bacterias: morfología y agrupación. Estructura bacteriana  Morfología microscópica: individual y MORFOLOGÍA DE LAS BACTERIAS agrupaciones El tamaño de las bacterias suele oscilar entre 0,5 y 5 micras y obliga al empleo de microscopios ópticos junto con técnicas de tinción. En las condiciones adecuadas, las bacterias proliferan por escisión binaria/bipartición, de manera que a partir de una única célula se obtienen millones en unas pocas horas. En muchas especies, las células hijas se separan, de tal forma que al visualizarlas al microscopio sólo se observan células aisladas. En otras, en cambio, las células hijas permanecen unidas, formando de este modo agrupamientos. Principales tipos de agrupamientos bacterianos La agrupaciones cocales se generan durante las divisiones celulares Agrupaciones bacterianas tipo coco Diplococos: Neisseria sp. Tétradas: Microccus sp. Estreptococos (Cadenas): Streptococchus sp. Sarcinas: Sarcina sp. Estafilococos (Racimos): Sarcina sp.  Agrupaciones bacterianas tipo bacilo Cadenas: Bacillus anthracis Empalizada: Corynebacterium sp. Vibrios: Vibrio cholerae Espirilos: Spirllum sp. Espiroquetas: Borrellia sp. MORFOLOGÍA DE LAS BACTERIAS Morfología macroscópica: colonias Colonia bacteriana. Conjunto o agrupación de bacterias crecidas sobre un medio de cultivo sólido, procedentes de una unidad formadora de colonia (UFC). La morfología de una colonia es característica de cada especie bacteriana. Varía en función del medio y evoluciona con el tiempo.  ESTRUCTURA DE LAS BACTERIAS Al contrario que las eucariotas: ausencia de membrana nuclear, de orgánulos membranosos en el citoplasma o de citoesqueleto.  Cápsula La cápsula bacteriana es una capa externa presente en la mayoría de las bacterias patógenas. Mide entre 100 y 400 Å de grosor y no presenta una estructura definida. Está formada por polímeros de glucosa, glucoproteínas, acetilglucosamina y ácidos urónico y glucurónico. Sus funciones son las siguientes: Regular el intercambio de agua, iones y nutrientes con el medio. Ser un reservorio de agua en condiciones de desecación. Facilitar la adherencia a los tejidos del huésped. Dificultar la acción de los anticuerpos, bacteriófagos y células fagocíticas. Favorecer la formación de colonias de aspecto mucoso y liso (biofilm).  Pared bacteriana Estructura rígida (50-100Å) que rodea la membrana plasmática de todas las bacterias (salvo en micoplasmas), da forma y tamaño a la célula. - Mantiene la forma de la bacteria frente a los cambios de presión osmótica. - Regula el paso de moléculas a través de ella. - Protege las bacterias de la acción de los antibióticos una vez que está formada. El componente mayoritario es el peptidoglucano, copolímero formado por N-acetilglucosamina (NAG) y N-acetilmurámico (NAM) Este determina la clasificación mayoritaria: Gram+, Gram- y BAAR Pared Gram + Se denominan bacterias Gram + a aquellas que aparecen de color azul oscuro o violeta en la tinción de Gram. El colorante “cristal violeta” se fija a la pared bacteriana y es resistente a la decoloración por acetona. Bacillus anthracis Incluyen especies tanto móviles como inmóviles con forma de bacilo (Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus y Listeria) o coco (Staphylococcus, Streptococcus) con gruesas paredes celulares; o sin ellas (Mycoplasma). Enterococcus Pared Gram - Se denominan bacterias Gram - a aquellas que aparecen de color rosado en la tinción de Gram. Retienen en colorante “safranina” después de la primera decoloración, con el segundo tinte. Tienen una capa de mureína muy fina, envuelta por una membrana lipídica. Ejemplos: E. Coli, Pseudomonas, Neisseria, Salmonella, Shigella, E Coli Yersinia Salmonella Bacterias Ácido Alcohol Resistentes (BAAR) El peptidoglicano está unido a lípidos (ácidos micólicos), glucolípidos y ceras. Es por eso que tiene carácter hidrófobo y por tanto resistencia a la desecación. Eso marca que no se puedan teñir con colorantes básicos y que, por tanto, no se puedan identificar con la técnica de GRAM. Mycobacterium tuberculosis Para este tipo de bacterias usamos la tinción Ziehl-Neelsen. Ejemplos: Mycobacteria, Nocardia, Clostridium  Micobacterias y Mycoplasmas No son la misma especie, ni siquiera el mismo género Gruesa pared celular con ácidos micólicos (se No tienen pared celular (Se clasifican como clasifican como Gram +) BAAR) Mayor resistencia a los Ab que atacan a la Tamaño mayor (2-10um) y resistencia a síntesis de la pared celular (penicilina) desinfectantes Asociados a infecciones leves y crónicas Asociados a enfermedades crónicas (pneumonía) (tuberculosis)  Membrana plasmática Bicapa fosfolipídica en la que se insertan proteínas (en ↑ proporción que en las eucariotas) - Barrera osmótica y selectiva (semipermeable): Impermeable a moléculas cargadas y permeable a compuestos orgánicos y a moléculas neutras. - Contiene los complejos enzimáticos responsables de la cadena de transporte de electrones y la síntesis de ATP. - Recepción de señales. - Sistema de transporte. - Anclaje del cromosoma bacteriano. - Anclaje de los flagelos.  Citoplasma Estructura gelatinosa formada por el nucleoide y los pequeños orgánulos (ribosomas) Nucleoide Es donde se encuentra el material genético o genoma de las bacterias. - Cromosoma bacteriano: molécula de ADN circular bicatenario que no está rodeado por ninguna membrana. Se encuentra superenrollado y asociado a proteínas no histonas - Plásmidos: moléculas de ADN circular bicatenario más pequeñas que el cromosoma bacteriano. Importante en la ingeniería genética por su uso como vectores de clonación. Se pueden intercambiar mediante la conjugación (aumento de la variabilidad genética) En función de los genes que contengan: Plásmidos de resistencia a antibióticos: contienen genes que codifican proteínas que degradan determinados antibióticos. Plásmidos de virulencia: contienen genes que incrementan la patogenicidad de las bacterias por aumentar su adherencia a los tejidos, sintetizar toxinas, degradar componentes celulares, etc. Plásmidos degradativos: contienen genes que codifican proteínas que degradan o sustancias tóxicas para la bacteria.  Ribosomas El ribosoma es el único orgánulo que es compartido con las células eucariotas. La función de los ribosomas es la síntesis de proteínas. Se encuentran libres en el citoplasma Están formados por ARN ribosómico (ARNr) asociado a proteínas.  Filamento Flagelos (20nm) codo Son apéndices filamentosos extracelulares, largos (20 micras) y helicoidales, responsables del movimiento de la mayor parte de las bacterias móviles. Están formados por una proteína llamada flagelina. Corpúsculo basal En función del nº y su disposición, los flagelos pueden ser: Monótricos: un único flagelo situado en un extremo de la bacteria. Lofótricos: dos o más flagelos, pero todos en el mismo extremo. Anfítricos: varios flagelos en ambos extremos. Perítricos: varios flagelos distribuidos por toda la superficie.  Pilis o fímbrias Estructuras filamentosas más cortas y finas que los flagelos. Insertadas en la membrana plasmática. Participan en el intercambio genético entre bacterias mediante el proceso de conjugación bacteriana. - Pili tienen un diámetro de 10 nm. - Las fimbrias tienen un diámetro de 3 a 7 nm. El número varía de unos pocos a miles y están distribuidos por toda la superficie de la bacteria. La función de las fimbrias es la adhesión a superficies tanto vivas como inertes.  METABOLISMO DE LAS BACTERIAS El metabolismo es el conjunto de reacciones bioquímicas catabólicas (degradación) y anabólicas (síntesis), que transforman las sustancias nutritivas para obtener energía. La transformación de la energía, generación de ATP, puede ser mediante 3 vías principales: - respiración (en presencia de O2 se produce CO2 y H2O), - fermentación (en condiciones anaerobias) - fotosíntesis (absorción de luz visible por la clorofila) Los microorganismos requieren para su desarrollo y actividad celular diversos compuestos denominados nutrientes, los cuales pueden ser macronutrientes (necesarios en grandes cantidades) o micronutrientes (necesarios en pequeñas cantidades) Según los requerimientos de energía y por qué vía se obtengan los nutrientes, clasificamos la mayoría de bacterias en estas categorías: El metabolismo es específico de cada tipo bacteriano y depende de la presencia o ausencia de oxígeno. El ausencia de oxígeno las bacterias obtienen energía a través de la fermentación, que es una reacción redox en la que algunos átomos de la fuente de energía se reducen, mientras otros se oxidan y la energía se produce por fosforilación a nivel de sustrato. ¿Qué tipo de bacterias tienen este metabolismo? En presencia de oxígeno, las bacterias obtienen energía a través de la respiración celular bacteriana, donde metabolizan la glucosa. ¿Qué tipo de bacterias tienen este metabolismo? Proceso Redox Dicho metabolismo, nos proporciona la siguiente clasificación, dependiendo de los requerimientos de O2: Aerobios estrictos: requieren O2 como aceptor terminal de electrones y no proliferan en ambientes anóxicos. Microaerófilos: utilizan O2 a niveles muy bajos. No proliferan en la superficie de un medio sólido. Anaerobios estrictos: los que no emplean O2 para su metabolismo, sino que obtienen su energía de reacciones fermentativas. Anaerobios aerotolerantes: pueden crecer en ausencia/presencia de O2, pero la energía la obtienen por fermentación. Anaerobios facultativos: son bacterias que proliferan mediante procesos oxidativos, utilizando O2 como aceptor terminal de electrones, o en anaerobiosis, empleando reacciones de fermentación para obtener energía  Tema 2 - Actividad 1: Tabla clasificación metabolismo bacteriano Rellena la siguiente tabla con la información pertinente sobre los distintos tipos de bacterias según su requerimiento de O2. Clasificación Características (características del Ejemplos microorganismo y de su tratamiento) Aerobios estrictos Microaerófilos Anaerobios estrictos Anaerobios aerotolerantes Anaerobios facultativos  Clasificación Características (características del Ejemplos microorganismo y de su tratamiento) Aerobios estrictos Contienen enzimas como la superoxido Micrococcus, Pseudomonas, dismutasa y la catalasa (ayudan a Bacillus subtilis neutralizar los radicales libres del O2) Microaerófilos Poca concentración de O2 y suelen Leissteria, Neisseira, necesitar altas concentraciones de Co2. Borrelia, H. Pylori Frasco de vela Anaerobios estrictos O2 es tóxico (no tienen SOD ni Clostridium, Lactobacillus, Catalasa), sólo fermentan Anaerobios aerotolerantes Sólamente fermentan aunque sobreviven Clostridium carnis, C. en O2 Tertium Anaerobios facultativos Alta capacidad de adaptación, E Coli, Staphylococcus, ambivalencia metabólica Streptococcus mutans,  REPRODUCCIÓN/SEXUALIDAD DE LAS BACTERIAS Las bacterias, como organismos procariotas, se reproducen de forma asexual por bipartición, pues en estos organismos no se puede hablar en sentido estricto de reproducción sexual porque no forman gametos, ni estos se fusionan en un zigoto. Dentro de ellas tenemos varios sistemas: Fisión binaria o bipartición Se entiende reproducción siempre que haya una célula hija, es decir, que el ADN se duplique y se forme una célula nueva Esporulación Conjugación Si no se produce una célula nueva, sino que sólo se comparte material genético, se Transducción denomina PARAsexualidad bacteriana Transformación  Fisión/Escisión binaria Es un tipo de reproducción que permite formar colonias homogéneas de bacterias. En condiciones ideales ocurre con mucha rapidez. Se trata de un proceso que incluye los siguientes pasos: 1. Replicación del ADN. 2. La célula bacteriana crece y las copias bacterianas se separan. 3. Se forma nueva membrana plasmática. 4. La bacteria se divide en dos. Replicación del ADN bacteriano: https://www.youtube.com/watch?v=jmWuju1S9_E&ab_channel=RyanAbbott  Conjugación Es un proceso que se lleva a cabo si la célula donadora presenta el plásmido F, que contiene la información genética para la formación de los pili sexuales, los cuales constituyen puentes que sirven de unión citoplasmática entre dos bacterias. La célula que presenta el plásmido se denomina F+ y la célula que no lo contiene se llama F-. La bacteria F+ (donadora de información) se una a una bacteria F- (receptora) mediante uno de sus pili. A través de él introduce una hebra del plásmido F, de forma que la bacteria F- se convierte en bacteria F+.  Transducción La transducción es la transferencia de material genético de una bacteria a otra a través de un bacteriófago. El proceso es el siguiente: 1. El ADN de un fago penetra la célula bacteriana. 2. El ADN del fago se integra en la célula huésped como profago. 3. El ADN es degradado y se producen nuevos fagos que contienen algo de ADN bacteriano. 4. La célula se rompe y libera muchos fagos que infectan a otras células. 5. Un fago infecta una nueva célula huésped. 6. Los genes introducidos a la nueva célula huésped se integren en el ADN y se duplican junto a él.  Transformación La transformación es el proceso por el cual, fragmentos de ADN de una célula bacteriana desintegrada dispersos en el medio donde vive, son captados por otra célula bacteriana.  Esporulación Característica de algunas GRAM+ Se produce cuando las condiciones son poco favorables para la célula (desecación, altas temperaturas, pocos nutrientes…). Las endosporas pueden permanecer así durante mucho tiempo hasta que las condiciones sean favorables. 1. Replicación del DNA 2. Formación del septum (invaginación de la membrana y formación de la forespora (compuesta por peptidoglicano) 3. Formación de la capa externa de la endospora 4. Fragmentación del ADN no endospórico CRECIMIENTO DE LAS BACTERIAS Curva de crecimiento bacteriano La curva de crecimiento bacteriano varía en función del tipo de organismo y de las condiciones de cultivo. Todas tienen en común estas 4 fases: - Latencia - Exponencial - Estacionaria - Muerte  CRECIMIENTO DE LAS BACTERIAS 1. Fase de latencia: Es una fase de adaptación. El crecimiento de la población no inicia inmediatamente, sino después de cierto periodo de tiempo, el cual puede ser breve o largo, dependiendo de varios factores. 2. Fase de crecimiento exponencial: Crecimiento rápido de las células hasta que existan factores limitantes. Las bacterias se encuentran en un estado óptimo, aunque su velocidad está influenciada por temperatura y nutrientes. 3. Fase estacionaria: el medio de cultivo no se renueva, por lo que comienzan a acumularse metabolitos tóxicos, se modifica el pH, los nutrientes se agotan, la velocidad de multiplicación se retrasa y hay un equilibrio entre bacterias vivas y muertas. 4. Fase de muerte: cuando continúa el crecimiento en el medio de cultivo viejo se produce una inversión numérica con respecto a la fase exponencial. En este periodo son más las bacterias muertas que las vivas, hasta que se termina con la muerte de todas. Si son bacterias con capacidad de esporular, se produce la esporulación en esta fase.  03. Técnicas de observación  TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN Técnicas de observación en fresco Estas son técnicas rápidas que permiten visualizar microorganismos vivos sin el uso de colorantes. En la práctica está restringida al estudio de cultivos en medios líquidos para comprobar si existe movimiento bacteriano. También se puede considerar la observación en fresco usando colorantes vitales (no penetrantes), que ofrecen imágenes en negativo. Método de observación en fresco Método gota pendiente https://www.youtube.com/watch?v=W5T66qe6vxY&t=106s&ab_channel=CF  Preparaciones fijadas PROTOCOLO DE FIJACIÓN Y TINCIÓN Extensión de la muestra Fijación de la Tinción Lavado y Microscopio sobre un portaobjetos muestra secado Cultivo líquido: Doble función: Se realiza con Los protocolos de Comenzamos con introducimos el asa de preservar la colorantes y tinción suelen aumentos pequeños, siembra en el cultivo y estructura y siguiendo un finalizar con un hasta llegar al 100x extendemos en el morfología celular, y protocolo específico. (inmersión). lavado para porta. adherir al eliminar el exceso Colonia: recogemos portaobjetos de colorante. masa celular con un asa Se consigue y o se extiende sobre el mediante la A continuación porta, o bien se extiende desnaturalización se deja secar a sobre una gota de agua de las proteínas Tª ambiente. estéril. por: calor o con Muestra biológica: si es fijadores químicos un fluido se procesa igual (alcoholes, que el cultivo líquido; si se acetonas). ha recogido con una torunda la extensión se realiza con esta misma.  Generalidades de las tinciones Las tinciones son procedimientos que necesitan del uso de colorantes, con el fin de aumentar el contraste entre las células y su entorno para que sean observadas en el microscopio. Estas tinciones se realizan a partir de suspensiones celulares extendidas en un portaobjetos (frotis), que son secadas y fijadas. La mayor parte de las tinciones son cromogénicas → COLORANTES, que poseen grupos cromóforos (color) con afinidad por distintos tipos de estructuras celulares, a las que tiñen (colorean).  Tienen carga -, por lo que se unen a componentes y estructuras de carga + (proteínas y citoplasma). Ácidos o Ej.: rojo congo, eosina… aniónicos Mordiente → potencian la unión del colorante a una Tienen carga + por lo que se utilizan para teñir componentes y estructuras ligeramente ácidas o estructura concreta, bien con carga – (á. nucleicos y pared celular). porque aumentan la afinidad Básicos o Ej.: Cristal violeta, azul de metileno, verde malaquita, safranina, hematoxilina… catiónicos por el colorante, bien porque fijan el colorante unido a la estructura. Son sales de colorantes básicos y ácidos, por lo que tiñen todo tipo de estructuras. Neutros o Ej.: Eosinato de azul de metileno anfóteros  Indican forma de las células, densidad de estas, agrupamientos celulares etc. Simple → un colorante, los microorganismos se tiñen por igual. Ej.: safranina (tiñe componentes ácidos), azul de metileno Negativa → un colorante que tiñe el medio y no las células. Ej: Tinción de nigrosina Tipos de Ej.: Nigrosina, repelido por la pared tinción Diferencial → dos colorantes que permiten diferenciar tipos de especies microbianas. Ej.: tinción de Gram; Tinción de Ziehl Neelsen Específica → Diseñadas para teñir estructuras celulares concretas como las esporas, los flagelos o las cápsulas  Tinción de esporas Tinción simple Tinción negativa tinción Schaeffer-Fulton Tinción de Gram que permite diferenciar entre bacterias Gram + (moradas) y Gram – (rosas)  Tinción de Gram La tinción de Gram se desarrolla en 3 fases Tinción con Decoloración Coloración de colorante catiónico Se utiliza etanol, capaz contraste de disolver la membrana Tiñe la pared de las Capaz de unirse externa de los Gram - y bacterias Gram -, con el a la pared bact. extraer el colorante. fin de poder observarlas La pared Gram + es al microscopio. resistente a la decoloración.  Tinción de Gram Busca y desarrolla el protocolo para la tinción de GRAM Tinción de Gram TINCION DE GRAM - YouTube Tinción de Ziehl-Neelsen: observación bact. ácido-alcohol resistentes La tinción de Ziehl-Neelsen se desarrolla en 3 fases Tinción en caliente Decoloración en frío Coloración de con colorante con una mezcla contraste básico (fucsina ácido-alcohol El azul de metileno es fenicada) El frío hace que los ácidos micólicos incapaz de penetrar en y las ceras solidifiquen, atrapando el las bacterias El calor fluidifica la colorante. En el resto de bacterias, el colorante es eliminado por la ácido-alcohol resistentes, pared, permitiendo el mezcla ácido-alcohol. mientras que en el resto paso del colorante. sí.  Tinción de Ziehl-Neelsen: observación bact. ácido-alcohol resistentes (BAAR) Usada principalmente para la detección de Mycobacterium Tuberculosis Busca y desarrolla el protocolo para la tinción de Ziehl Neelsen  TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN Tinción de Ziehl-Neelsen: observación bact. ácido-alcohol resistentes TINCION ZIEHL NEELSEN - YouTube  Tinciones fluorescentes Constituyen una alternativa a las tinciones cromogénicas y se han desarrollado para intentar conseguir una mayor sensibilidad, observar partes específicas y diferenciar entre componentes celulares. Pueden ser de dos clases: Se basa en el uso de colorantes fluorescentes (fluoróforos) que se unen a determinados componentes. Directas Ej.: naranja de acridina se une a los ácidos nucleicos y se utiliza cuando se sospecha una baja carga bacteriana o con bacterias que se tiñen mal. Se basa en el uso de anticuerpos marcados con fluoróforos y permiten Indirectas detectar antígenos concretos de bacterias.  Técnicas de observación bacteriana con microscopía electrónica Estas técnicas están relegadas principalmente a la investigación y a ciertos casos puntuales, como la determinación de un patógeno desconocido. Detección de VIH en muestras (MET/MEB)  Errores en la tinción Existen muchos factores que pueden alterar los resultados en toda técnica de tinción (muchos de ellos se pueden evitar con teñidores automáticos): Pureza del colorante: a mayor grado de impurezas, mayor error y menor calidad en la tinción. Concentración del colorante: las cantidades ideales se mueven entre el 0,2 y 2%. pH del colorante: este factor hace que el colorante se fije o no a las estructuras del microorganismo, permitiendo distinguir unos gérmenes de otros, si es demasiado rosa puede ser por un pH bajo y si es demasiado azul por un pH alto. Conservación del colorante: se mantendrá siempre en lugares frescos, secos y oscuros, con su envase correspondiente y su etiqueta. Técnica empleada: a la hora de realizar una tinción se tendrá máximo cuidado en que los portaobjetos y sus cubreobjetos están siempre limpios y desengrasados puesto que pueden aparecer artefactos y/o precipitados en la extensión, no se mezclarán los colorantes, etc. Cantidad de la muestra: deberá ser representativa y homogénea pero no muy extensa. Realización correcta del frotis: si se pretende visualizar una muestra se fijará previamente, generalmente con calor. Si no se hace este paso los gérmenes no quedan adheridos al portaobjetos y a la hora de añadir colorantes mordientes los microorganismos son arrastrados y no se podrán ver. Tiempos de tinción: es importante que todos los colorantes usados se mantengan en la preparación un tiempo preciso, variable según la tinción, generalmente entre 1 y 10 minutos. Tema 2 - Actividad 2: Informe de prácticas: Tinción de gram, tinción Ziehl Neelsen  Tema 2 Aplicación de técnicas de tinción y observación de microorganismos Profesora: Ariadna Soler Tapia [email protected] CFGS: Laboratorio Clínico y Biomédico